榮崧汐，周夢(mèng)琪，孫 瑤

骨骼發(fā)育和骨改建過程中需要信號(hào)通路參與調(diào)控，其中Hedgehog(Hh)信號(hào)通路在胚胎時(shí)期骨發(fā)育及出生后骨改建中發(fā)揮重要作用[1]。Hh信號(hào)通路主要包括3種Hh信號(hào)蛋白Shh、Dhh、Ihh，2種蛋白受體Ptch1、Smo，核轉(zhuǎn)錄因子Gli1、Gli2、Gli3及下游靶基因[2-3]。有報(bào)道Hh信號(hào)通路參與皮質(zhì)骨的改建，通過調(diào)節(jié)血管生成參與成骨機(jī)制[4]。Hh信號(hào)通路的異常增強(qiáng)或減弱，會(huì)引起各種骨骼系統(tǒng)疾病[2]。初級(jí)纖毛是突出于細(xì)胞表面的細(xì)胞器，有感知傳導(dǎo)信號(hào)功能，作為細(xì)胞的“天線”[5]，幾乎所有細(xì)胞都有初級(jí)纖毛存在[6]。在脊椎動(dòng)物里，Hh-Gli信號(hào)傳導(dǎo)需要初級(jí)纖毛的存在和參與[7-8]。而存在于纖毛轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的纖毛轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(IFT)變化影響Hh信號(hào)通路的信號(hào)傳導(dǎo)。本研究通過建立正畸加力小鼠模型，分別在特定時(shí)間點(diǎn)觀察牙槽骨改建情況和破骨細(xì)胞在牙槽骨中的分布，以及Hh信號(hào)通路和纖毛相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在正畸過程中的表達(dá)變化，探討Hh信號(hào)通路和纖毛相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與正畸牙槽骨改建的表達(dá)變化特征及相關(guān)性，為牙槽骨改建中破骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制提供新的視角。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡野生型小鼠(C57/6J)18只，體質(zhì)量(28±1.5)g，由同濟(jì)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，喂養(yǎng)固體飼料，飲消毒清水，室溫約20℃，定期消毒。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)同濟(jì)大學(xué)倫理委員會(huì)認(rèn)可批準(zhǔn)(TJLAC-017-027)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

直徑0.2 mm，長度4 mm的螺旋鎳鈦拉伸彈簧(圣馬特，中國)；正畸專用直徑0.1 mm結(jié)扎絲(晨陽，中國)；酸蝕劑(登萊克，中國)，樹脂粘結(jié)劑(3M，美國)；組織處理脫水儀(Microm,德國)，石蠟切片機(jī)(Thermo Fisher,美國)；HE染色試劑盒(威奧，中國)；TRAP染色試劑盒(Sigma,美國)；山羊血清(邁新，中國)；Gli1抗體(Abcam，英國)；熒光二抗(Abcam,英國)；DAPI(Thermo Fisher,美國)；抗淬滅劑(Thermo Fisher,美國)；直立熒光顯微鏡和圖像分析系統(tǒng)(Nikon,日本)；Trizol(Ambion，美國)；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche,瑞士)；Light Cycler 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche,美國)。

1.3 小鼠正畸加力模型

1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠(80 mg/kg)，建立上頜右側(cè)第一磨牙正畸加力模型，4 mm拉簧用結(jié)扎絲一端固定在第一磨牙處，另一端固定在切牙處，力值為30～35 g，建模步驟參照先前實(shí)驗(yàn)[9]。

1.4 Micro CT測量

取加力0、7、14 d的小鼠，6只/組，4%多聚甲醛(PFA)固定上頜骨24 h，進(jìn)行上頜骨掃描，選擇中等分辨率8 μm切片增量獲得上頜骨右側(cè)近遠(yuǎn)中磨牙三維圖像。選取第一磨牙遠(yuǎn)中最凸接觸點(diǎn)和第二磨牙近中最凸接觸點(diǎn)作為標(biāo)記點(diǎn)，使用Micro CT自帶系統(tǒng)軟件SCANCO Medical AG測量牙移動(dòng)距離。

1.5 石蠟切片及HE、TRAP染色

4%多聚甲醛(PFA)固定小鼠上頜骨24 h,用10%乙二胺四乙酸溶液(EDTA)脫鈣20 d,進(jìn)行組織脫水石蠟包埋。石蠟組織連續(xù)切片，每片厚度4 μm，55 ℃恒溫烤片2 h，60 ℃烘箱30 min，脫蠟入水，HE、TRAP染色。

1.6 免疫熒光染色

切片脫蠟入水，第1天透明質(zhì)酸37 ℃抗原修復(fù)1 h，PBS洗5 min，分3次，山羊血清封閉37 ℃ 1 h，PBS洗5 min，分3次，Gli1抗體(1∶400)4 ℃下孵育過夜，第2天全程避光，復(fù)溫至室溫后PBS洗5 min，分3次，Alexa Flour 586IgG(1∶500)室溫孵育45 min，PBS洗5min，分3次，DAPI(1∶1 500)復(fù)染5 min，抗淬滅劑封片，熒光顯微鏡拍照。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

提取0、7、14 d小鼠右側(cè)上頜骨組織，加入1 mL Trizol試劑，機(jī)械研磨粉碎，提取組織總RNA。使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit，用Oligo DT引物，終體積為20 μL,從1 μg總RNA合成1個(gè)cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：以GAPDH為內(nèi)參基因，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL, DyeⅡ 0.5 μL,cDNA 2 μL,SYBR Premix ExTaq12.5 μL,雙蒸水定容20 μL,測定Ct值(Roche PCR儀),進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物列于表1中。

表1 引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié) 果

2.1 建立正畸加力模型，加力后顯示第一磨牙向近中移動(dòng)

如示意圖所示建立正畸加力模型(圖1A)。CT三維成像顯示相對(duì)于未正畸小鼠，加力7、14 d小鼠上頜骨右側(cè)第一磨牙向近中移動(dòng)(圖1B、1C、1D)。統(tǒng)計(jì)牙移動(dòng)距離顯示加力7 d移動(dòng)距離為(0.251±0.0194)mm，14 d牙移動(dòng)距離為(0.359±0.064)mm,移動(dòng)距離具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。

A:正畸加力示意圖；B～D:右側(cè)上頜第一磨牙加力0、7、14 d牙移動(dòng)變化；E:右側(cè)上頜第一磨牙加力7、14 d移動(dòng)距離；箭頭示移動(dòng)方向；*：P<0.05

圖1建立正畸牙移動(dòng)模型

Fig.1Establishment of orthodontic tooth movement model

2.2 正畸加力牙槽骨改建情況及破骨細(xì)胞數(shù)量變化

HE染色顯示未正畸小鼠牙周膜連續(xù)致密，牙槽骨結(jié)構(gòu)完整，可見疏松骨髓腔；TRAP染色未見牙槽骨中有破骨細(xì)胞生成。正畸7 d小鼠牙槽骨壓力側(cè)牙周膜受壓萎縮，牙槽骨受壓后骨質(zhì)疏松多孔，14 d可見壓力側(cè)牙槽骨吸收明顯(圖2A)；TRAP染色可見破骨細(xì)胞生成，主要集中在壓力側(cè)(圖2B)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2C)。破骨細(xì)胞特異酶抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和組織蛋白酶K(CTSK)加力前表達(dá)水平較低，7 d和14 d連續(xù)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2D)。

A:加力0、7、14 d HE染色示牙槽骨壓力側(cè)牙周膜紊亂，牙槽骨改建明顯; B:加力0、7、14 d TRAP染色示破骨細(xì)胞生成逐漸增加，壓力側(cè)骨吸收明顯; C:牙槽骨壓力側(cè)TRAP陽性細(xì)胞計(jì)數(shù); D:破骨細(xì)胞相關(guān)基因TRAP 、CTSK mRNA表達(dá)水平;R:牙根；PL:牙周膜；MB:近中牙槽骨。紅色箭頭示牙齒移動(dòng)方向，黑色箭頭示TRAP陽性破骨細(xì)胞;*：P<0.05

圖2加力后右側(cè)上頜第一磨牙牙槽骨改建情況

Fig.2Alveolar bone remodeling of the right maxillary first molar of mice after force

2.3 熒光染色示Gli1陽性細(xì)胞在牙槽骨中的表達(dá)分布及Hh信號(hào)通路分子Shh、Smo、Gli1表達(dá)水平變化

免疫熒光染色顯示未加力小鼠牙槽骨中Gli1陽性細(xì)胞較少((3.333±0.471)個(gè))，加力7 d可見牙槽骨中有大量Gli1陽性細(xì)胞出現(xiàn)，并且主要分布在牙槽骨壓力側(cè)(圖3A)，計(jì)數(shù)Gli1陽性細(xì)胞在7 d時(shí)表達(dá)最高((28.000±0.816)個(gè))，14 d下降((22.667±1.247)個(gè))(P<0.05，圖3B)。Hh信號(hào)通路分子Shh、Smo、Gli1在加力7 d時(shí)表達(dá)水平達(dá)到峰值，14 d表達(dá)水平下降，但整體表達(dá)水平在加力后上升，0、7、14 d表達(dá)水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，圖3C)。

A:加力0 d牙槽骨中無明顯Gli1陽性細(xì)胞，7 d Gli1陽性細(xì)胞在牙槽骨中表達(dá)明顯，14 d在牙槽骨壓力側(cè)聚集表達(dá); R:牙根；PL:牙周膜；MB:近中牙槽骨;圖中白色箭頭示Gli1陽性細(xì)胞;B:加力0、7、14 d Gli1陽性細(xì)胞表達(dá)水平定量;C: 加力0、7、14 d Hedgehog信號(hào)通路分子Shh、Smo、Gli1 mRNA表達(dá)水平，*：P<0.05

圖3免疫熒光染色示Gli1陽性細(xì)胞在正畸骨改建中表達(dá)分布及Hedgehog通路下游分子表達(dá)變化

Fig.3Immunofluorescence showed Gli1positive cell expression in orthodontic bone remodeling and the expressionlevels of Hedgehog pathway downstream signals

2.4 纖毛相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ift144、Ift88、Ift74和纖毛動(dòng)力蛋白Kif3a表達(dá)水平

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體A(IFTA)中的Ift88隨加力時(shí)間在7 d時(shí)輕微下降，在14 d時(shí)表達(dá)水平上升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。IFTA中的Ift74在牙槽骨加力后14 d表達(dá)水平上調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體B(IFTB)中的Ift144表達(dá)水平在7 d時(shí)下降明顯，14 d略微上升(P<0.05)。纖毛動(dòng)力蛋白Kif3a表達(dá)水平在加力7、14 d中明顯上升(P<0.05，圖4)。

加力0、7、14 d Ift88、Ift74、Ift144、Kif3a mRNA表達(dá)水平，*：P<0.05

圖4不同時(shí)間點(diǎn)纖毛相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和纖毛動(dòng)力蛋白mRNA表達(dá)水平

Fig.4Expression level of intraflagellar transport protein and ciliary dynein protein at different time points

3 討 論

正畸下的牙槽骨改建包括壓力側(cè)的骨吸收和張力側(cè)的新骨形成。發(fā)現(xiàn)小鼠正畸早期牙槽骨中生成大量破骨細(xì)胞，壓力側(cè)骨吸收區(qū)域明顯，牙移動(dòng)距離隨著正畸天數(shù)增加而不斷加大(P<0.05)，破骨細(xì)胞相關(guān)特異酶TRAP和CTSK在正畸加力后表達(dá)水平上調(diào)，14 d時(shí)具有明顯差異(P<0.05)。說明正畸早期牙槽骨改建以骨吸收為主。

Hedgehog信號(hào)通路在胚胎和成體組織的發(fā)育和維持中具有重要作用[10-12]，參與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨分化[13-14]，在Shh誘導(dǎo)的小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞MC3T3-E1中成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Osterix表達(dá)上調(diào)促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)向成骨細(xì)胞分化[15]。 Heller等[16]發(fā)現(xiàn)在體外抑制Hh效應(yīng)器Smo表達(dá)后減少破骨細(xì)胞生成。Shimo等[17]在CD11b陽性細(xì)胞破骨向培養(yǎng)中加入Shh發(fā)現(xiàn)促進(jìn)破骨細(xì)胞分化的活化T細(xì)胞核因子1(Nfatc1)表達(dá)上調(diào)，證實(shí)Hh信號(hào)通路影響破骨細(xì)胞活性。此研究聚焦于體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)Shh在正畸7 d時(shí)表達(dá)較高(P<0.05)，提示正畸骨改建激活Hh信號(hào)通路。Shh的升高抑制了膜受體Ptch1的表達(dá)，解除了對(duì)Smo的結(jié)合抑制，Smo表達(dá)在7 d時(shí)達(dá)到高峰而隨后下降(P<0.05)。Hh信號(hào)通路中具有激活效應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子Gli1在Hh通路激活后表達(dá)上調(diào)[18]，免疫熒光染色示Gli1陽性細(xì)胞在牙槽骨壓力側(cè)表達(dá)集中，其mRNA表達(dá)水平在7 d較高(P<0.05)。這些結(jié)果提示Hh信號(hào)通路參與正畸牙槽骨改建，正向調(diào)控破骨細(xì)胞的分化[19-20]。未來可進(jìn)一步研究牙槽骨改建過程中Shh信號(hào)和破骨細(xì)胞生成的相關(guān)性。

初級(jí)纖毛是介導(dǎo)Hedgehog信號(hào)的重要細(xì)胞器。纖毛轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合體系統(tǒng)(IFT)維持纖毛結(jié)構(gòu)和信號(hào)傳導(dǎo)，分為逆向纖毛轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)A(IFTA)和正向纖毛轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)B(IFTB)。作為信號(hào)傳導(dǎo)器，推測物理刺激導(dǎo)致纖毛相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)改變影響Hh信號(hào)通路。Ift144是IFTA中的核心蛋白，構(gòu)建ift144等位基因突變小鼠顯示轉(zhuǎn)運(yùn)膜蛋白缺損使得Shh活性喪失[21]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ift144在加力后下降明顯，第14天表達(dá)略有上升，可能源于激活早期以正向運(yùn)輸纖毛蛋白積聚在纖毛頂部，逆向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)暫時(shí)抑制所造成，仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。IFTB的缺失會(huì)損害Hh信號(hào)通路，其中Ift88影響Hh信號(hào)通路激活[22]。選取IFTB上的核心蛋白Ift88和Ift74，發(fā)現(xiàn)Ift88呈先下降后上升趨勢(shì)，Ift74在早期變化不明顯，14 d時(shí)表達(dá)升高。推測Hh信號(hào)通路與IFTB核心蛋白之間多向性調(diào)控。Kif3a是纖毛正向運(yùn)輸系統(tǒng)中動(dòng)力蛋白亞基，相關(guān)研究顯示Kif3a的缺損會(huì)導(dǎo)致Shh敏感性下降[23]，減弱細(xì)胞內(nèi)鈣離子對(duì)流體剪切力的響應(yīng)，降低Hh信號(hào)通路的活性[24]，Kif3a在正畸骨改建中表達(dá)激活，判斷Kif3a在正畸牙槽骨改建中參與Hh信號(hào)通路正向調(diào)控。

有研究證實(shí)Hh信號(hào)通路在體外促進(jìn)破骨細(xì)胞生成，增強(qiáng)骨吸收能力。但是在體內(nèi)則缺乏相關(guān)研究。上述結(jié)果說明在正畸力的作用下，以破骨細(xì)胞為主導(dǎo)的正畸骨改建階段，牙槽骨中Hh信號(hào)通路的基因表達(dá)水平上調(diào)，同時(shí)纖毛相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平有明顯變化，提示我們牙槽骨中破骨細(xì)胞的生成可能會(huì)受到纖毛轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)激活Hh信號(hào)通路的影響，本研究為理解正畸牙移動(dòng)過程中破骨細(xì)胞的激活和生成提供新的視角和理論依據(jù)。骨改建過程中初級(jí)纖毛對(duì)Hh信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制，有待于進(jìn)一步研究。