張 昕 昱， 周 海 龍， 李 麗 麗， 李 憲 臻， 楊 帆

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034； 2.中國(guó)生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)， 北京 100833 )

0 引 言

多不飽和脂肪酸(PUFAs)是指碳鏈長(zhǎng)度為18～22個(gè)碳原子并含有兩個(gè)或兩個(gè)以上順式雙鍵的直鏈脂肪酸[1]。PUFAs是人體所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有抗炎癥、抗腫瘤、提高免疫力、調(diào)節(jié)血脂、預(yù)防心血管疾病等多種生理功能[2]，對(duì)維持人類健康起著至關(guān)重要的作用[3]。然而，人體無法從頭合成PUFAs，需要通過從外界攝入PUFAs來維持正常的生理需求[4]。

目前，食用PUFAs主要來源于深海魚類、微藻和植物種子[5-6]。但由于環(huán)境資源的限制以及油脂中PUFAs豐度較低，從生物中獲取PUFAs無法滿足目前的市場(chǎng)需求[7]。因此，亟須開發(fā)生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的新來源。國(guó)內(nèi)外研究者逐漸將目光放在借助代謝工程的手段改造單細(xì)胞微生物來生產(chǎn)多不飽和脂肪酸[8-9]。近年來，國(guó)內(nèi)外研究人員相繼通過對(duì)釀酒酵母進(jìn)行代謝工程改造使其實(shí)現(xiàn)多不飽和脂肪酸的合成[10-11]。然而，由于底物分歧、中間產(chǎn)物競(jìng)爭(zhēng)以及脂肪酸低耐受性等原因，已報(bào)道的釀酒酵母重組菌株均無法高水平生產(chǎn)多不飽和脂肪酸[12-13]。

磷脂酸磷酸酶(EC 3.1.3.4，PAP)是一類重要的去磷脂酸酶，通過其自身的去磷酸化活性來調(diào)節(jié)三酰甘油(TAG)合成途徑中磷脂PA向二酰甘油(DAG)的轉(zhuǎn)變[14]。有研究表明，磷脂酸磷酸酶的缺失會(huì)降低釀酒酵母細(xì)胞對(duì)外源脂肪酸的耐受性[15]。本實(shí)驗(yàn)克隆獲得釀酒酵母磷脂酸磷酸酶的編碼基因PAH1，構(gòu)建PAH1的釀酒酵母過表達(dá)菌株，以期為理性改造釀酒酵母使能夠耐受高濃度脂肪酸提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

釀酒酵母S.cerevisiaeBY4741及表達(dá)載體pYX212，美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司(Invitrogen)；大腸桿菌E.coliDH10B及pMD18-T Simple Vector，獲贈(zèng)于大連化學(xué)物理研究所趙宗保研究員課題組。PrimeSTAR HS DNA Polymerase、250 bp DNA Marker、限制性內(nèi)切酶，大連寶生物有限公司。

酵母發(fā)酵液體培養(yǎng)基YPD：葡萄糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，pH 6.0；固體YPD培養(yǎng)基：瓊脂粉15.0 g/L，其余同YPD液體培養(yǎng)基。產(chǎn)油培養(yǎng)基：葡萄糖100 g/L，酵母浸粉0.5 g/L，KH2PO44 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，NH4Cl 0.25 g/L，痕量元素溶液1 000 μL每100 mL 培養(yǎng)基，pH 6.0。痕量元素溶液：CaCl2·H2O 4 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.55 g/L，水合檸檬酸0.52 g/L，ZnSO4·7H2O 0.1 g/L，MnSO4·H2O 0.076 g/L，硫酸180 mmol/L。LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，pH 7.0；LB固體培養(yǎng)基：瓊脂粉15.0 g/L，其余同LB液體培養(yǎng)基。

Eppendorf PCR儀、Eppendorf AG22331電擊融合儀，德國(guó)艾本德股份有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

磷脂酸磷酸酶的編碼基因PAH1的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建所用引物均由大連寶生物有限公司合成。所使用的引物序列及功能如表1所示。

表1 引物序列及功能Tab.1 Sequences and functions of primers

1.2.2 磷脂酸磷酸酶的編碼基因PAH1的克隆

取搖床培養(yǎng)24 h的釀酒酵母新鮮發(fā)酵菌液，于4 ℃、4 000 r/min離心收集菌體，提取基因組DNA并以之為模板進(jìn)行磷脂酸磷酸酶的編碼基因PAH1的擴(kuò)增?；驍U(kuò)增上游引物為PAH1-F，下游引物為PAH1-R。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收。將回收的PAH1基因片段通過TA克隆連接至pMD18-T Simple Vector構(gòu)建質(zhì)粒pT-PAH1并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 磷脂酸磷酸酶的編碼基因PAH1表達(dá)載體的構(gòu)建

以質(zhì)粒pT-PAH1為模板，利用引入酶切位點(diǎn)的引物PAH1-F1和PAH1-R2進(jìn)行帶有酶切位點(diǎn)的編碼基因的擴(kuò)增。將回收后的擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pYX212進(jìn)行雙酶切，將回收的酶切片段與質(zhì)粒按照濃度比1∶3進(jìn)行16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含終濃度100 μg/mL氨芐西林的LB平板，挑選陽性克隆并測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.4 過表達(dá)釀酒酵母菌株P(guān)AH1的構(gòu)建

將鑒定正確表達(dá)質(zhì)粒pYX-PAH1電擊轉(zhuǎn)化至S.cerevisiaeBY4741感受態(tài)細(xì)胞中，電壓為1.5 kV。電擊結(jié)束后，轉(zhuǎn)化菌液于30 ℃溫育2 h后將轉(zhuǎn)化菌液涂布于篩選平板上，30 ℃培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。挑取陽性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒DNA并進(jìn)行酶切鑒定。于37 ℃酶切反應(yīng)2 h。鑒定正確的重組釀酒酵母命名為BY-PAH。

1.2.5 過表達(dá)釀酒酵母菌株P(guān)AH1油脂含量分析

將釀酒酵母重組菌BY-PAH接種于10 mL YPD培養(yǎng)基，于30 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)24 h。以接種量2%接于100 mL產(chǎn)油培養(yǎng)基(分別含有0.25和1 mmol/L C16：1以及0.1% Triton X-100)，發(fā)酵72 h。8 000g離心5 min收集菌體，烘干、稱重，計(jì)算干菌體質(zhì)量。在干菌中加入4 mol/L鹽酸4 mL，78 ℃消化1 h。每管消化液加入8 mL體積比1∶1的氯仿-甲醇溶劑，30 ℃ 振蕩混勻2 h；8 000g離心5 min，抽取下層有機(jī)相，加入8 mL 0.1%氯化鈉，振蕩混勻后8 000g離心5 min，抽提下層有機(jī)相采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行油脂收集，稱重，計(jì)算細(xì)胞油脂含量。以油脂質(zhì)量/菌體干重(g/g)表示油脂含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 磷脂酸磷酸酶編碼基因PAH1的克隆

以釀酒酵母基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增磷脂酸磷酸酶的編碼基因PAH1，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。在2.5 kb附近擴(kuò)增出一條特異性條帶，大小與磷脂酸磷酸酶的基因片段一致。將回收的PCR產(chǎn)物送至上海生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如圖2所示。經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，證明為磷脂酸磷酸酶的編碼基因，大小為2 589 bp，PAH1基因編碼的磷脂酸磷酸酶含有862個(gè)氨基酸殘基，理論分子質(zhì)量為95 029 u。該磷酸酶催化結(jié)構(gòu)域(灰色部分)隸屬于SMP2家族。

M，DNA marker； PAH1，目的條帶

圖1 PCR擴(kuò)增磷脂酸磷酸酶基因的電泳驗(yàn)證結(jié)果

Fig.1 The electrophoresis results ofPAH1 coding gene fragment

2.2 PAH1表達(dá)載體及菌株的構(gòu)建

為了構(gòu)建釀酒酵母磷脂酸磷酸酶編碼基因PAH1的表達(dá)載體，利用酶切連接策略將PAH1基因連接到表達(dá)載體pYX212上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH10B感受態(tài)細(xì)胞中。挑取陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取。對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切驗(yàn)證。如圖3所示，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后顯示有大小為2 329、2 784、5 826 bp 3條特異性條帶，與預(yù)測(cè)正確重組質(zhì)粒的酶切結(jié)果基本一致。將酶切鑒定正確的質(zhì)粒送上海生工測(cè)序，結(jié)果表明，成功構(gòu)建了磷脂酸磷酸酶表達(dá)載體pYX-PAH1。

催化結(jié)構(gòu)域用灰色突出顯示，“*”代表磷酸化修飾位點(diǎn)，黑色突出部分和“·”代表底物結(jié)合位點(diǎn)圖2 PAH1氨基酸序列測(cè)序結(jié)果分析Fig.2 Structural analysis of the amino acid sequence of PAH1

M，DNA marker；1，重組質(zhì)粒酶切條帶圖3 重組質(zhì)粒pYX-PAH1的酶切驗(yàn)證電泳圖Fig.3 The electrophoresis results of the digested recombinant plasmid pYX-PAH1

將表達(dá)載體pYX-PAH1轉(zhuǎn)化至S.cerevisiaeBY4741感受態(tài)細(xì)胞中，30 ℃靜置培養(yǎng)，挑取陽性克隆提取重組質(zhì)粒并進(jìn)行PCR鑒定。電泳結(jié)果表明，擴(kuò)增獲得的DNA條帶與理論P(yáng)CR驗(yàn)證DNA產(chǎn)物大小基本一致。該結(jié)果表明成功構(gòu)建了磷脂酸磷酸酶的釀酒酵母表達(dá)菌株BY-PAH。

將構(gòu)建成功的表達(dá)菌株BY-PAH與帶有質(zhì)粒pYX212的釀酒酵母BY4741在同樣的培養(yǎng)條件下發(fā)酵。對(duì)發(fā)酵所得菌體進(jìn)行處理得到粗酶液。進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖4所示。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，在90～117 ku有一個(gè)明顯的特異性條帶。PAH1蛋白的理論分子質(zhì)量為95 029 u，而釀酒酵母會(huì)對(duì)蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，所以PAH1蛋白的實(shí)際分子質(zhì)量會(huì)偏高。該結(jié)果表明重組菌株BY-PAH成功表達(dá)了PAH1。

2.3 過表達(dá)磷脂酸磷酸酶的釀酒酵母重組菌株產(chǎn)油能力分析

將過表達(dá)磷脂酸磷酸酶的釀酒酵母重組菌BY-PAH先接種于YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min的條件下培養(yǎng)24 h，以2%的接種量于100 mL產(chǎn)油發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min的條件下發(fā)酵72 h，發(fā)酵結(jié)束后對(duì)胞內(nèi)油脂含量進(jìn)行測(cè)定。如表2所示，與對(duì)照菌株相比，過表達(dá)磷脂酸磷酸酶的釀酒酵母重組菌的油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高了49%。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，磷脂酸磷酸酶的過表達(dá)有效加強(qiáng)了TAG合成途徑中磷脂PA向DAG的轉(zhuǎn)變。DAG是TAG合成的前體，因此磷脂酸磷酸酶高水平達(dá)標(biāo)直接影響了TAG的合成，有助于釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)油脂的積累。

M，蛋白marker；1，對(duì)照組；2，實(shí)驗(yàn)組

圖4 重組菌株BY-PAH蛋白表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖

Fig.4 SDS-PAGE electropherogram of protein expression in recombinant strain BY-PAH

表2 外加棕櫚油酸對(duì)重組釀酒酵母BY-PAH胞內(nèi)油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

Tab.2 Effect of palmitoleic acid on lipid accumulation ofS.cerevisiaerecombinant strain BY-PAH

c(棕櫚油)/(mmol·L-1)w(胞內(nèi)油脂)/%BY-PAH對(duì)照菌株015.4±0.310.3±1.80.2526.7±5.031.1±4.21.038.5±2.232.9±2.8

2.4 過表達(dá)磷脂酸磷酸酶的釀酒酵母重組菌株脂肪酸耐受性分析

在產(chǎn)油培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后分別添加0.25 和1 mmol/L的棕櫚油酸及0.1% Triton X-100，于30 ℃、200 r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h，發(fā)酵終點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行胞內(nèi)油脂含量的測(cè)定。

如表2所示，當(dāng)棕櫚油酸添加濃度為0.25 mmol/L 時(shí)，對(duì)照菌株BY4741和重組菌株BY-PAH的胞內(nèi)油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為31.1%和26.7%。當(dāng)棕櫚油酸添加濃度提高到1 mmol/L時(shí)，對(duì)照菌株BY4741和重組菌株BY-PAH的胞內(nèi)油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為32.9%和38.5%。表明培養(yǎng)基中棕櫚油酸濃度的升高對(duì)對(duì)照菌株BY4741胞內(nèi)油脂積累并無顯著影響，而隨著外加棕櫚油酸濃度的增加，重組菌BY-PAH的胞內(nèi)油脂含量隨之增加。當(dāng)外加棕櫚油酸濃度為1 mmol/L 時(shí)，與對(duì)照組相比，重組菌積累了更多的油脂，說明磷脂酸磷酸酶通過其自身的去磷酸化活性能夠?qū)⒏嗟闹舅嵴系礁视腿AG上，使得釀酒酵母對(duì)脂肪酸有更高的耐受性。

3 結(jié) 論

以釀酒酵母為出發(fā)菌株，從中克隆出磷脂酸磷酸酶編碼基因PAH1，并通過構(gòu)建表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)了釀酒酵母中PAH1的過表達(dá)。當(dāng)重組菌限氮發(fā)酵72 h時(shí)，其胞內(nèi)油脂含量與出發(fā)菌株BY4741相比有顯著性提高。同時(shí)，通過在產(chǎn)油培養(yǎng)基中添加外源脂肪酸棕櫚油酸，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)磷脂酸磷酸酶的重組釀酒酵母胞內(nèi)油脂含量顯著提高。該結(jié)果表明磷脂酸磷酸酶通過將更多的脂肪酸整合到TAG上，使釀酒酵母獲得較高的脂肪酸耐受性。本工作所取得的研究結(jié)果為今后理性改造釀酒酵母、構(gòu)建高產(chǎn)多不飽和脂肪酸工業(yè)化菌株打下基礎(chǔ)。