杭 偉，張宏江，馬浩天，王曉丹，許文鑫，趙春超，李潤植，崔紅利

（山西農(nóng)業(yè)大學分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西太谷030801）

光照是植物生長的能量來源，也是介導植物光形態(tài)建成和生物節(jié)律的環(huán)境影響因子。CASPARY研究發(fā)現(xiàn)，光照條件下東爪草（Tillea aquatica）種子的發(fā)芽率達到最高[1]。BORTHWICK 等[2]研究發(fā)現(xiàn)，640～670 nm 紅光（R）能有效促進萵苣種子萌發(fā)，而720～750 nm 遠紅光（FR）則抑制萵苣種子萌發(fā)。低劑量的紫外光UV-B（290～300 nm）影響植物下胚軸伸長、子葉伸展、葉片光合作用和生物節(jié)律[3-4]。

光合作用的生物在進化的過程中獲得了復雜而又精細的光感知和轉(zhuǎn)導信號通路，其中，光受體在這個信號通路中發(fā)揮著重要的作用[3-4]。植物細胞內(nèi)分布著大量感知光信號的光受體蛋白。根據(jù)不同波長的光譜，將光受體分為3 類光受體：感受紅光/遠紅光（600～750 nm）的3～5 種光敏色素受體（PHYs），感受藍光和UV-A（390～500 nm）的8 個藍 光 受 體（CRY1、CRY2、CRY-DASH、ZTL、FKF1、LKP2、PHOT1、PHOT2），感受紫外UV-B（280～315 nm）的1 個紫外光受體UVR8[5-7]。有關光受體功能和信號轉(zhuǎn)導通路的研究是近年來光化學和光遺傳學研究的熱點領域[8-9]。

隱花色素（CRYs）是屬于隱花色素/光裂解酶（cryptochrome/photolyase，CPF）基因家族，廣泛分布于動物、植物、藻類[10]，能被藍光激活的受體蛋白，具有調(diào)控植物光形態(tài)發(fā)生和生物節(jié)律的功能[11]。隱花色素最早在雙子葉植物擬南芥中被發(fā)現(xiàn)[12]。在擬南芥當中，隱花色素主要分為3 類：CRY1、CRY2、CRY-DASH。CRY1 和CRY2 主要是植物感受外界光信號的光受體，參與調(diào)控植物光周期開花和植物光形態(tài)建成過程；CRY-DASH 具有修復由光造成的ssDNA 和dsDNA 損傷的能力[13]。高等植物關于隱花色素的研究較多，在番茄（Lycopersicon esculentum）、大豆（Pisum sativum）、玉米（Zea mays）等高等植物上研究也較多[14-16]。在真核藻類當中，關于藻類中隱花色素的研究較少。綠藻萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhartii）和團藻（Volvox carteri）中，分別存在4 個CRYs，一個植物類型（CPH1）、一個動物類型（aCRY）和2 個DASH 類型[17-18]。在藍關和紅光條件下，發(fā)現(xiàn)萊茵衣藻的動物類型隱花色素（aCRY）與調(diào)控細胞周期循環(huán)、節(jié)律調(diào)節(jié)、葉綠素及類胡蘿卜素合成等關鍵基因在轉(zhuǎn)錄水平上相關聯(lián)。隨著轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)的公開，在海洋真核綠藻（Ostreococcus tauri）中發(fā)現(xiàn)動物類型CRY（aCRY）[19-20]。

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是一株高產(chǎn)蝦青素的單細胞真核綠藻，在脅迫條件下蝦青素含量可達到細胞干質(zhì)量的4%[21]。相關研究表明，在藍光條件下，雨生紅球藻合成蝦青素相關基因高表達，蝦青素大量積累[22]。但是，這些基因被激活的作用機制尚不清楚。研究表明，在高等植物中，CRYs 光受體介導信號通路可調(diào)控植物體內(nèi)類胡蘿卜素合成[23-24]。但目前，尚未見雨生紅球藻中CRYs的克隆及功能研究相關報道。

本試驗以真核綠藻雨生紅球藻為研究對象，采用同源克隆的方法克隆雨生紅球藻植物類型CRY基因cDNA 序列，并對序列進行生物信息學分析，為Hae-P-CRY 基因的表達、功能、信號轉(zhuǎn)導通路及互作蛋白的研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料 試驗所用雨生紅球藻藻株Flotow 1844 購自藻類和原生生物培養(yǎng)中心，由山西農(nóng)業(yè)大學分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所藻種庫保存。培養(yǎng)條件為：光照強度25 μmol/（m2·s），溫度（22±1）℃，采用BG 11 液體[25]培養(yǎng)基于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。光周期設置為12 h/12 h 的光/暗周期。本試驗用LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌TOP 10。LB 培養(yǎng)基成分，包括10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 酵母萃取物，10 g/L NaCl，用5 mol/L NaOH 調(diào)至7.0～7.2，定容，高壓滅菌15～20 min。LB 固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基基礎上加入1.5%的瓊脂。

1.1.2 試劑 提取RNA 的試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RACE 試劑盒、PCR 試劑盒、DNA 片段回收試劑盒及測序載體（PMD-18T）等均購買于Takara 生物公司，瓊脂糖購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 儀器 SW-CJ-2D 超凈工作臺（上海博訊醫(yī)療生物儀器有限公司）、GTOP 光照培養(yǎng)箱（浙江托普儀器有限公司）、DYCP-31BN 核酸電泳儀（昆山廣測儀器設備有限公司）、VeriFlexTM 96 PCR 儀（上海愛測電子科技有限公司）、GelDox XR Bio 凝膠成像儀（上海艾研生物科技有限公司）、小型低溫高速離心機（上海繼普電子科技有限公司）、Nano Drop 2000 分光光度計（賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA 的提取 采用Takara 公司的RNA提取試劑盒，具體過程參考產(chǎn)品說明書，提取后的RNA 于-80 ℃保存。

1.2.2 模板的制備 包括普通cDNA 模板的制備和RACE 模板制備兩大類。普通模板的制備參照Takara 公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with Gdna Eraser 的cDNA 制備試劑盒說明書進行，包括基因組DNA 處理和反轉(zhuǎn)錄2 步。RACE 模板的制備參照Clontech 公司的SMARTerTMRACE cDNA Amplication Kit 的RACE 試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 引物設計 在比較基因組學分析的基礎上，根據(jù)與雨生紅球藻物種相近的4 株綠藻物種，分別為萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhartii）、團藻（Volvox carteri）、小球藻（Chlorella vulgaris）和膠球藻（Coccomyxa sp.C-169）隱花色素CRY 基因序列比對的結果，找出高度保守的氨基酸序列，用CODEHOP軟件設計兼并引物。根據(jù)同源克隆片段設計RACE引物，在獲得全長的基礎上設計表達框引物（表1），引物合成由上海生工生物工程公司完成。

表1 試驗所用引物序列

1.2.4 同源片段的獲得 以1.2.2 中制備的普通cDNA 為模板，結合設計的同源克隆引物，采用Takara 公司的Takara LA TaqR擴增體系進行PCR擴增。PCR 反應條件為：94 ℃5 min，1 個循環(huán)；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃60 s，30 個循環(huán)；72 ℃7 min，4 ℃保溫。循環(huán)結束后，取3 μL PCR 產(chǎn)物，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)引物位置確定目的條帶的大小，將可能的目的條帶進行回收，進行后續(xù)的連接、轉(zhuǎn)化及測序。

1.2.5 cDNA 全長的獲得 在獲得同源片段的基礎上，設計RACE 引物（表1），以1.2.2 中制備的RACE cDNA 為模板，根據(jù)試劑盒說明書進行兩段片段的PCR。產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測、連接、轉(zhuǎn)化及挑選陽性克隆測序。

1.2.6 生物信息學分析 Hae-P-CRY 基因cDNA全長序列通過軟件SeqMan software of DNAStar 7.1（DNASTAR Inc.，USA）拼接得到；序列翻譯和ORF的查找借助在線軟件（http：//www.bio-soft.net/sms/）進行。利用Clustal W 軟件[26]進行多序列比對分析。目的基因翻譯氨基酸的分子質(zhì)量、等電點（pI）和理化性質(zhì)采用ExPASy Compute pI/Mw tool 軟件預測。結構域分析通過在線SMART 和Pfam 軟件進行[27]，利用PhyML 中的ML（Maximum likehood）法構建系統(tǒng)進化樹。

2 結果與分析

2.1 雨生紅球藻總RNA 提取

獲得的總RNA 通過凝膠電泳進行完整性的檢測，從圖1 可以看出，出現(xiàn)3 種條帶，從上到下分別為28S、18S、5.8S rRNA，說明RNA 質(zhì)量較好，較為完整。通過NanoDorp 2000 微量分光光度計檢測，A260/A280在1.8～2.0，滿足試驗要求。

2.2 雨生紅球藻Hae-P-CRY 基因cDNA 序列的獲得

通過同源克隆和RACE 相結合的方法，獲得了雨生紅球藻中編碼隱花色素基因的cDNA 序列（Hae-P-CRY，NCBI 注冊號：MN073493）的全長。cDNA 全長3 608 bp，開發(fā)閱讀框2 988 bp，編碼區(qū)長度1 884 bp，編碼995 個氨基酸（圖2），5′- 非翻譯區(qū)（5′-UTR）長度為294 bp，3′- 非翻譯區(qū)（3′-UTR）長度為198 bp，并帶有poly（A）尾巴。通過Blast P程序分析，氨基酸序列與萊茵衣藻來源CRY 的相似性達到66.6%。

2.3 雨生紅球藻Hae-P-CRY 的理化性質(zhì)分析

利用ProtParam 軟件分析Hae-P-CRY 基本理化性質(zhì)。開放閱讀框翻譯的氨基酸預測分子質(zhì)量為107.7 ku，預測等電點為6.19。由20 種氨基酸組成，構成了總數(shù)為627 個氨基酸的蛋白，含量較高的氨基酸是丙氨酸（Ala，12.3%）、甘氨酸（Gly，9%）和脯氨酸（Pro，8.2%），含量較低的氨基酸是絲氨酸（Ser，8.0%）。其中含有人體內(nèi)必需氨基酸，如賴氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸等。

2.4 雨生紅球藻Hae-P-CRY 的二級結構分析

通過PORTER 軟件分析（圖3），獲得Hae-PCRY二級結構主要包括：α- 螺旋、β- 折疊、延伸鏈和無規(guī)則卷曲。其中，無規(guī)則卷曲所占比例最高，為48.94%；α- 螺旋、β- 折疊和延伸鏈分別占到35.08%、6.73%和9.25%。可以判定，Hae-P-CRY蛋白屬于混合型蛋白。

2.5 雨生紅球藻Hae-P-CRY 結構域和序列比對分析

利用SMART 和CDD 軟件分析了Hae-P-CRY中的保守結構域，結果表明，存在與Hae-P-CRY蛋白相關的結構域有脫氧核糖二嘧啶光裂解酶（Deoxyribodipyrimidine photolyase）和脫氧核糖核酸光解酶（DNA photolyase）相關結構域。運用Clustal W軟件對Hae-P-CRY氨基酸序列與高等植物、藻類的隱花色素進行了多序列比對分析。從圖4 可以看出，圖中的陰影面積較多，表明Hae-P-CRY 基因編碼的蛋白序列在不同植物和藻類中高度保守。在N端存在典型的保守光裂解酶（PHR）結構域，含有輔基MTHF 和FAD，主要負責光感知功能。

2.6 雨生紅球藻Hae-P-CRY 的起源和系統(tǒng)進化分析

通過NCBI 庫Blast P 比對分析發(fā)現(xiàn)，高等植物和部分藻類都存在隱花色素（CRY）。可見，CRY 分布較廣。為了進一步研究不同物種來源CRY 起源和系統(tǒng)進化，本研究運用MEGA 5.0 軟件將Hae-P-CRY與其他植物、細菌和藻類隱花色素的蛋白序列進行聚類分析，結果如圖5 所示。進化樹結果表明，聚類分為4 種：6-4 光裂解酶、CRY-DASH、CPD、植物型CRY。目的序列Hae-P-CRY與綠藻綱萊茵衣藻親緣關系最近，并且與模式植物擬南芥植物型CRY 聚為一支，同屬于植物類型CRY。它們之間在進化關系上可能存在共同的祖先。

3 討論

光不僅為真核微藻提供能量，而且作為重要的信號因子之一為它們提供信息，調(diào)節(jié)其生長發(fā)育過程[28]。真核微藻在漫長的進化過程中形成了一套精細而又復雜的光信號感知和轉(zhuǎn)導系統(tǒng)。細胞光感知與體內(nèi)其他信號轉(zhuǎn)導途徑相耦聯(lián)，共同調(diào)控多種生理過程。例如，高等植物擬南芥和模式綠藻萊茵衣藻中CRYs 的研究表明，CRYs 參與感知藍光同時調(diào)控多種生理過程的信號通路，為雨生紅球藻中研究CRYs 的功能提供了線索[12，17]。

通過同源克隆和RACE 結合方法獲得了雨生紅球藻中編碼植物類型隱花色素（Hae-P-CRY）基因的cDNA 序列全長。Hae-P-CRY蛋白序列與擬南芥來源AtCRY 的相似性達到46.94%，與萊茵衣藻來源CreCRY 的相似性達到66.6%，暗示該基因可能是雨生紅球藻中可能的編碼植物類型隱花色素的基因。隱花色素蛋白由N 端氨基酸序列與光合裂解酶（Photolyase-homologous region）N 端氨基酸存在極高的相似性，稱之為PHR 結構域，主要結合發(fā)色團輔基MTHF 和FAD，負責同源二聚化和光信號轉(zhuǎn)導[29-30]。C 端CCE 結構域較為特殊，因物種進化之間的差異，序列存在多樣性，但是含有植物典型的DAS（DQXVP-Acidic-STAESS），功能主要表現(xiàn)在隱花色素調(diào)控植物生長發(fā)育[31]。大多數(shù)植物隱花色素CCE 結構域要比動物隱花色素CCE 結構域長，擬南芥CRY-DASH/CRY3 蛋白缺失了CCE 保守結構域。擬南芥CRY1 和CRY2 的CCE 結構域分別大約有180、110 個氨基酸殘基[32]。本研究所預測的Hae-P-CRY蛋白CCE 結構域氨基酸殘基有140 個，介于擬南芥CRY1 和CRY2 之間。結構域分析表明，在Hae-P-CRY中同樣存在上述2 個保守結構域，進一步暗示這個基因編碼CRY 蛋白。通過進化樹分析發(fā)現(xiàn)，Hae-P-CRY蛋白序列與萊茵衣藻、擬南芥一型隱花色素聚為一支，預示著在進化關系上，它們可能存在共同的祖先。

總而言之，上述研究結果為雨生紅球藻中Hae-P-CRY 的基因表達研究和確定其功能奠定了基礎。同時保守結構域的分析為藍光信號感知和轉(zhuǎn)導機制提供了依據(jù)，并將有助于研究CRY 在藍光信號通路中相關調(diào)控因子的作用機制。例如，雨生紅球藻是天然蝦青素的理想來源，也是目前制備蝦青素的首選藻種。多種研究表明，高藍光可有效誘導其蝦青素的合成與積累，調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，但具體分子機制并不清楚。雨生紅球藻中CRY 基因的表達模式如何？是否具有功能？在藍光誘導下，體內(nèi)的CRY 如何感知和轉(zhuǎn)導藍光信號，并如何與其他已知的蛋白（COP1 和CIBI 等）互作？互作之后通過何種途徑激活下游轉(zhuǎn)錄因子的表達從而啟動雨生紅球藻中蝦青素合成相關基因的表達，最終合成并積累蝦青素，這些問題都有待進行研究。目前，由于有關CRY 的研究主要以高等植物擬南芥為主，CRY 介導的光信號轉(zhuǎn)導路徑中的許多疑問沒有解決，更多參與CRY 響應藍光信號的轉(zhuǎn)錄因子有待進一步發(fā)現(xiàn)。雨生紅球藻中CRY 基因的同源克隆和生物信息學分析對于今后更深入系統(tǒng)地研究CRY 蛋白響應藍光的分子機制有一定的參考價值。

4 結論

本研究獲得了雨生紅球藻中植物型隱花色素（CRY）的cDNA 全長序列并進行了生物信息學分析。結果表明，Hae-P-CRY 的開放閱讀框全長為2 988 bp，編碼995 個氨基酸，預測的等電點為6.19，理論分子質(zhì)量為107.7 ku。與擬南芥來源CRY的相似性達到46.94%，與萊茵衣藻來源CRY 的相似性達到66.6%。CRY 蛋白的典型結構域存在于Hae-P-CRY 中，包括PHR 和CCE。高等植物和真核綠藻來源CRYs 屬于共同祖先。首次從雨生紅球藻中獲得編碼CRY 的基因序列，存在與高等植物CRY相似的結構域，暗示其作用機制與高等植物類似，為下一步雨生紅球藻中CRY 的表達和功能研究奠定基礎，同時為解析藍光調(diào)控雨生紅球藻蝦青素合成的分子機制提供線索。