王 丹，陳鳳嬌，湯青霞，張為國 綜述，李小松 審校

(1.重慶市榮昌區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，重慶 402460；2.重慶醫(yī)科大學感染性疾病分子生物學教育部重點實驗室，重慶 400016；3.中國科學院重慶綠色智能技術(shù)研究院，重慶 400714；4.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院臨床分子醫(yī)學檢測中心，重慶 400016)

2016年，國家癌癥中心赫捷院士團隊在國際頂級期刊CACancerJClin雜志在線發(fā)表了2015年中國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)顯示，2015年我國累計新發(fā)癌癥病例429.2萬，死亡病例281.4萬[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，2018年全球每年新發(fā)癌癥患者近2 000萬，其中肝癌患者近100萬[2]。ARZUMANYAN等[3]學者研究報道，全球累計20億人曾感染過乙型肝炎病毒(HBV)，目前我國HBV攜帶者9 000余萬，每年因HBV感染所引發(fā)的死亡病例近50萬。

目前，人類最主要的死亡原因仍是惡性腫瘤。肝細胞癌(HCC)是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，肝癌的發(fā)生、發(fā)展與病毒感染、乙醇、糖尿病、遺傳、馬兜鈴酸和黃曲霉素等飲食毒素具有一定的關(guān)系，其中肝炎的活動與肝硬化和肝癌的發(fā)生密切相關(guān)，我國約80%的肝癌患者都與肝炎病毒的感染相關(guān)，其中和乙型肝炎病毒感染相關(guān)的達50%。目前，肝癌最有效的治療方法是手術(shù)切除和肝移植，但術(shù)后的復發(fā)和轉(zhuǎn)移較高，嚴重影響了肝癌患者的治療效果[4-5]。HCC的診斷主要依賴于血清標志物篩查、穿刺活檢和影像學檢查等，但針對小于2 cm的病變，影像學檢查的靈敏度和特異度均較低；此外近1/3肝癌患者的血清標志物甲胎蛋白無明顯改變[6]。目前，常規(guī)檢測方法所診斷的肝癌患者多處于中晚期，不利于肝癌的早期篩查和診斷。隨著精準醫(yī)療時代的到來，精準檢測技術(shù)和方法得到了迅猛的發(fā)展，特別是近年來“液體活檢”技術(shù)的變革性發(fā)展[7]，為臨床疾病的個體化診療開辟了新的天地。循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)是當前液體活檢的重要標志物之一。CTCs是指原發(fā)或轉(zhuǎn)移性腫瘤自發(fā)脫落或外源因素誘導脫落進入外周血液循環(huán)系統(tǒng)中的腫瘤細胞[8]。其實早在100多年前澳大利亞著名科學家ASHWORTH教授就發(fā)現(xiàn)外周血液循環(huán)系統(tǒng)中存在與某特定原發(fā)腫瘤細胞相類似的細胞，并首次提出和闡釋了CTCs的概念。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者外周血液循環(huán)系統(tǒng)中的CTCs常以成簇或單個游離的形式存在，而成簇的CTCs多為腫瘤轉(zhuǎn)移的“種子”[9]。隨著分子診斷技術(shù)的日新月異和新型腫瘤標志物的發(fā)現(xiàn)，CTCs的優(yōu)勢逐漸得以體現(xiàn)，由于CTCs具有完整的細胞形態(tài)和功能，不但可提供原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶腫瘤的生物信息(基因突變信息、蛋白質(zhì)組學和代謝組學信息等)，還可為下游的細胞實驗和表征分析提供現(xiàn)實基礎(chǔ)，因此，CTCs具有廣泛的應用前景。CTCs的分選與培養(yǎng)可廣泛應用于腫瘤患者的早期篩查、輔助診斷、預后判斷、療效評估、復發(fā)轉(zhuǎn)移和耐藥評估[10]。CTCs常存在于腫瘤患者的外周血液循環(huán)系統(tǒng)中，而在健康人群或其他非腫瘤疾病人群的外周血液循環(huán)系統(tǒng)中不能檢測到。來源于腫瘤病灶的CTCs多與原發(fā)腫瘤具有相似甚至相同的病理特征，捕獲到的CTCs可直接反映原發(fā)腫瘤的病理學特征[11]。見圖1。

圖1 CTCs產(chǎn)生與播散示意圖

目前，腫瘤確診的“金標準”仍是組織病理學和細胞病理學，但該方法存在創(chuàng)傷性大、取材困難、無法連續(xù)監(jiān)測疾病進展等缺點。而液態(tài)活檢技術(shù)(如外周血CTCs、ctDNA等)具有無創(chuàng)、實時、方便、快捷且能持續(xù)監(jiān)測疾病進程、判斷和評估患者預后和復發(fā)等優(yōu)點，因而具有廣泛的應用前景[12-16]。CTCs是腫瘤實現(xiàn)侵襲和轉(zhuǎn)移的最初階段，并為最終形成腫瘤轉(zhuǎn)移灶提供了“種子”，是患者無進展生存期和總生存期的獨立預測因子，其計數(shù)常被應用于各腫瘤的預后判斷和療效評估。

近年來，在精準醫(yī)療概念的推動下，CTCs逐漸被認為是一種新型的腫瘤標志物，關(guān)于CTCs的臨床應用研究呈爆發(fā)式增長[17]。研究表明，腫瘤患者外周血中CTCs數(shù)量稀少、半衰期短、容易降解，常規(guī)分選技術(shù)很難捕獲到外周血液循環(huán)系統(tǒng)中全周期、完整的CTCs；目前基于CTCs的研究多集中于探尋其特異性標志物以期提高檢測的靈敏度和特異度[18-19]。CTCs廣泛應用于實體瘤的微轉(zhuǎn)移、術(shù)后復發(fā)監(jiān)測、療效評估、預后判斷及個體化靶向治療。CTCs檢測陽性患者的無進展生存期和總生存期顯著低于CTCs陰性患者，在經(jīng)過有效治療后CTCs數(shù)量呈明顯下降趨勢，在實時監(jiān)測腫瘤療效和復發(fā)轉(zhuǎn)移方面具有獨特的優(yōu)勢。原發(fā)性肝癌形成的早期階段，腫瘤細胞可從原發(fā)灶脫落并進入外周血液循環(huán)系統(tǒng)，促使腫瘤的肝內(nèi)和肝外轉(zhuǎn)移；如果能在脫落的早期階段檢測到外周血液循環(huán)系統(tǒng)中的腫瘤細胞，將對HCC的早期篩查、鑒別診斷、治療方案選擇、療效評估及腫瘤轉(zhuǎn)移等方面提供一種全新的非侵入性方法[20]。

1 CTCs的分離與富集

外周血液循環(huán)系統(tǒng)中的CTCs數(shù)量極其稀少，僅占外周血白細胞數(shù)量的1/107～1/106，同時，由于腫瘤細胞異質(zhì)性的存在，針對CTCs檢測方法的特異度和靈敏度要求較高。如何分離和鑒定外周血液循環(huán)系統(tǒng)中的CTCs成為當前CTCs檢測方法學中的研究熱點。目前多采取高效的分離與富集方法來捕獲外周血液循環(huán)系統(tǒng)中數(shù)量極其稀少的CTCs，再將獲取的CTCs進行分析和鑒定，以期為臨床的精準診療提供重要的參考依據(jù)。

1.1密度梯度離心技術(shù) 密度梯度離心技術(shù)是根據(jù)血液中各細胞密度的差異，在外周血中加入特定的分離液后進行離心，CTCs懸浮于分離液上方，從而將血液中的CTCs分離出來。該方法在富集CTCs方面具有廉價、有效的顯著特點，但方法學本身的局限性依然明顯。由于分離液與血液相互摻雜，會導致部分CTCs的損失，從而影響CTCs的檢出限和檢出率，即影響CTCs檢測的靈敏度。

1.2過濾技術(shù) 過濾技術(shù)是指使用腫瘤上皮細胞與外周血液循環(huán)系統(tǒng)中的血細胞體積不同的原理，采用8 μm孔徑的過濾器將外周血中體積較小的淋巴細胞和中性粒細胞過濾掉，而腫瘤細胞因體積較大滯留在過濾器上。該方法的顯著優(yōu)點是操作非常簡單，并且可以避免由多步分離引起的稀有細胞的破壞和丟失；通過該方法分離的CTCs的形態(tài)和結(jié)構(gòu)均能夠保持一定的完整性，有利于后續(xù)分析或臨床應用研究。其缺點是一些體積較大的白細胞很容易與腫瘤細胞混合，不易分離導致假陽性或CTCs數(shù)量偏高；而一些體積較小的CTCs很容易被過濾掉導致假陰性或CTCs數(shù)量偏低。因此，該方法的靈敏度和特異度均存在一定的問題[21]。

1.3免疫磁珠富集技術(shù) 免疫磁珠富集技術(shù)是唯一被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準用于臨床檢測CTCs的方法，該方法分為陽性分選和陰性分選。陽性分選方法是將上皮細胞黏附分子(EpCAM)抗體包被在磁珠上，該磁珠可與表達EpCAM抗原的腫瘤細胞進行特異性結(jié)合，并在磁場引力作用下將血液中EpCAM表達呈陽性的腫瘤細胞與EpCAM表達呈陰性的非腫瘤細胞進行分離。陰性分選方法是首先采用離心的方法去除大部分血漿和所有紅細胞，再將白細胞表面抗原CD45包被在分選磁珠上，該磁珠可與剩余血漿中的白細胞結(jié)合形成磁珠-白細胞復合物，在磁場引力作用下將白細胞去除，從而富集余下的腫瘤細胞[22]。近年來我國學者在此理論基礎(chǔ)上進行改良，通過EpCAM聯(lián)合CK8免疫磁珠的方法可有效提高非小細胞肺癌CTCs的檢出效率[23]。

1.4流體硅芯片技術(shù) 美國麻省總醫(yī)院癌癥中心與強生公司于2007年合作開發(fā)了一種高靈敏度的CTCs檢測微流體硅芯片(CTC-Chip)。該芯片表面密集覆蓋著近8萬個含EpCAM抗體的微位點。此方法在理論上能在10億個以上的血細胞中檢出單個腫瘤細胞，但目前僅應用于科學研究，尚未臨床實踐。CTC-Chip于2010年成功升級為HB-Chip(herringbone-chip)。作為第2代技術(shù)，HB-Chip可捕獲血液樣本中90%以上的腫瘤細胞，其分離效率顯著提高，較CTC-Chip提高了25%；同時HB-Chip還可捕捉到CTC-Chip或其他CTCs分離技術(shù)從未發(fā)現(xiàn)過的循環(huán)腫瘤微栓子(CTM)，對CTM的深入研究將有助于進一步解析腫瘤轉(zhuǎn)移的分子病理機制。HB-Chip兼容了傳統(tǒng)的病理學檢查方法，可直觀地識別腫瘤細胞，一次檢測的血液樣本通量更大，可廣泛運用于臨床的大規(guī)模應用研究。該團隊于2013年又開發(fā)出了第3代技術(shù)，稱為iChip(inertial focusing-chip)；該技術(shù)通過流體力的作用將細胞與柱子對齊，通過流體動力學分選來去除最少的血液成分，然后再使用陽性選擇方法去除淋巴細胞，最后收集剩下的目標細胞。該技術(shù)實際上完美結(jié)合了物理和免疫分離方法，大大提高了對CTCs的分離效果和效率，每小時可處理20 mL血液，通過該方法富集未標記的CTCs，保持了腫瘤細胞的完整性和活性，為下游的細胞培養(yǎng)和表征分析提供了重要支撐。

1.5納米基板技術(shù) 納米基板技術(shù)是指在CTC芯片中嵌入尺寸依賴性過濾和可降解的納米結(jié)構(gòu)基板，該技術(shù)可顯著提高CTCs的分離效率。由于腫瘤細胞表面存在大量偽足和微絨毛，可大大增加腫瘤細胞的表面積；通過利用腫瘤細胞與納米材料的強附著力來實現(xiàn)CTCs的高效捕獲和分離[24-25]。

1.6微流控技術(shù) 微流控技術(shù)檢測CTCs是指在微米級通道內(nèi)進行流體控制以實現(xiàn)CTCs的分離富集和篩選，作為近年來發(fā)展起來的一種分子診斷新興技術(shù)[26]，具有自動化、集成化、高通量和速度快等顯著優(yōu)點。微流控技術(shù)檢測CTCs可顯著提高其富集效率和純度，目前微流控技術(shù)根據(jù)其分離原理分為兩大類。一是基于CTCs物理屬性的分離方法，該方法主要是根據(jù)CTCs的體積大小、密度和介電性等存在的差異進行分離和富集，通量高且免細胞標記；二是基于CTCs表面標志物的特征設(shè)計芯片基底表面的修飾分子和腫瘤細胞表面的靶標分子進行高效而特異的結(jié)合。

上述方法均可用于CTCs的分離和富集，但目前仍沒有一種方法可以兼具高效、高特異度和高靈敏度的特點，篩選到不同腫瘤類型患者不同分期的CTCs。CTCs的分離富集技術(shù)具有各自的優(yōu)缺點，見表1。

表1 CTCs分離富集技術(shù)對比分析

2 CTCs的分析與鑒定

從數(shù)以億計的血細胞中分離富集到含量稀少的CTCs后，還需對其進行臨床病理分析和鑒定，以期為腫瘤的精準診斷和治療提供重要的依據(jù)。目前，主要采取PCR技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、流體芯片技術(shù)和流式細胞技術(shù)等CTCs的分析與鑒定。

2.1基于PCR技術(shù)分析與鑒定CTCs PCR方法可以特異性擴增腫瘤患者腫瘤驅(qū)動基因的DNA，并通過實時熒光定量PCR方法檢測腫瘤細胞的mRNA表達情況。該方法具有高靈敏度和快捷方便的顯著特點，可檢測鑒定出人體外周血液循環(huán)系統(tǒng)中含量稀少的腫瘤細胞，但對實驗條件和實驗操作要求較高，容易污染，同時由于PCR的高靈敏度可能產(chǎn)生非特異性擴增，導致假陽性結(jié)果產(chǎn)生[27]。

2.2基于流式細胞技術(shù)分析與鑒定CTCs 流式細胞技術(shù)充分結(jié)合了激光、計算機、電物理、光電子測量、細胞熒光化學及單克隆抗體等技術(shù)，該方法將熒光標記的單克隆抗體與腫瘤細胞表面特異表達的抗原進行特異性結(jié)合，進而檢測腫瘤患者外周血液循環(huán)系統(tǒng)中的腫瘤細胞。該方法具有較高的通量和靈敏度，其檢測腫瘤細胞的靈敏度高達1/105～1/104；但該技術(shù)對儀器和設(shè)備的要求較高，試劑成本較昂貴，對實驗人員的操作要求較高[28]。

2.3基于流體芯片技術(shù)分析與鑒定CTCs 流體芯片技術(shù)分析與鑒定CTCs是近年來得到迅猛發(fā)展的一項新型分子診斷技術(shù)，具有速度快、靈敏度高等顯著特點，同時能更好地保持CTCs的體外生物活性。該方法可將大約8萬個涂有EpCAM抗體的微陣列柱分布在標準載玻片上，經(jīng)乙二胺四乙酸處理的腫瘤患者外周血樣品通過搖動混勻裝置混合后可通過氣動泵輸入芯片，以此提高捕獲效率。使用抗CK、4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和CD45進行免疫熒光標記，并將CK陽性、DAPI陽性和CD45陰性的細胞視為CTCs，可實現(xiàn)CTCs的原位定性及定量檢測。目前，該方法仍處于科學研究階段，隨著技術(shù)的改良與發(fā)展，將逐漸走向臨床，為腫瘤的精準診療提供重要的技術(shù)支撐。

2.4基于上皮細胞免疫斑點技術(shù)分析與鑒定CTCs 上皮細胞免疫斑點技術(shù)是一種基于抗原抗體反應的方法，用于定量檢測具有生物活性的CTCs。該方法的原理是利用富集的CTCs在培養(yǎng)基中分泌特定蛋白質(zhì)，再使用熒光標記的分泌蛋白抗體，與CTCs進行孵育以使抗體與蛋白質(zhì)特異性結(jié)合，最后通過熒光顯微鏡觀察，每個著色的斑點就代表一個CTC，該方法具有高特異度和高穩(wěn)定性的顯著特點，但易受主觀因素的影響[29]。

2.5基于免疫熒光染色技術(shù)分析與鑒定CTCs 免疫熒光染色技術(shù)固定富集的細胞后，用抗CD45、角蛋白熒光抗體和DAPI熒光染料染色細胞，并用熒光顯微鏡進行分析。這也是目前最常用的方法。CellSearch是2004年第一批被美國FDA批準用于臨床CTCs的檢測方法。CellSearch系統(tǒng)理論上適用于檢測所有上皮來源的惡性腫瘤，但是實際上它并不適用于HCC的CTCs富集。HCC是一種起源于肝細胞的上皮惡性腫瘤，但 EpCAM表達水平較低(約35%)，而且，EpCAM也被認為是癌癥干細胞標志物，而不是HCC的通用標志物[30]。

2.6基于熒光原位雜交技術(shù)分析與鑒定CTCs 熒光原位雜交技術(shù)是20世紀80年代在放射性原位雜交技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性分子生物學和細胞遺傳學結(jié)合的新技術(shù)，是以熒光標記取代同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法。該方法不僅可以檢測CTCs的表面和內(nèi)部標志物，還可以檢測到細胞的核型。將異倍體陽性、表面EpCAM陽性和DAPI陽性的細胞視為CTCs。通過熒光原位雜交技術(shù)可檢測到前列腺癌患者CTCs中AR、PTEN和TMPRSS2-ERG等基因表達的變化，揭示CTC表面標志物和組織活檢之間的高度一致性。熒光原位雜交技術(shù)可用于CellSearch免疫磁珠富集和分離后的CTCs中AR和MYC狀態(tài)的測定。

上述方法均可用于CTCs的分析和鑒定，但目前仍沒有一種方法可以兼具高效、高特異度和高靈敏度的特點，鑒定出不同腫瘤類型患者不同分期的CTCs。CTCs的分析鑒定技術(shù)具有各自的優(yōu)缺點，見表2。

表2 CTCs分析鑒定技術(shù)對比分析

3 CTCs在肝癌精準診療中的應用

隨著液體活檢技術(shù)特別是CTCs的分離富集和分析鑒定技術(shù)的日趨成熟，CTCs的陽性率、數(shù)量與分子特征在肝癌的早篩早診、預后判斷、療效評估及精準治療等方面取得了一些進展。

3.1早篩早診 目前，用于肝癌早篩和早診的方法多為血清學腫瘤標志物[甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)或癌抗原19-9(CA19-9)]或影像學檢查(超聲或CT)，其確診的“金標準”仍是病理組織活檢技術(shù)。但腫瘤標志物檢測特異度較低，影像學檢查也只能鑒定出大于1 cm的腫瘤病灶，同時，人體器官的蠕動及病變位置的隱蔽性等因素都會影響檢測的準確性。肝癌組織活檢取材部位和時機及腫瘤的異質(zhì)性等因素也會影響其早期診斷。CTCs的數(shù)量和表型對肝癌的早期篩查和診斷具有重要的意義，CTCs的數(shù)量與標準的巴塞羅那(BCLC)分期及血清腫瘤標志物AFP水平間存在顯著的正相關(guān)性[31]。有研究發(fā)現(xiàn)，即使血清腫瘤標志物AFP陰性的早期肝癌患者也會檢測到CTCs[32]。近年來有學者利用CTCs結(jié)合數(shù)學建模的方法來提高肝癌的早期篩查和診斷[33]。CTCs的陽性率、數(shù)量與分子特征還可用于指導肝癌的TNM分期，肝癌患者的外周血液系統(tǒng)CTCs陽性率和數(shù)量與TNM的分期呈高度相關(guān)性[34]。

3.2預后判斷 早在2004年就有研究發(fā)現(xiàn)，CTCs的陽性率、數(shù)量與分子特征與肝癌的復發(fā)轉(zhuǎn)移、預后判斷呈顯著相關(guān)性。XU等[35]學者研究發(fā)現(xiàn)，85例肝癌患者中有69例(81%)患者每5毫升外周血中含19～24個CTCs，其陽性率和數(shù)量與肝癌的大小、門靜脈癌栓、分化狀態(tài)和疾病進程呈高度相關(guān)性。近年來有研究顯示,可利用干細胞表型(間充質(zhì)表型)和EpCAM陽性的CTCs作為肝癌早期復發(fā)轉(zhuǎn)移的判斷依據(jù)和治療靶點[36-37]。OKAJIMA 等[38]學者發(fā)現(xiàn)，通過檢測CTCs的GPC-3基因RNA表達情況可作為肝癌是否發(fā)生早期復發(fā)轉(zhuǎn)移的重要依據(jù)。肝癌患者外周血液系統(tǒng)CTCs的數(shù)量與患者預后具有顯著的相關(guān)性，CTCs數(shù)量越多，肝癌患者手術(shù)后腫瘤復發(fā)風險較高，預后越差，平均生存期越短，患者生產(chǎn)率較低[39]。

3.3療效評估 CTCs的陽性率、數(shù)量與分子特征可用于肝癌患者的療效評估和判斷。有研究顯示，肝癌切除手術(shù)或移植患者，其手術(shù)后CTCs的數(shù)量與肝癌的手術(shù)療效呈顯著相關(guān)性[40-41]。CTCs的陽性率和數(shù)量還與肝癌患者手術(shù)后的總生存期、無病生存期具有顯著的相關(guān)性，其數(shù)量越多，則生存期越短。因此，CTCs的陽性率和數(shù)量可作為肝癌患者術(shù)后療效評估和判斷的重要參考指標。

3.4精準治療 研究顯示，體外分離培養(yǎng)獲得的肝癌CTCs可用于化療藥物靈敏度的檢測，且具有肝癌干細胞特性的CTCs可表達ABCG2等耐藥蛋白從而導致肝癌患者術(shù)后放化療不靈敏[42-43]；CTCs的亞型可以作為肝癌患者分子分型的重要補充，可為肝癌的精準治療提供參考，上皮源性的肝癌患者一般預后較差，而攜帶pERK+/pAkt-的CTCs的肝癌患者對索拉非尼比較靈敏，具有良好的預后；同時也可作為預后良好的獨立因素。因此，肝癌患者CTCs可作為其精準檢測、精準診斷和精準治療的重要標志物，CTCs的陽性率、數(shù)量與分子特征可為肝癌患者選擇最佳的治療方式提供重要的參考依據(jù)。

4 展 望

綜上所述，作為近年來迅猛發(fā)展的“液態(tài)活檢”技術(shù)之一，CTCs的分離與鑒定技術(shù)具有快速、簡便、無創(chuàng)、實時的顯著特征，同時還可克服腫瘤的異質(zhì)性。最新研究發(fā)現(xiàn)，成簇CTCs的DNA甲基化可作為腫瘤轉(zhuǎn)移播種的“種子”，該研究通過對腫瘤患者CTCs的全基因組甲基化分析發(fā)現(xiàn)，CTCs的聚集可導致NANOG、OCT4、SOX2和SIN3A等調(diào)控細胞干性、增殖基因的低甲基化及 Polycomb基因的高甲基化，成簇CTCs的甲基化常常預示預后不良[44]。已獲FDA批準用于成簇CTCs解離的化合物可顯著減少腫瘤的擴散和轉(zhuǎn)移，CTCs可作為肝癌精準治療的新靶點。LI等[45]學者研究發(fā)現(xiàn)，表達Twist和Vimentin的CTCs與門靜脈癌栓的形成具有顯著相關(guān)性，并且，通過檢測CTCs中的Twist和Vimentin可以準確預測肝癌的復發(fā)與轉(zhuǎn)移[46]。

雖然國內(nèi)外學者在肝癌“液態(tài)活檢”技術(shù)領(lǐng)域開展了基于CTCs和ctDNA的大量臨床研究,如美國美國國立衛(wèi)生研究院資助的臨床研究項目(NCT02973204)，但目前在CTCs的臨床推廣和應用方面還存在一些瓶頸和困難,多處于科學研究階段，原因如下。(1)由于腫瘤細胞的異質(zhì)性，目前仍沒有一種分離鑒定的方法可將所有腫瘤患者外周血液循環(huán)系統(tǒng)中的CTCs篩選出來。(2)由于腫瘤患者外周血液循環(huán)系統(tǒng)中的CTCs半衰期較短，對血液標本的采集時間和周期要求較高，會導致假陰性結(jié)果的產(chǎn)生，繼而影響疾病的診斷和治療。(3)由于腫瘤細胞易獲得間充質(zhì)干細胞特征發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導致EpCAM丟失，產(chǎn)生更大的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力，促進腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移，將導致基于EpCAM的CTCs分離鑒定技術(shù)產(chǎn)生假陰性。

即使基于CTCs的“液態(tài)活檢”技術(shù)還存在不少局限和瓶頸，但是隨著新的腫瘤標志物的發(fā)現(xiàn)及分子診斷技術(shù)的變革，CTCs的分離鑒定技術(shù)在肝癌的精準診療中將逐漸扮演重要的角色。CTCs的分離鑒定一是需要進行多中心、大樣本、大周期的臨床基礎(chǔ)與應用基礎(chǔ)研究，獲取CTCs相關(guān)的生物學特征和信息。二是需要整合多種分離鑒定技術(shù)和方法，基于腫瘤異質(zhì)性的特點，單一的分離鑒定方法不能作為腫瘤早期篩查或診斷的常規(guī)方法。三是需要對現(xiàn)有的分離鑒定技術(shù)和方法進行標準化，目前CTCs的分離鑒定技術(shù)和方法存在種類繁多、操作步驟繁簡不一、實驗干擾因素較多、結(jié)果解讀標準不統(tǒng)一等缺點，急需制訂相對統(tǒng)一的實驗操作規(guī)范和結(jié)果解讀標準；以期為臨床肝癌患者的個體化診療提供堅實可靠的保障。