吳 軍， 馬 影， 張俊輝

(1.四川大學生命科學學院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室, 成都 610065；2.清華大學醫(yī)院管理研究院， 北京 518055)

麻瘋樹(JatrophacurcasL.)屬大戟科(Euphorbiaceae)麻瘋樹屬落葉小喬木或灌木，高2～7 m，耐干旱貧瘠，在熱帶、亞熱帶及干熱河谷區(qū)有分布[1-2]。麻瘋樹種子含油率高，在生物燃油、新藥開發(fā)、洗滌用品、飼料及荒山治理等方面有著重要的應用前景[3-5]。

麻瘋樹雌雄同株，花單性[2,6]，主要靠螞蟻、蜜蜂及蒼蠅等昆蟲傳粉[7-8]，通過改善麻瘋樹發(fā)育和傳粉可提高果實數量[9-11]。有研究顯示，麻瘋樹雌花約有50%結果[12]，通過自然雜交試驗、人工自交和人工雜交測定的結實率依次為76.42%、87.93%和86.66%，說明麻瘋樹是自交可育并偏向于異交[13]。麻瘋樹存在胚珠敗育的現(xiàn)象，胚珠和種子的比例為3∶(2～2.8)[12-13]，進而導致結實率下降，影響種子產量。這些情況與受精過程密切有關，花粉粒的萌發(fā)與花粉管的伸長是正常受精的重要環(huán)節(jié)，而目前有關麻瘋樹受精過程及花粉管生長發(fā)育等方面的報道較少。

植物授粉時，落在柱頭上的花粉粒經過粘附、識別、水合、萌發(fā)形成花粉管，然后花粉管在花柱和子房內伸長，進而完成受精作用。有研究表明，花粉管的生長集中在花粉管尖端[19]。此外，花粉管通道轉化法是國內外利用生物技術育種的重要手段，已在棉花、玉米、小麥等植物上獲得成功[14-16]。本研究通過探索麻瘋樹花粉管萌發(fā)的過程，為了解麻瘋樹結實情況和建立花粉管通道介導的麻瘋樹轉基因技術體系奠定基礎。

花粉管經水溶性苯胺藍染色后，花粉管產生的胼胝質在紫外光激發(fā)下產生熒光，可利用熒光顯微鏡對花粉管的有關性狀進行觀察[17]。該方法已用于水稻、擬南芥等植物花粉管生長過程的觀察[18-19]。本研究采用苯胺藍染色法觀察麻瘋樹受精后花粉管的萌發(fā)及生長過程，探索NaOH溶液和冬青油對麻瘋樹雌蕊組織的軟化透明效果。

1 材料和方法

1.1 材 料

實驗材料為2013年種植于四川大學生命科學學院溫室的麻瘋樹，溫度25～28 ℃，光照5 000～8 000 lx。

1.2 取材及固定

麻瘋樹雌花臨近開放時進行套袋隔離，09：00時左右，選取已開放的雌花進行人工授粉。分別在授粉1，1.5，2，2.5，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15 h后(共17個時間段)取樣并編號，每個時間段取3個樣本；另外，設計并采集授粉5 h后的雌花30份，用于確定較好的軟化透明方法。樣本用FAA固定液固定，放入4 ℃冰箱中備用。

1.3 組織軟化方法

1.3.1NaOH軟化

將備好的材料從FAA固定液中取出，經50%，30%，15%乙醇和蒸餾水逐級覆水，每次30 min；再將材料置入不同濃度的NaOH溶液，放入50 ℃恒溫箱內進行軟化處理。NaOH濃度分別設1，2，3，4 mol·L-1等4個濃度，每個濃度設1，2，3，4 h 4個軟化時間以確定較優(yōu)的軟化方法。

1.3.2冬青油軟化

將固定液處理的雌蕊取出，依次放入70%，85%，90%，100%，100%的乙醇中，每次2 h；再依次放入1/2乙醇+1/2冬青油、冬青油中，每次2 h；再將冬青油處理后的花柱采取以下3種處理方法： 1) 冬青油處理后不復水直接用苯胺藍染色； 2) 冬青油處理后經梯度酒精到蒸餾水復水后再用苯胺藍染色； 3) 冬青油處理后經梯度酒精到蒸餾水，再經2 mol·L-1NaOH處理4 h后，再用苯胺藍染色。

1.4 花粉管生長過程的觀察

在解剖鏡下分離花柱和子房，并對子房徒手切片，之后采用NaOH溶液軟化、透明。NaOH處理后的材料用蒸餾水沖洗3次，每次5 min，再用pH為8.2磷酸鹽緩沖液預處理1 h，最后根據Kho等[17]的方法以0.1%苯胺藍進行染色。在Olympus熒光顯微鏡下(紫外激發(fā)，阻擋濾光片為475 nm)對染色后的材料進行觀察和拍照，通過花粉管的清晰程度確定較好的處理方式和時間，并分析不同材料中花粉管的分布狀態(tài)以確定花粉管的生長情況。

2 結果與分析

2.1 花的相關形態(tài)結構

為了便于研究花組織的軟化透明和觀察花粉管的生長，本研究對麻瘋樹花相關形態(tài)結構進行了分析。結果顯示，麻瘋樹單性花，雌雄同株(圖1 A,B,D)，花的結構便于進行昆蟲傳粉，花粉粒表面具有齒輪形凸起(圖1 C)，可以牢固附著在柱頭上(圖1 E)，柱頭3個，2裂，花柱較短(圖1 D)，子房三室，每室著生1個胚珠，自然環(huán)境下部分胚珠不能正常發(fā)育(圖1 F)。

2.2 NaOH軟化濃度和時間的確定

將授粉5 h的麻瘋樹柱頭放入不同濃度NaOH進行不同時長的軟化處理。結果表明，沒經過NaOH軟化的材料透明度不夠，經0.1%的苯胺藍染色，紫外激發(fā)后，基本看不見熒光，不利于花粉管萌發(fā)的觀察(圖2 A 1,A 2)。本研究中，使用1 mol·L-1NaOH 軟化處理時長為4 h和5 h的2個處理(圖2 B 1,B 2;C 1,C 2)，或者用2 mol·L-1NaOH 軟化時長為3 h和4 h的2個處理(圖2 D 1,D 2;E 1,E 2)，或者用3 mol·L-1NaOH軟化1 h(圖2 F 1,F 2)，再用苯胺藍染色，在紫外光激發(fā)下可觀察到熒光；其中采用2 mol·L-1NaOH處理3 h或4 h效果較好。用1 mol·L-1NaOH軟化1 h或3 h的處理，紫外光激發(fā)后熒光幾乎不可見。而使用3 mol·L-1NaOH軟化2 h或4 h的處理和4 mol·L-1NaOH軟化1 h或4 h的處理，由于NaOH濃度高，導致軟化過度，材料基本解離，不便于觀察，且不易掌控。

注：A 1,A 2為同一樣本；B 1,B 2及F 1,F 2為同一樣本；A 1,B 1,C 1,D 1,E 1,F 1為10×10倍白光觀察，A 2,B 2,C 2,D 2,E 2,F 2為10×40倍紫外光激發(fā)觀察；A 1,A 2沒經過NaOH溶液軟化處理,B 1,B 2使用1 mol·L-1 NaOH處理4 h;C 1,C 2使用1 mol·L-1 NaOH處理4 h;D 1,D 2使用2 mol·L-1 NaOH處理3 h;E 1,E 2經2 mol·L-1 NaOH處理4 h;F 1,F 2經3 mol·L-1 NaOH處理1 h。圖2 NaOH溶液處理和苯胺藍染色的麻瘋樹花柱觀察

注：A為冬青油處理后不復水直接用苯胺藍染色的麻瘋樹花柱；B為冬青油處理后經梯度酒精到蒸餾水復水后再用苯胺藍染色的麻瘋樹花柱；C為冬青油處理后經梯度酒精到蒸餾水，再經2 mol·L-1NaOH處理3 h后，再用苯胺藍染色的麻瘋樹花柱，箭頭示熒光；A,B 10×40倍鏡，C 10×10倍鏡。圖3 冬青油處理麻瘋樹雌蕊組織的透明效果

注：A為經過NaOH軟化、苯胺藍染色的未受精的花柱(紫外光激發(fā)后無熒光)；B為授粉2 h后的柱頭；C為授粉3 h后花粉管生長情況；D為授粉4 h后花粉管生長情況；E為柱頭上具有2個熒光點的花粉粒；F為在生理鹽水萌發(fā)30 min后，用稀醋酸洋紅溶液染色的麻瘋樹花粉粒(箭頭示熒光或存在多個萌發(fā)管；A 10×10倍鏡，B,C,D 10×40倍鏡，E,F 10×100倍鏡。圖4 麻瘋樹花粉的萌發(fā)

2.3 冬青油軟化結果

授粉5 h后的麻瘋樹花柱，經過冬青油處理不復水直接染色，被染成了藍色，沒有觀察到發(fā)射熒光的花粉管(圖3 A)；經過冬青油處理后復水再染色，花柱被染成了紅色，也沒有觀察到發(fā)熒光的花粉管(圖3 B)；冬青油處理后經梯度酒精到蒸餾水，再使用2 mol·L-1NaOH處理3 h后進行苯胺藍染色，可觀察到發(fā)熒光的花粉管(圖3 C)，但效果與只用NaOH溶液軟化類似。因此，在本研究中冬青油既不能代替NaOH軟化透明麻瘋樹雌蕊組織，也不能增加透明效果。

2.4 柱頭上花粉管萌發(fā)情況的觀察

受精后的麻瘋樹柱頭經過2 mol·L-1NaOH軟化3 h，0.1%的苯胺藍染色，再利用熒光顯微鏡紫外激發(fā)觀察。結果表明，柱頭上的花粉在授粉2 h后開始萌發(fā)(圖4 A,B)，萌發(fā)的花粉隨著時間的延長而增多，4 h后柱頭上的花粉已全部萌發(fā)(圖4 C,D)。研究中觀察到有些麻瘋樹花粉粒長出2條或者多條花粉管，這有可能跟麻瘋樹有多個萌發(fā)孔有關(圖4 E,F)，但最終1個花粉粒上只能有1根花粉管能夠伸長并通過花柱。

2.5 花柱中花粉管生長觀察

麻瘋樹花柱經過2 mol·L-1NaOH軟化3 h，0.1%的苯胺藍染色后，再使用熒光顯微鏡紫外光激發(fā)觀察，可以清楚看到花粉管的生長路徑。麻瘋樹花粉管在花柱中呈曲線生長(圖5 A)；授粉10 h后，花粉管已經生長到花柱的基部(圖5 B,C)，此時觀察到柱頭上一些花粉的花粉管頂端膨大而停止生長或者花粉管保持短小狀態(tài)而停止生長(圖6 A)；授粉第11 h，子房內開始出現(xiàn)帶有熒光的花粉管(圖5 D)；11 h后，子房內的花粉管逐漸增多(圖5 E)；15 h后子房內充滿了大量的花粉管，少數花粉管通向胚珠(圖5 F)。

注：A為授粉5～9 h的萌發(fā)情況；B為授粉第10小時花柱縱切；C為授粉第10小時花柱基部橫切；D為授粉第11～12小時，子房內開始出現(xiàn)少量帶有熒光的花粉管；E為授粉第13小時子房出現(xiàn)的帶有熒光的花粉管；F為授粉第14小時，子房內開始出現(xiàn)大量帶有熒光的花粉管，箭頭表示通向胚珠花粉管；A,C,F 10×10倍鏡，B,D,E 10×40倍鏡。圖5 麻瘋樹花粉管的伸長

注：A為示生長受抑制的花粉管，10×40倍；B為花柱中花粉管熒光開始減弱；箭頭表示胼胝質塞的出現(xiàn)，10×10倍。

從授粉后10 h開始，觀察發(fā)現(xiàn)花柱中花粉管熒光開始減弱，花粉管中可見到大量的均勻分布、間斷出現(xiàn)的熒光胼胝質塞(圖6 B)，胼胝質塞將花粉管內腔堵死，它的存在使花粉管腔成為一個不連續(xù)的系統(tǒng)，可以阻止花粉管內的物質倒流。

3 討 論

對麻瘋樹雌蕊進行透明處理時，采用NaOH溶液較冬青油效果好。NaOH溶液濃度越高，所需軟化處理時間越短，但使用3 mol·L-1以上NaOH溶液時，麻瘋樹雌蕊材料容易被過度軟化而不便觀察，是否可以通過縮短處理時間獲得較好的軟化透明效果有待進一步研究；使用1 mol·L-1NaOH溶液卻需要較長處理時間。因此，采用2 mol·L-1NaOH溶液對麻瘋樹雌蕊組織進行透明處理比較適宜。

研究發(fā)現(xiàn)，授粉后出現(xiàn)花粉管尖端膨大而生長受阻的現(xiàn)象，推測是大量花粉管生長競爭的結果[20]；花柱上存在一種能夠降解自身花粉管RNA的特異性核糖核酸酶，從而抑制花粉管的生長[21]；先發(fā)育花粉管在生長過程中消耗營養(yǎng)物質，引起后生長花粉活力下降，導致生長受阻[22]。本研究中也觀察到麻瘋樹授粉10 h后，一些花粉管頂端膨大而停止生長或者花粉管保持短小狀態(tài)而停止生長(圖6 A)，該現(xiàn)象發(fā)生的理論機制是否與前人相同，有待進一步研究。

盡管麻瘋樹花粉只有2 d壽命，散粉9 h后花粉活力降為45.15%[12]，但麻瘋樹雄花量遠大于雌花，雌雄花比例約為1∶25[2]，而且一朵麻瘋樹雄花產生約1 617?；ǚ?，花粉量較大，具有蜜腺可以吸引螞蟻，蜜蜂等進行傳粉[2,7]，柱頭于開花當日便具有可授性，可授期可延續(xù)到花后5～8 d[12]。因此，這些條件是可以保證麻瘋樹成功繁殖[12]。然而，在自然狀態(tài)下結果率為76.42%，有研究者認為其結實率的高低主要受訪花者限制[13]；但是卻不能解釋人工授粉條件下，結果率僅為87.93%以及平均每個果實具有2.00～2.85粒種子[7,13](麻瘋樹每個果實具有3個胚珠，理論上每個果實應具有3粒種子)的現(xiàn)象。本研究顯示，落在柱頭的花粉粒授粉4 h后全部萌發(fā)，而花柱中觀察到的花粉管數量少于柱頭萌發(fā)的花粉管數量(圖2 C 1,C 2；D 1,D 2)，又觀察到授粉10 h后柱頭存在沒有伸長的花粉管，因此，可能存在某種機制阻止了柱頭萌發(fā)花粉的花粉管進一步伸長，引起受精受阻，這樣就可能導致少部分雌花或胚珠不能正常受精，進而導致部分雌花不能結果或部分胚珠敗育。由此可以部分解釋在自然環(huán)境甚至人工授粉情況下，結果率為76%～88%以及每果實平均具有2.00～2.85粒種子的現(xiàn)象。

對植株使用花粉管通道法進行遺傳轉化時，在花粉管生長到胚囊的過程中，外源基因可以被花粉管吸收，如果外源基因進入胚囊并且參與受精過程，那么基因的轉化就有可能實現(xiàn)。本研究顯示，麻瘋樹花粉管伸長過程中存在胼胝質塞，是不利于目的DNA通過花粉管進入胚囊的。然而，對油菜、玉米、小麥、水稻等物種的研究發(fā)現(xiàn)，利用花粉管通道介導轉化時，目的DNA并不是通過花粉管進入胚囊，而是沿著花粉管的外壁，順著花粉管穿過柱頭時形成的管道進入子房[23]。因此，本研究顯示麻瘋樹采用花粉管通道法進行遺傳轉化仍具有一定可行性。

花粉管通道介導轉化技術中，目的基因通過連續(xù)的花粉管外表面進入胚囊，轉化在花粉管通道形成后精子和卵子融合到合子分裂的這一段時間較好，大多數植物的受精過程研究發(fā)現(xiàn)，完成精卵融合需要2～9 h[23]。本研究顯示，麻瘋樹花粉從授粉至花粉管進入子房，至少需要11 h，比Abdelgadir H.A等[24]的研究結果晚3 h，建議在麻瘋樹中利用花粉管導入目的DNA在授粉11 h以后進行。