謝 婷，虞子寧，張慧娟，黃志華，曾 靖，江麗霞

(贛南醫(yī)學(xué)院 1.2019級碩士研究生；2.第一附屬醫(yī)院；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；4.科研處，江西 贛州 341000)

腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury，I/R)是指腦缺血一定時間恢復(fù)血液供應(yīng)后，其腦機(jī)能功能不但未能恢復(fù)，卻出現(xiàn)了更加嚴(yán)重的腦機(jī)能障礙，稱之為腦缺血再灌注損傷，具有極高的致死率和致殘率。腦缺血再灌注雖然可以恢復(fù)血液流動和氧氣供應(yīng)以及許多其他能量物質(zhì)，但這一過程也可以通過不同的機(jī)制，如自由基的釋放、炎癥級聯(lián)反應(yīng)的激活、細(xì)胞凋亡增加、鈣超載和興奮性氨基酸釋放，加重缺血引起的原有腦損傷，有進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞壞死和神經(jīng)損傷的風(fēng)險[1]。研究表明，腦缺血再灌注損傷可導(dǎo)致血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)破壞，從而導(dǎo)致高灌注后的水腫和出血性轉(zhuǎn)化[2]，是腦缺血再灌注損傷的重要原因。

緊密連接蛋白(tight junctions protein，TJPs)是構(gòu)成細(xì)胞間屏障的重要組成部分，其中ZO-1及Occludin(OCLN)在維持血腦屏障中發(fā)揮著重要作用，可以減輕腦缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的血腦屏障破壞。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一種蛋白水解酶，可以破壞細(xì)胞外基質(zhì)，其中MMP-3和MMP-9可以促進(jìn)腦缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的血腦屏障破壞。因此，ZO-1、OCLN、MMP-3及MMP-9等指標(biāo)在腦缺血再灌注損傷中具有重要意義。3'-大豆苷元磺酸鈉(3'-daidzein sulfonate sodium，DSS)是中藥葛根中主要有效成分大豆苷元進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和改性后新合成的強(qiáng)水溶性物質(zhì)。研究表明DSS對腦缺血再灌注損傷有較好的神經(jīng)保護(hù)作用[3]。但DSS對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用與基質(zhì)金屬蛋白酶和緊密連接蛋白的影響報道較少。為探討DSS抗腦缺血再灌注損傷的藥理機(jī)制，本文將從其對MMP-3、MMP-9及ZO-1、OCLN mRNA表達(dá)的影響，進(jìn)一步了解它在腦缺血再灌注損傷中的作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物DSS(C15H9O7SNa)由沈陽藥科大學(xué)天然藥物化學(xué)研究室提供，純度99%以上，實驗前用雙蒸餾水稀釋至所需濃度。

1.1.2主要儀器與試劑Lightcycler 480 Ⅱ Real-Time PCR System(Roche)；All-in-OneTMqPCR Mix：Gene Copoeia(Cat.No.AOPR-0200)；All-in-OneTMqPCR Primer(Gene Copoeia)。

1.1.3實驗動物SD雄性大鼠，SPF 級，體重250～280 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司。動物許可證號SCXK(湘)2011-003，合格證號：NO.4304701590。適應(yīng)性飼養(yǎng)5天后開始進(jìn)行實驗。本研究經(jīng)贛南醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.2實驗方法

1.2.1實驗分組與大鼠腦缺血/再灌注損傷模型的制備將SD大鼠隨機(jī)分成3組：假手術(shù)組(Sham組)、腦缺血再灌注損傷模型組(I/R組)、DSS治療組(I/R+DSS組)，每組6只。10%水合氯醛麻醉大鼠，參照LONGA等[4]方法建立大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)腦缺血再灌注模型，缺血120 min后再灌注24 h。術(shù)中嚴(yán)格控制室溫在23 ℃～25 ℃。藥物治療組于缺血后10 min分別從舌下靜脈注射 2.0 mg·kg-1的DSS，假手術(shù)組和模型組給予同體積的生理鹽水。

1.2.2RT-PCR檢測MMP-3、MMP-9、ZO-1及OCLNmRNA的表達(dá)再灌注24 h后，10%水合氯醛麻醉大鼠，處死大鼠，取缺血半暗帶區(qū)10～20 mg腦組織制成10%的組織勻漿，RT-PCR檢測MMP-3、MMP-9、ZO-1及OCLN mRNA的表達(dá)，引物見表1。

表1 β-actin、MMP-3、MMP-9、ZO-1及OCLN的特異性引物設(shè)計

1.3統(tǒng)計學(xué)方法運用Prism 4.0 統(tǒng)計軟件，對各組之間進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1DSS對腦缺血再灌注后腦組織中MMP-3mRNA表達(dá)的影響與假手術(shù)組相比，模型組MMP-3 mRNA表達(dá)水平明顯升高；與模型組相比，DSS治療組MMP-3 mRNA的表達(dá)水平明顯降低，提示腦缺血再灌注后腦組織中MMP-3的表達(dá)水平顯著升高，而DSS治療可降低腦缺血再灌注后腦組織中MMP-3的表達(dá)水平(見圖1)。

2.2DSS對腦缺血再灌注后腦組織中MMP-9mRNA表達(dá)的影響與假手術(shù)組相比，模型組MMP-9 mRNA表達(dá)水平顯著升高；與模型組相比，DSS治療組MMP-9 mRNA的表達(dá)水平顯著降低，提示腦缺血再灌注后腦組織中MMP-9的表達(dá)水平顯著升高，而DSS治療可降低腦缺血再灌注后腦組織中MMP-9的表達(dá)水平(見圖2)。

圖1 DSS對腦缺血再灌注損傷后MMP-3 mRNA表達(dá)的影響

注：與Sham組相比，**P<0.01；與I/R組相比，

#P<0.05；F值為10.74。

圖2 DSS對腦缺血再灌注損傷后MMP-9 mRNA表達(dá)的影響

注：與Sham組相比，***P<0.001；與I/R組相比，

###P<0.001；F值為44.85。

2.3DSS對腦缺血再灌注后腦組織中ZO-1mRNA表達(dá)的影響與假手術(shù)組相比，模型組ZO-1 mRNA表達(dá)水平明顯降低；與模型組相比，DSS治療組ZO-1 mRNA的表達(dá)水平明顯升高，提示腦缺血再灌注后腦組織中ZO-1的表達(dá)水平明顯降低，而DSS治療后可提高腦缺血再灌注后腦組織中ZO-1的表達(dá)水平(見圖3)。

2.4DSS對腦缺血再灌注損傷后腦組織中OCLNmRNA表達(dá)的影響與假手術(shù)組相比，模型組OCLN mRNA 表達(dá)水平明顯降低；與模型組相比，DSS治療組OCLN mRNA的表達(dá)水平明顯升高，提示腦缺血再灌注后腦組織中OCLN的表達(dá)水平明顯降低，而DSS治療后可提高腦缺血再灌注后腦組織中OCLN的表達(dá)水平(見圖4)。

圖3 DSS對腦缺血再灌注損傷后ZO-1 mRNA表達(dá)的影響

注：與Sham組相比，*P<0.05；與I/R組相比，#P<0.05；F值為4.865。

圖4 DSS對腦缺血再灌注損傷后OCLN mRNA表達(dá)的影響

注：與Sham組相比，*P<0.05；與I/R組相比，#P<0.05；F值為7.744。

3 討 論

腦缺血再灌注損傷是一個復(fù)雜的過程，涉及不同的病理生理級聯(lián)反應(yīng)，包括氧化應(yīng)激、興奮性氨基酸毒性、線粒體腫脹、鈣超載、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡等[5]，常伴隨著血腦屏障的損壞，導(dǎo)致腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡。血腦屏障主要由內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞末端等神經(jīng)血管單位組成，是一種動態(tài)的、高度選擇性的屏障，調(diào)節(jié)各種分子從血液進(jìn)入腦實質(zhì)，限制某些血漿成分、血細(xì)胞和白細(xì)胞進(jìn)入大腦，當(dāng)這些限制性物質(zhì)由于神經(jīng)退變過程或神經(jīng)炎癥而滲入腦實質(zhì)時，就會產(chǎn)生神經(jīng)毒性物質(zhì)，導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙和喪失，因此血腦屏障在維持嚴(yán)格的神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)方面起著至關(guān)重要的作用[6-8]。

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接(tight junctions，TJ)限制了親水性分子和大分子跨血腦屏障的細(xì)胞旁流量，包括葡萄糖和氨基酸在內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)通過特定的膜轉(zhuǎn)運蛋白進(jìn)入大腦[9]。緊密連接不僅僅是一種簡單的細(xì)胞-細(xì)胞屏障，它還表現(xiàn)出離子和大小的選擇性，因此可作為一種可調(diào)節(jié)的滲透性屏障，阻止水、溶質(zhì)和免疫細(xì)胞自由通過細(xì)胞旁途徑。ZO-1和OCLN是緊密連接蛋白的兩個重要成分，可以維持腸道黏膜上皮屏障的完整性[10]和增加腎小管上皮細(xì)胞緊密連接的粘附強(qiáng)度[11]，研究還發(fā)現(xiàn)它們在腦組織中也存在表達(dá)，并在維持和改善血腦屏障中發(fā)揮重要作用[12-13]。

基質(zhì)金屬蛋白酶是以酶原形式分泌的蛋白水解酶，能夠破壞細(xì)胞外基質(zhì)，介導(dǎo)缺血性腦損傷[14]。MMP-3和MMP-9是促進(jìn)腦缺血再灌注損傷的兩種基質(zhì)金屬蛋白酶，在生理和病理生理條件下參與細(xì)胞外基質(zhì)的重塑，在腦缺血再灌注損傷中起著重要作用，再灌注期間，化學(xué)信號觸發(fā)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，隨后產(chǎn)生的中性粒細(xì)胞衍生的氧化劑和基質(zhì)金屬蛋白酶導(dǎo)致血腦屏障損害[15]。有研究表明，MMP-9在腦缺血后處于活化狀態(tài)，并伴有明顯的血腦屏障通透性改變，而使用MMP-9天然抑制劑TIMP-Ⅰ后可減輕局灶性腦缺血后血腦屏障的破壞[16]。凋亡神經(jīng)元釋放的MMP-3可以作用于緊密連接蛋白，降解基膜中的細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合物，并激活小膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加速血腦屏障的破壞，而MMP-3基因的缺失會減輕血腦屏障的損害及神經(jīng)元的退化[17]。

研究發(fā)現(xiàn)，DSS可通過改善線粒體功能[18]、減輕海馬損傷和記憶障礙[19]、抑制炎癥反應(yīng)[20]及神經(jīng)元凋亡[21]從而減輕腦缺血再灌注損傷。本文實驗結(jié)果顯示，腦缺血再灌注后，大鼠腦組織中MMP-3和MMP-9 mRNA的表達(dá)水平明顯升高，ZO-1和OCLN mRNA的表達(dá)水平明顯降低，而使用DSS治療后，MMP-3和MMP-9 mRNA的表達(dá)水平明顯降低，ZO-1和OCLN mRNA的表達(dá)水平明顯增強(qiáng)，提示DSS可通過抑制MMP-3和MMP-9 mRNA的表達(dá)，促進(jìn)ZO-1和OCLN mRNA的表達(dá)，從而降低基質(zhì)金屬蛋白酶對大腦細(xì)胞外基質(zhì)的降解，維持神經(jīng)元細(xì)胞間的緊密連接，對血腦屏障的完整性起保護(hù)作用，減輕腦缺血再灌注后的腦損傷，為DSS應(yīng)用于腦缺血再灌注后的治療提供了實驗依據(jù)。