李啟照， 孫維浩

(安徽新華學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 合肥 230088)

雪松(Cedrus deodara)是松科雪松屬植物的總稱，具有活血消腫、祛風(fēng)活絡(luò)等功效，其松針部位同時(shí)具有抗菌、抗病毒以及抗氧化等功效。本文通過四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法檢測，分析雪松松針的化學(xué)成分對癌細(xì)胞的抑制作用，為雪松的全面開發(fā)利用和深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究材料

質(zhì)譜儀5975C-Agilent；超導(dǎo)核磁共振儀Bruker Avdnce-600測定；MPLC制備型為美國WatersACQUIY。 UpLc.H-cldss；HPLC為1260-Agilent ；酶標(biāo)儀Bio-Lx-800；MP-70型顯微熔點(diǎn)儀測定熔點(diǎn)。雪松松針采自中國安徽大別山金寨縣山區(qū)。

1.2 研究方法

用95%乙醇(4×8 L)五針?biāo)伤舍樃稍锓勰?約2.5 kg)提取，用旋蒸減壓濃縮，加適量水懸浮，用氯仿(3×4 L)、石油醚(3×4 L)、乙酸乙酯(3×4 L)和正丁醇(3×4 L)依次萃取，減壓濃縮得到浸膏(石油醚部分)42.05 g、(氯仿部分)39.2 g、(乙酸乙酯部分)85.6 g和(正丁醇部分)187.5 g。

用石油醚-乙酸乙酯 9∶1～5∶5和石油醚-丙酮 8∶2～5∶5，V/V溶劑系統(tǒng)梯度洗脫氯仿部分，純化用(氯仿-甲醇 1∶1，V/V)Sephadex LH-20凝膠柱，最終得到化合物3 (17.0 mg)、化合物6 (21.7 mg)、化合物8(14.3 mg)。用硅膠柱色譜分離乙酸乙酯部分，得(Fr.1～Fr.6)6個(gè)部分。經(jīng)減壓濃縮Fr.2得浸膏為淺黃色，通過石油醚-丙酮 9∶1～5∶5，氯仿-甲醇9∶1～5∶5，V/V反復(fù)硅膠柱分離，同時(shí)氯仿-甲醇 1∶1，V/V用Sephadex LH-20凝膠柱純化，得化合物7 (12.7 mg)；Fr.3用減壓蒸餾濃縮得浸膏(深棕色)，反復(fù)經(jīng)氯仿-甲醇 9∶1～6∶4，V/V硅膠色譜洗脫，用Sephadex LH-20凝膠柱(甲醇)純化，得化合物1 (18.0 mg)、化合物5 (17.5 mg)；Fr.5經(jīng)減壓蒸餾濃縮得黑色浸膏，反復(fù)氯仿-甲醇 9∶1～6∶4，V/V硅膠色譜，用氯仿-甲醇 1∶1，V/V Sephadex LH-20凝膠柱純化，得化合物2 (20.5 mg)、化合物4 (18.7 mg)。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色粉末(甲醇)；1H-NMR (CD3OD，500 MHz)δ：4.51 (1H，d，J=7.5 Hz，H-2)，4.00 (1H，m，H-3)，2.92 (1H，dd，J=(16.0，5.5) Hz，H-4a)，2.51 (1H，dd，J=(16.0，7.9) Hz，H-4b)，5.88 (1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，6.86 (1H，d，J=2.0 Hz，H-2′)，6.80 (1H，d，J=8.1 Hz，H-5′)，6.75 (1H，dd，J=(8.1，2.0) Hz，H-6′)；13C-NMR (CD3OD，125 MHz)。查閱文獻(xiàn)[1-2]，比對以上數(shù)據(jù)鑒定為兒茶素，數(shù)據(jù)見表1。

表1 松針主要成分組裝后對腫瘤細(xì)胞體外增殖抑制率Tab.1 Inhibition rate of tumor cells in vitro after assemble of pine needle main components

化合物2黃色針晶(丙酮)；EI-MS m/z：270 [M]+，241，213，197;1H-NMR (500 MHz，CD3COCD3)δ：13.00 (OH-4′)，6.31 (1H，d，J=2.2 Hz，H-6)，6.44 (1H，d，J=1.9 Hz，H-8)，7.44 (2H，dd，J=(2.2，6.2) Hz，H-2′,6′)，6.91 (2H，dd，J=(2.5，6.7) Hz，H-3′,5′)；13C-NMR (125 MHz，CD3COCD3)δ：155.2 (C-2)，125.2 (C-3)，182.4 (C-4)，164.7 (C-5)，99.8 (C-6)，163.8 (C-7)，93.6 (C-8)，158.3 (C-9)，104.6(C-10)，124.2 (C-1′)，132.1 (C-2′)，117.12(C-3′)，157.3 (C-4′)，114.3 (C-5′)，132.4 (C-6′)。根據(jù)文獻(xiàn)[3-4]的研究，以上數(shù)據(jù)與其比對鑒定為染料木黃酮(表1)。

化合物3淡黃色無定形粉末(甲醇)；1H-NMR (CD3OD，500 MHz)δ：4.16 (1H，d，J=4.8 Hz，H-3)，4.26 (1H，d，J=4.6 Hz，H-4)，5.71 (1H，d，J=2.5 Hz，H-6)，6.10 (1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，7.30 (1H，d，J=2.0 Hz，H-10)，6.74 (1H，d，J=8.2 Hz，H-13)，7.03 (1H，dd，J=(8.0 ，2.4) Hz，H-14)，4.70 (1H，br s，H-2′)，4.12 (1H，m，H-3′)，2.61 (1H，dd，J=(16.5，8.0) Hz，H-4′ɑ)，2.80 (1H，dd，J=(16.5，5.2) Hz，H-4′β)，6.18 (1H，s，H-6′)，7.09 (1H，d，J=2.1 Hz，H-10′)，6.79 (1H，d，J=8.0 Hz，H-13′)，6.85 (1H，dd，J=8.0，2.4 Hz，H-14′)；13C-NMR (CD3OD，125 MHz)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]對照基本一致(表1)，故鑒定為花青素A-1。

化合物4白色固體(氯仿)；1H-NMR (CDCl3，500 MHz)δ：1.97 (1H，m，H-1a)，1.70 (1H，m，H-1b)，2.38 (1H，dd，J=(13.3，4.8) Hz，H-2a)，2.32 (1H，dd，J=(13.1，7.3) Hz，H-2b)，2.23 (1H，d，J=6.3 Hz，H-4)， 1.75 (1H，m，H-6)，0.87 (3H，s，H-23)，0.76 (3H，s，H-24)，0.88 (3H，s，H-25)，0.99 (3H，s，H-26)，1.00 (3H，s，H-27)，1.14 (3H，s，H-28)，1.03 (3H，s，H-29)，0.97 (3H，s，H-30)；13C-NMR (CDCl3，125 MHz)。查閱相關(guān)文獻(xiàn)[6]并結(jié)合上述數(shù)據(jù)比對(表1)，鑒定為木栓酮。

化合物5黃色粉末(甲醇)；ESI-MS m/z 457 [M+Na]+，1H-NMR (CD3OD，500 MHz)δ：7.40(1H，s，H-2)，7.37 (1H，s，H-6)，4.25 (1H，m，H-8)，4.19 (1H，m，H-9)，6.73 (1H，s，H-6′)，4.66 (1H，d，J=8.1 HZ，H-7′)，2.64 (1H，m，H-8′)，3.63 (1H，m，H-9′)，3.91 (6H，s，3，5-OCH3)，3.81 (6H，s，3′，5′-OCH3)；13C-NMR (CD3OD，125 MHz)δ：127.3 (C-1)，106.3(C-2)，148.3 (C-3)，143.7 (C-4)，148.0 (C-5)，106.4 (C-6)，201.1 (C-7)，50.3 (C-8)，72.7 (C-9)，132.1 (C-1′)，106.4 (C-2′)，148.5 (C-3′)，137.5 (C-4′)，148.6 (C-5′)，106.4 (C-6′)，86.5 (C-7′)，56.0 (C-8′)，62.2 (C-9′)，58.1 (3，5-OCH3)，55.7 (3′，5′，-OCH3)。參照文獻(xiàn)[7]與結(jié)合相關(guān)數(shù)據(jù)，鑒定為刺五加酮(表1)。

化合物6白色針晶(氯仿)；EI-MS m/z：414 [M]+(100)，396 (59)，381 (44)，329 (51)；1H-NMR (CDCl3，500 MHz)δ：5.29 (1H，br d，J=5.2 Hz，H-6)，3.46 (1H，m，H-3)，1.02 (3H，s，H-19)，0.91 (3H，d，J=8.2 Hz，H-21)，0.85 (3H，d，J=7.4 Hz，H-27)，0.82 (3H，d，J=7.4 Hz，H-26)，0.81 (3H，t，J=8.1 Hz，H-29)，0.65 (3H，s，H-18)；13C-NMR (CDCl3，125 MHz)。參照文獻(xiàn)[8]并比對上述數(shù)據(jù)，鑒定為β-谷甾醇(表1)。

化合物7白色固體(丙酮)；1H-NMR (CD3OD，500 MHz)δ：7.50 (1H，d，J=2.1 Hz，H-2)，6.79 (1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，7.53 (1H，dd，J=(8.1，1.7) Hz，H-6)，3.81 (3H，s，-OCH3)；13C-NMR (CD3OD，125 MHz)。參照文獻(xiàn)[9]，對比相關(guān)數(shù)據(jù)，鑒定為香草酸(表1)。

化合物8白色細(xì)針晶(丙酮)；1H-NMR (500 MHz，CD3COCD3)δ：3.23 (1H，d，J=5.3 Hz，3-OH)，3.01 (1H，s，16-OH)，0.75 (2H，m，H-2)，3.06 (1H，dt，J=5.3，11.2 Hz，H-3)， 0.81 (1H，m，H-9)，1.62 (2H，m，H-15)，1.10 (3H，s，H-17)，0.68 (3H，s，H-18)，0.84 (3H，s，H-19)，0.82 (3H，s，H-20)；13C-NMR (125 MHz，CD3COCD3) δ：37.3 (t，C-1)，27.1 (C-2)，78.1(C-3)，38.7 (C-4)，55.3 (C-5)，18.2 (C-6)，39.7 (C-7)，37.1 (C-8)，51.4(C-9)，34.5 (C-10)，24.4(C-11)，37.1 (C-12)，24.1 (C-13)，28.2 (C-14)，57.8 (C-15)，71.1 (C-16)，31.2 (C-17)，28.1 (C-18)，16.2 (C-19)，14.1 (C-20)。參照文獻(xiàn)[10]，3,16α-二羥基-對映貝殼杉烷的數(shù)據(jù)基本一致。

圖1 松針抑制腫瘤細(xì)胞IC50值比較Fig.1 Comparison of IC50 values of pine for tumor cell inhibition

2.2 松針主要成分抗腫瘤作用研究

松針活性成分隨著濃度的增加，抑制率逐步提高，具有明顯的體外抑制腫瘤作用。當(dāng)劑量達(dá)到8 μg/mL時(shí)，對肺癌細(xì)胞A549和胃癌細(xì)胞SGC-7901抑制率分別達(dá)到90.46%、86.12%，抑制作用較明顯(表1)。松針活性成分抑制肺癌細(xì)胞A549的效果最強(qiáng)(IC50=2.77 μg/mL)，對胃癌細(xì)胞SGC-7901的抑制作用次之(IC50=3.78 μg/mL)，詳見圖1。

2.3 松針抑制肺癌和胃癌細(xì)胞成分研究

由表2可知，抑制肺癌細(xì)胞A549和胃癌細(xì)胞SGC-7901的主要活性成分為松針黃酮類(木黃酮、刺五加酮、木栓酮)，其中木黃酮和刺五加酮是抑制兩種癌細(xì)胞增殖的主要活性成分。

表2 松針主要成分抑制腫瘤細(xì)胞IC50值Tab.2 IC50 values of main components of pine needles inhibiting tumor cells(μg/mL,

3 討論

本研究從雪松松針中分離得到兒茶素、染料木黃酮、花青素A-1、木栓酮、刺五加酮、β-谷甾醇、香草酸、3,16α-二羥基-對映貝殼杉烷8種化合物，同時(shí)發(fā)現(xiàn)松針黃酮類對肺癌細(xì)胞A549和胃癌細(xì)胞SGC-7901抑制率分別達(dá)到90.46%、86.12%，IC50分別為2.77 μg/mL、3.78 μg/mL，其較強(qiáng)的抗腫瘤作用，可能與松針中含有木黃酮、花青素、木栓酮、刺五加酮有關(guān)。研究表明，黃酮類化合物可產(chǎn)生活性氧是抗腫瘤的活性基團(tuán)，可催化谷胱甘肽及輔酶共氧化，提高劑量可以發(fā)揮等效作用。松針黃酮抗腫瘤機(jī)理主要是影響細(xì)胞膜，改變細(xì)胞的生理功能，影響細(xì)胞代謝；影響自由基與過氧化形成，影響免疫系統(tǒng)的反應(yīng)性，導(dǎo)致DNA片段凋亡等作用。

研究發(fā)現(xiàn)，雪松松針總黃酮對不同腫瘤細(xì)胞體外增殖均具有一定增殖抑制作用。在今后研究中應(yīng)積極開展松針黃酮體內(nèi)抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)研究，以期更深入、更全面地研究其抗胃癌的機(jī)理，充分利用雪松松針資源開發(fā)新型抗腫瘤藥物，為備選化合物提供借鑒和理論支撐。