(山西省心血管病醫(yī)院，山西 太原 030024)

隨著急性心肌梗死溶栓治療、經(jīng)皮冠脈血管介入治療、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)等方法的建立和推廣，顯著提高了冠心病的救治成功率，但同時(shí)心衰人群越來(lái)越多，發(fā)生再次心梗的風(fēng)險(xiǎn)增加，因此心臟遭遇二次打擊越來(lái)越受到人們的廣泛關(guān)注[1]。心衰患者心肌經(jīng)歷缺血/再灌注損傷時(shí)其并發(fā)癥的發(fā)生率和病死率均顯著高于心功能正常者。慢性心衰患者機(jī)體處于一個(gè)新的代謝狀態(tài)，對(duì)缺血/再灌注損傷等刺激的反應(yīng)不同于左室功能正常者。研究報(bào)道，心臟特異性高表達(dá)β3AR的小鼠模型中，病理染色并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)肥大增生的心肌細(xì)胞，也沒(méi)有心肌纖維化等改變[2]。Wang J等[3]研究表明抗β3AR抗體(β3AA)在壓力后負(fù)荷的心衰模型中，具有一定的心臟保護(hù)作用，但心衰后再經(jīng)歷缺血/再灌注損傷時(shí)，β3AA的作用未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物 由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供的健康雄性Wistar大鼠70只，8～10周齡重量為200～220 g。

1.1.2 試劑 大鼠β3AR細(xì)胞外第二環(huán)氨基酸序列(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海生物化學(xué)院)；完全氟氏佐劑、不完全氟氏佐劑、小牛血清白蛋白組份V、TTC 2,3,5-氯化三苯基四氮唑、Evan’s blue、吐溫20(均購(gòu)自Sigma)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈酶親和素、生物素化山羊抗大鼠二抗、原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒(均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；GlueB型活化辣根過(guò)氧化物酶(濟(jì)南泰天和生物科技有限公司)；親和柱試劑盒HiTrap Protein G HP column，MAbTrap Kit(Amersham)；Caspase-3底物Ac-DEVD-pNA(美國(guó)Biomol公司)。

1.1.3 儀器 MS2000生物信號(hào)記錄分析系統(tǒng)(成都泰能公司)；HX-200動(dòng)物呼吸機(jī)(成都太盟科技有限公司)；超低溫冰箱(美國(guó)Forma公司)；6-0號(hào)無(wú)創(chuàng)帶針縫合線(上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司)；石蠟切片機(jī)(Leica)；96孔酶標(biāo)板(丹麥Nunc公司)；SpectraMax M2/M2e酶標(biāo)儀(Molecular Devices Corp，CA, USA)。

1.2 方法

1.2.1 β3AA的制備 選用Wistar大鼠20只，β3AA處理組給予皮下注射人工合成抗原肽段進(jìn)行免疫，首次免疫時(shí)采用背部皮下多點(diǎn)注射，抗原肽段劑量為0.4μg/kg，使用完全佐劑混合，2周后用不完全佐劑與抗體肽段混合加強(qiáng)免疫，以后每隔兩周使用不完全佐劑與抗體肽段混合加強(qiáng)免疫1次，共免疫8周。采用改良的ELISA方法檢測(cè)免疫鼠血清中β3AA水平。利用IgG親和純化試劑盒(Mab．Trap Kit)純化抗β3AA陽(yáng)性的免疫大鼠血清中的IgG，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作進(jìn)行。

1.2.2 大鼠壓力后負(fù)荷型心衰模型制備 采用腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.3 mL/100 g體重)大鼠，在劍突下沿正中線打開(kāi)腹腔，在左右腎動(dòng)脈之間分離腹主動(dòng)脈，將7號(hào)針頭粗的探針與腹主動(dòng)脈一并結(jié)扎，然后抽出探針，腹腔注射慶大霉素抗感染，分層關(guān)腹。

1.2.3 β3AA鼠尾靜脈給予心衰大鼠 采用尾靜脈注射法將β3AA給予心衰大鼠體內(nèi)，劑量為2μg/g，每10 d注射1次，共注射5次；對(duì)照組以相同的方法給予β3AA陰性的IgG。

1.2.4 缺血/再灌注手術(shù) 將大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.3 mL/100 g體重)麻醉，連接心電監(jiān)護(hù)，行氣管切開(kāi)、呼吸機(jī)機(jī)械通氣，設(shè)置通氣量7～8 mL，呼吸頻率為60次/min；開(kāi)胸暴露心臟，打開(kāi)心包，將6～0無(wú)創(chuàng)縫合線帶針穿過(guò)左前降支下方，系一活結(jié)，觀察心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST-T抬高，松開(kāi)結(jié)扎線，觀察抬高的ST-T下降1/2以上。前降支結(jié)扎時(shí)間為30 min，再灌注時(shí)間3 h；假手術(shù)組操作相同，但不結(jié)扎前降支。

1.2.5 心梗面積測(cè)定 再灌注結(jié)束后，麻醉大鼠，連接呼吸機(jī)，打開(kāi)胸腔，再次結(jié)扎前降支，從股靜脈注入2% Evan′s 藍(lán)染料 2 mL，待大鼠四肢末梢皮膚及口唇藍(lán)染后，迅速摘除心臟， -70 ℃凍存。取出凍存心臟，自心底向心尖沿橫切面將心臟平均切成厚約2 mm的環(huán)形薄片，置于TTC染液中，避光孵育15 min，采用10%甲醇固定24～48 h。

1.2.6 Caspase 3 活性測(cè)定、原位末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)測(cè)定心肌細(xì)胞凋亡 利用Capase3 活性測(cè)定試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按說(shuō)明書操作。利用原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)視野內(nèi)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞和所有心肌細(xì)胞，以凋亡指數(shù)反應(yīng)心肌細(xì)胞凋亡的情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 β3AA可以改善心衰大鼠經(jīng)歷缺血/再灌注手術(shù)后的生存情況

心衰后再經(jīng)受缺血/再灌注打擊，極易引發(fā)急性心衰且生存情況不容樂(lè)觀。而β3AA經(jīng)鼠尾靜脈給予心衰大鼠后，經(jīng)歷缺血/再灌注手術(shù)的生存情況明顯改善，平均存活時(shí)間為155 min，死亡率50%，而給予對(duì)照組(給予β3AA陰性的IgG組)平均存時(shí)間為21 min，死亡率為87.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖 1。

圖1 β3AA被動(dòng)免疫心衰大鼠經(jīng)歷缺血/再灌注(I/R)損傷后，生存率明顯改善

注：Sham：腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后大鼠+偽I/R手術(shù)組；AB+β3AA+I/R：β3AA被動(dòng)免疫腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后大鼠+I/R組；AB+IgG+I/R：免疫球蛋白被動(dòng)免疫腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后大鼠+I/R組

2.2 β3AA使心衰大鼠經(jīng)歷缺血/再灌注損傷后心梗面積減小

心肌梗塞面積是反映心肌損傷情況的經(jīng)典指標(biāo)。β3AA經(jīng)鼠尾靜脈給予心衰大鼠后，再經(jīng)歷心肌缺血/再灌注時(shí)，與對(duì)照組比較可明顯降低心肌梗死面積，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(48.81±6.45%vs60.25±2.52%，P<0.05，圖2)。提示，β3AA處理的心衰大鼠經(jīng)歷缺血/再灌注后心肌損傷減輕。

圖2 β3AA被動(dòng)免疫心衰大鼠后，經(jīng)歷缺血/再灌注引發(fā)的心梗面積減小

注：Sham：腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后大鼠+偽I/R手術(shù)組；AB+β3AA+I/R：β3AA被動(dòng)免疫腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后大鼠+I/R組；AB+IgG+I/R：免疫球蛋白被動(dòng)免疫腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后大鼠+I/R組；AAR/LV%：危險(xiǎn)區(qū)面積占左心室面積的百分比；AN/AAR%：心肌梗塞面積占危險(xiǎn)區(qū)面積的百分比；*P<0.05 vs sham；#P<0.05 vs AB+IgG+I/R

2.3 β3AA可以使心衰大鼠經(jīng)歷缺血/再灌注手術(shù)后心肌細(xì)胞凋亡減少

TUNEL染色結(jié)果及Caspase-3活性檢測(cè)結(jié)果均顯示，與對(duì)照組相比，β3AA處理的心衰大鼠危險(xiǎn)區(qū)心肌組織凋亡指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(24.33±1.82%vs31.24±1.31%,P<0.05, 圖 3A)，心肌組織caspase-3活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1 485±89.39vs1 941±150.0，P<0.05，圖3B)。偽手術(shù)組凋亡指數(shù)為1.32±0.18%，心肌組織TUNEL染色幾乎沒(méi)有陽(yáng)性的凋亡核。

圖3 β3AA被動(dòng)免疫心衰大鼠后，經(jīng)歷缺血/再灌注引發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡減少

注：A：TUNEL測(cè)定結(jié)果，B：Caspase3 活性測(cè)定；Sham：腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后大鼠+偽I/R手術(shù)組；AB+β3AA+I/R：β3AA被動(dòng)免疫腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后大鼠+I/R組；AB+IgG+I/R：免疫球蛋白被動(dòng)免疫腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后大鼠+I/R組；*P<0.05vs.Sham；#P<0.05vs.AB+IgG+I/R

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)β3AA處理的心衰大鼠，經(jīng)歷心肌缺血/再灌注時(shí)，生存情況明顯改善，可能是通過(guò)減少心肌細(xì)胞凋亡而減小心肌梗死面積，提示β3AA對(duì)心衰后的缺血/再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。

慢性心力衰竭急性失代償是心血管疾病死亡的主要原因，且是心衰患者反復(fù)住院的直接原因[4]。多數(shù)慢性心力衰竭急性失代償發(fā)作的誘因是心肌相當(dāng)或絕對(duì)缺血[5]。因此，本研究探索了經(jīng)鼠尾靜脈直接給予β3AA對(duì)心衰大鼠經(jīng)受心肌缺血/再灌注損傷的作用。研究發(fā)現(xiàn)，β3AA處理后，心衰大鼠經(jīng)受缺血/再灌注損傷后的生存情況明顯改善，生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)，且心肌損傷情況明顯改善，表現(xiàn)在心肌梗死面積減小，心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量減少。缺血/再灌注后心肌細(xì)胞的死亡形式有多種，包括壞死、凋亡、自噬等，凋亡因其可調(diào)可控而廣受關(guān)注，通過(guò)多種手段以減少心肌細(xì)胞凋亡，降低心肌損害，本研究中采用Tunel以及Caspase3活性測(cè)定兩種方法檢測(cè)凋亡，均發(fā)現(xiàn)β3AA經(jīng)鼠尾靜脈給予心衰大鼠體內(nèi)，作用約8周后可明顯缺血/再灌注損傷導(dǎo)致的心肌凋亡，進(jìn)而減小心梗面積，發(fā)揮心臟保護(hù)作用。

β3AA是針對(duì)β3AR的特異性抗體，可能通過(guò)激活心肌細(xì)胞β3AR，進(jìn)而激活一系列下游信號(hào)通路，其可能的機(jī)制包括：a)心衰時(shí)，心肌細(xì)胞表面β3AR較非心衰時(shí)表達(dá)升高2～3倍，β3AA特異激活β3AR，通過(guò)其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制L2型Ca2+通道，使細(xì)胞Ca2+內(nèi)流減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器釋放Ca2+，減輕了鈣超載，發(fā)揮心肌保護(hù)作用[6]。b)其次β3AR做為G蛋白偶聯(lián)受體家族中的一員，與Gi 蛋白相互結(jié)合, 從而激活一氧化氮合酶，主要是eNOS，從而使一氧化氮產(chǎn)生增加，發(fā)揮擴(kuò)張血管、改善心臟舒張的作用，增加心臟舒張貯備，改善舒張期冠脈血流，發(fā)揮心肌保護(hù)作用[7]。c)β3AR不僅存在于心肌細(xì)胞中，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中也有表達(dá)，β3AA特異性激活血管內(nèi)皮細(xì)胞β3AR后發(fā)揮擴(kuò)張血管作用，降低了外周阻力，減輕了心臟后負(fù)荷，改善心功能[8]。

總之，β3AA被動(dòng)免疫可以減輕心衰大鼠的缺血/再灌注損傷，然而β3AA發(fā)揮心臟保護(hù)作用的具體分子機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。