錢紅梅，郭俊佩，劉小瓊，歐陽春平，高建華

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是革蘭氏陽性菌，能夠在不同的生長時期產(chǎn)生不同種類的殺蟲蛋白。比如，對數(shù)生長中期可以分泌外毒素，其被稱為營養(yǎng)期殺蟲蛋白（Vegetative insecticidal proteins，VIPs）[1]；芽孢形成的時候會產(chǎn)生殺蟲晶體蛋白（Insecticidal cystal proteins，ICPs）[2]。其中，研究最早，最廣泛的是殺蟲晶體蛋白，其可分為Cry（Crystal protein，晶體毒素）和Cyt（Cytolitic protein，細(xì)胞裂解素）兩大類。Bt 殺蟲蛋白的廣譜性，使其成為農(nóng)業(yè)研究和生產(chǎn)中關(guān)注的熱點。

從第一個cry 基因cry1Aa1[3]被克隆之后，Cry 蛋白被相繼發(fā)現(xiàn)[4]。為便于對眾多Cry 蛋白進(jìn)行歸類和研究，人們建立了Cry 蛋白分類和命名的規(guī)則[3]。Cry 蛋白的表達(dá)模式、基本空間結(jié)構(gòu)和殺蟲機制等均已被深入研究[5-9]。目前，多種Cry 蛋白已被成功用于轉(zhuǎn)基因抗蟲作物，例如Cry1A 蛋白在棉花中表達(dá)，可有效地減少棉鈴蟲的侵害[10]；Cry1Ac 和Cry1C蛋白在花椰菜中同時表達(dá)，可使花椰菜中小菜蛾的抗性推遲[11]；在棉花中表達(dá)Cry2Ab 蛋白，能夠使棉鈴蟲停止攝食，從而饑餓至死[12]；Cry1Ia 蛋白能夠毒害鱗翅目和鞘翅目的昆蟲[13]；同時，Cry1Ia 也是少有的能夠在大腸桿菌中可溶性表達(dá)的Cry 蛋白[14]。因此，不斷篩選新的Cry 蛋白能夠為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供更多的抗蟲資源。

Cry1B 是Cry1 類蛋白的一個分支，其分子質(zhì)量大小約為140 ku，與傳統(tǒng)的Cry 蛋白一樣都具有3個經(jīng)典結(jié)構(gòu)域，且這3 個結(jié)構(gòu)域與殺蟲活性密切相關(guān)[5-9]。通過結(jié)構(gòu)域的交換獲得新的殺蟲譜或改變殺蟲活性，是Cry 蛋白常見的改造方式[15]。目前，已知的Cry1B 蛋白有10 個亞類，分別是Cry1Ba、Cry1Bb、Cry1Bc、Cry1Bd、Cry1Be、Cry1Bf、Cry1Bg、Cry1Bh、Cry1Bi 和Cry1Bj[4]。

本研究以山西農(nóng)業(yè)大學(xué)雜糧分子育種團(tuán)隊前期篩選并克隆的一個新的cry1Bd 基因（命名為new-cry1Bd）為研究對象，首先分析了該基因編碼蛋白new-Cry1Bd 與Cry1B 系列蛋白的親緣關(guān)系，然后將cry1Bd 基因克隆至pHT304 質(zhì)粒，并檢測其蛋白表達(dá)；另外，將new-Cry1Bd蛋白N 端部分進(jìn)行獨立表達(dá)，檢測其表達(dá)穩(wěn)定性，旨在為后續(xù)研究和利用該殺蟲蛋白奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菌株為大腸桿菌（Escherichia coli）TG1 菌株和蘇云金芽孢桿菌BMB171 菌株。

試劑為TaKaRa primeSTARRHS DNA Polymerase with GC Buffer（貨號R044A）試劑盒；南京諾唯贊生物科技有限公司重組試劑盒ClonExpressRII One Step Cloning Kit（貨號c112-02）；中科瑞泰的1 kb Plus DNA ladder（貨號RTM418）；AxyGEN 質(zhì)粒小提試劑盒（貨號AP-MN-P-250G）和DNA 回收試劑盒（貨號AP-GX-50G）；Thermo 的限制性內(nèi)切酶BamHI、SacI、KpnI、EcoRI 和蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量PageRuler Prestained Protein Ladder。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 氨基酸多序列比對構(gòu)建進(jìn)化樹 從NCBI 網(wǎng)站上下載Cry1B 蛋白家族中12 個蛋白（Cry1Ba、Cry1Bb、Cry1Bc、Cry1Be、Cry1Bf、Cry1Bg、Cry1Bh、Cry1Bi 和Cry1Bj 以及3 種Cry1Bd 蛋白）的氨基酸序列，使用Mega X 將new-Cry1Bd 蛋白序列與這12 個蛋白的氨基酸序列進(jìn)行聚類分析（Neighbor joining 法）[16-17]。

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建 首先，用BamHI 和SacI雙酶切p304-2Ab-1I 質(zhì)粒[18]，用DNA 回收試劑盒回收相應(yīng)載體片段。以新分離鑒定的new-cry1Bd基因作模板，用引物1Ball-CDS-R（5′- ACCTGAGT TTGCCTCGAGCTCCTATTCTTCCATGAGGAATAGT TC-3′）和1B-CDS-F（5′-TAAAAGAGATGGAGGG GATCCACCATGACTTCAAATAGGAAAAATG-3′）進(jìn)行PCR 擴增，獲得相應(yīng)的目的基因；然后通過重組克隆將目的基因克隆至上述線性化載體中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1 菌株；通過酶切鑒定，將正確的質(zhì)粒命名為p304-new-cry1Bd，含有該質(zhì)粒的大腸桿菌命名為T304-new-cry1Bd；以p304-new-cry1Bd 為模板，用引物1B-CDS-F（5′-TAAAAGAGATGGAGGG GATCCACCATGACTTCAAATAGGAAAAATG-3′）和1-half-R-new（5′-TAAACCTGAGTTTGCCTCGAGC TCTTATAAGTTTCTTTCATCACTGA-3′）擴增Cry1Bd蛋白N 端編碼序列，并用相同的方法克隆至上述線性化的p304-2Ab-1I 載體中，將該質(zhì)粒命名為p304-new-cry1Bdhalf，含有該質(zhì)粒的大腸桿菌命名為T304-new-cry1Bdhalf。

1.2.3 2 種蛋白的表達(dá)與可溶性分析 將成功構(gòu)建的2 個表達(dá)載體和pHT304 質(zhì)粒，用電擊法分別轉(zhuǎn)入蘇云金芽孢桿菌BMB171 感受態(tài)細(xì)胞[19-20]；用涂布平板法平鋪到含有25 μg/mL 紅霉素的固體LB培養(yǎng)基上，28.5 ℃過夜培養(yǎng)；分別將這3 個菌株的單克隆接種于3 mL 液體LB 培養(yǎng)基（含有25 μg/mL的紅霉素），28.5 ℃過夜培養(yǎng)72 h。每個試管各取2 mL 菌液，12 000 r/min 離心10 min，分離上清和沉淀。向沉淀中加入800 μL Na2CO3溶液（50 mmol/L Na2CO3，10 mmol/L DTT，pH 值為10.5），放入37 ℃恒溫?fù)u床，200 r/min 振蕩1 h；然后12 000 r/min 4 ℃離心20 min，分離上清和沉淀。所有上清用3 ku 的超濾管超濾至160 μL。沉淀用160 μLPBS（137 mmol/L的NaCl、2.7 mmol/L的KCl、10 mmol/L 的Na2HPO4、2 mmol/L的KH2PO4，pH 值7.4）重懸。所有樣品中，加40 μL 的5×Protein loading buffer，沸煮10 min；然后，12 000 r/min 離心5 min，上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并分析蛋白表達(dá)及可溶性。

2 結(jié)果與分析

2.1 new-Cry1Bd 蛋白親緣關(guān)系分析

將new-Cry1Bd 蛋白與12 種Cry1B 蛋白進(jìn)行親緣關(guān)系分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖1），new-Cry1Bd 蛋白與Cry1Bd 蛋白更接近，將該蛋白與Cry1Bd1 進(jìn)行氨基酸序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有3 處差異（圖2），即Cry1Bd1 蛋白第572 位為絲氨酸（S），而new-Cry1Bd中變成亮氨酸（L）；第1 147 位氨基酸由谷氨酸（E）變成天冬氨酸（D）；第1 227 位氨基酸由亮氨酸（L）變成苯丙氨酸（F）。其中，L572 位于Cry1B 蛋白的結(jié)構(gòu)域III（Domain III），另外2 個差異位點位于其C 端尾部，推測對其殺蟲活性影響不大。

2.2 載體的構(gòu)建及鑒定

將new-Cry1Bd 蛋白的編碼序列接入pHT304載體，并置于cry1Ac 基因的啟動子（Pac）和終止子（Tac）調(diào)控之下（圖3-A）。同時，為了研究該蛋白N端的表達(dá)穩(wěn)定性，將其編碼序列也接入pHT304 載體，并由Pac和Tac調(diào)控其表達(dá)。對這2 個質(zhì)粒進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，結(jié)果顯示，產(chǎn)物圖譜與預(yù)期一致（圖3-B）。

2.3 2 個蛋白的表達(dá)和可溶性分析

將含有p304-new-cry1Bd 或p304-new-cry1Bdhalf 的Bt 菌株培養(yǎng)72 h 后，檢測其蛋白表達(dá)情況，同時對其表達(dá)產(chǎn)物的可溶性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示（圖4），new-Cry1Bd 和new-Cry1Bdhalf 蛋白均能表達(dá)，且其大小均與預(yù)期一致，分別為139.7、80.8 ku。

對new-Cry1Bd 和new-Cry1Bdhalf 這2 種蛋白的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行可溶性試驗，結(jié)果顯示，2 種蛋白的表達(dá)產(chǎn)物均能部分溶解于堿性Na2CO3溶液，其中，完整的new-Cry1Bd 溶解比例高于new-Cry1Bdhalf。

3 結(jié)論與討論

前期，我們篩選了8 種新型cry1B 基因[21]。本研究又獲得一種新的Cry1B 蛋白（new-Cry1Bd），通過將其與其他Cry1B 家族代表比較親緣關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白與Cry1Bd 蛋白最為相似。將該蛋白氨基酸序列與3 種Cry1Bd 分支進(jìn)行深入比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比Cry1Bd1 蛋白，new-Cry1Bd 蛋白僅有3 個差異氨基酸。其中，1 個位于N 端結(jié)構(gòu)域III 區(qū)域（L572），另外2 個位于C 端尾部（D1147 和F1227）。其中，位于N 端結(jié)構(gòu)域III 的差異氨基酸L572，在其他已知的3 種Cry1Bd 蛋白中相對保守，均為絲氨酸，但這2 種氨基酸性質(zhì)差異較大，因此，可能對該蛋白的活性或穩(wěn)定性產(chǎn)生一定的影響；位于C 端的2 個差異位點在3 種已知的Cry1Bd 蛋白中也較為保守，但是由于C 端不參與Cry 蛋白殺蟲活性[4-8]，因此，推測這2 處的氨基酸差異與new-Cry1Bd 殺蟲活性無關(guān)。

為了進(jìn)一步研究new-Cry1Bd 蛋白的殺蟲活性和應(yīng)用潛力，本研究構(gòu)建了該蛋白及其N 端編碼序列（Cry1Bdhalf）的表達(dá)載體，并將這2 種載體分別轉(zhuǎn)化Bt 菌株進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，不論完整的new-Cry1Bd 還是其N 端多肽，均能夠在Bt細(xì)胞中表達(dá)，但這2 種表達(dá)產(chǎn)物的可溶性差異較大，約1/2 左右的new-Cry1Bd 蛋白可以溶于堿性Na2CO3溶液，而僅有很少比例的new-Cry1Bdhalf 可以溶解。結(jié)果說明，Cry1Bd 蛋白的C 端對其表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)具有較大的影響，這與其他Cry 蛋白一致[3，5]。

綜上所述，本研究報道了一種新型的Cry1Bd蛋白，該蛋白與Cry1Bd1 的親緣關(guān)系最近，僅有3 個氨基酸差異。該蛋白的發(fā)現(xiàn)為Cry1Bd 分支增添了新成員，更為重要的是，new-Cry1Bd 在其執(zhí)行殺蟲活性的N 端部分僅1 個氨基酸差異。因此，該蛋白也可以直接作為1 個點突變體研究Cry1Bd 系列蛋白的殺蟲機制。