譚美齡 張 欽 付 鵬

（重慶市萬州食品藥品檢驗所 重慶 404000）

1 前言

鮮蛋因營養(yǎng)價值豐富，成為人們?nèi)粘ｏ嬍持兄匾膭游镌葱允称分唬瑢ζ湎嚓P(guān)藥物殘留量的檢測是食品安全監(jiān)測的剛性需求。氯霉素類和喹諾酮類均為抗生素類藥物，主要有氯霉素（Chloramphenicol，CAP）、氟苯尼考（Florfenicol，F(xiàn)F）、甲砜霉素（Thiamphnicol，TAP）、恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）等。五氯苯酚（Pentachlorophenol，PCP）及其鈉鹽為有機氯農(nóng)藥，常用作殺菌劑、除草劑和殺蟲劑。氯霉素類藥物可影響造血功能并導(dǎo)致貧血。喹諾酮類藥物會影響胃腸道和心血管系統(tǒng)的健康。五氯苯酚通過水載體廣泛擴散，影響生態(tài)安全并產(chǎn)生生物蓄積，可能對人類造成致畸、致癌、致突變和其他危害[1]。

目前，國內(nèi)外相關(guān)檢測方法中，大部分方法需要衍生化[2-4]，采用傳統(tǒng)的固相萃取柱進行凈化，基質(zhì)效應(yīng)較難控制，使得靈敏度低，檢測限高，存在假陽性風險，在復(fù)雜樣品基質(zhì)中的應(yīng)用能力有限。本文在樣品凈化步驟中選用了對鮮蛋中的磷脂和色素類物質(zhì)具有較好去除能力的Waters Oasis PRiME HLB柱[5，6]，該新型小柱無須活化平衡、淋洗、洗脫，基質(zhì)干擾物直接吸附于填料內(nèi)，直接收集濾液待測，簡化了操作步驟，節(jié)省了時間，降低了基質(zhì)效應(yīng)；同時，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法建立了高靈敏度、快速準確、安全經(jīng)濟的藥物痕量分析法。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

標準物質(zhì)：氯霉素（D015026）、五氯酚酸鈉（170710，100 μg/mL）、氯霉素-D5（161228，100 μg/mL）、環(huán)丙沙星-D8（160414）（北京曼哈格）；氟苯尼考（DRE-C 13665000）、甲砜霉素（DRE-C17457000）、五氯酚-13C6（C15970100）（Dr.Ehrenstorfer）；恩諾沙星（TC180203-07）、環(huán)丙沙星（AL181105-06）（Stanford Chemicals）；恩諾沙星-D5（272238）（WITEGA Laboratorien Berlin-Adlershof）。

主要試劑：甲醇、乙腈（德國Merck 公司）。

2.2 儀器與設(shè)備

AB Sciex QTRAP 4500 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國 AB SCIEX 公司）；TG20WS 離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）；KQ-800DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DN-12W 氮吹儀（上海楚定分析儀器有限公司）；IKA MS 3 digital 渦旋振蕩器（德國 IKA 集團）。

2.3 實驗方法

2.3.1 標準溶液的配制

取氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星，用甲醇配制成混合標準工作溶液（100 ng/mL）；取恩諾沙星-D5、環(huán)丙沙星-D8、五氯酚-13C6，用甲醇配制成混合內(nèi)標工作溶液（1 μg/mL）；按照最終定容濃度為 0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL，采用空白樣品基質(zhì)溶液進行稀釋配制。

2.3.2 樣品制備

取樣：取鮮蛋，去掉外殼，使用勻漿機攪勻，放入干凈的容器中，密封并標記。

提?。悍Q取2 g 樣品至50 mL 離心管內(nèi)，加入混合內(nèi)標工作溶液（1 μg/mL）50 μL，加入 80%乙腈水溶液（含0.2%甲酸）10 mL，渦旋混合1 min，超聲10 min，8 000 r/min 離心 10 min（溫度小于 5℃）。

凈化：取2mL 上清液，加入到Water Oasis PRiME HLB（6 cc，200 mg）小柱上，使其自然下滴通過，取1 mL 收集到的濾液置于氮吹管中，于40℃下用氮氣吹至近干。將殘余物用初始流動相復(fù)溶并定容至1mL，過0.22 μm 微孔濾膜后用于UPLC-MS/MS 測定。

2.3.3 儀器分析

（1）色譜條件

色譜柱：InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 2.1×100 mm 1.9-Micron；柱溫：35℃；進樣量：5 μL；流動相：A 乙腈、B 水（含 5 mmol/L 乙酸銨）；流速：0.20 mL/min；梯度洗脫：0～2 min。流動相A 含量為10%并保持2～6 min；流動相A 從10%線性增加至90%，并保持至8 min；8～9 min，流動相 A 從 90%線性回至 10%，并保持至11 min。

（2）質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧型（ESI）；電噴霧電壓：5 500 V/-4 500 V；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；輔助加熱氣：50 units；霧化氣：50 units；反吹氣：30 units；霧化器蒸發(fā)溫度：550℃；掃描方式：正負離子同時切換，相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)詳見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

續(xù)表1

3 結(jié)果與分析

3.1 提取方法的優(yōu)化

提取過程關(guān)系到整個檢驗工作的成敗，6 種化合物中，除了五氯苯酚及其鈉鹽（PCP-Na）為農(nóng)藥外，其余5 種為獸藥抗生素，均可溶于有機溶劑。根據(jù)這6 種化合物和鮮蛋基質(zhì)的特性，本文分別選用甲醇、乙腈、乙酸乙酯作為提取溶劑。實驗發(fā)現(xiàn)，3 種提取劑沉淀蛋白能力乙腈最好，其次為甲醇，產(chǎn)生的絮狀沉淀易于冷凍離心分離。甲醇和乙酸乙酯能萃取出鮮蛋中的脂肪，而乙腈能減少脂肪和其他雜質(zhì)的溶出，同時破除乳化現(xiàn)象。由于鮮蛋中含有大量水分，部分待測物如PCP-Na 易溶于水中，而乙酸乙酯只能溶解部分水分，不利于將目標物完全提取出來。所以本文選擇與水混溶的乙腈作為提取溶劑，并加入部分極性溶劑水以形成混合提取體系，比較了提取液中乙腈體積分數(shù)分別為 100%、90%、80%、70%和60%時通過固相萃取柱時的提取效率（圖1）。其中，80%的乙腈水提取的回收率最高且提取液更清亮易于后續(xù)的過柱凈化。ENR 和CIP 含有羧基、哌嗪基，兼具弱酸弱堿的性質(zhì)，在烯酸或稀堿中具有較好的溶解度。在酸性條件下PCP-Na 會酸化成脂溶性的PCP 而被提取出來，PCP 的 pKa=4.93，在酸性條件下形成分子態(tài)，對于增加其在有機溶劑中的分配比更有利?；谝陨咸匦裕緦嶒炘?0%乙腈水中添加0.2%的甲酸溶液，作為最終的提取溶劑。

圖1 不同比例提取液對凈化效果的影響

3.2 凈化方法的優(yōu)化

鮮蛋的基質(zhì)較為復(fù)雜，可能會干擾UPLC-MS/MS分析，影響定性定量。同時，還會污染色譜系統(tǒng)和質(zhì)譜系統(tǒng)。所以，不僅要考慮目標化合物的提取效率，還要考慮在復(fù)雜的鮮蛋基質(zhì)中的干擾物如脂肪、蛋白質(zhì)、磷脂等的去除率。鮮蛋中的蛋白質(zhì)通過乙腈沉淀和冷凍離心被去除。傳統(tǒng)的溶劑脫脂步驟可以除去脂肪，但是有機溶劑消耗大，污染環(huán)境，不利于操作人員的健康。本實驗采用固相萃取方法對樣品進行凈化，分別考察了 C18、HLB、PRiME HLB 3 種不同的固相萃取小柱的凈化效果。其中，C18 的平均回收率只有70%～80%，HLB 和 PRiME HLB 均能達到80%～110%。通過質(zhì)譜掃描不同小柱凈化下的樣品基質(zhì)溶液，PRiME HLB 的基質(zhì)干擾峰最少。C18 小柱是一種硅膠反相吸附劑，主要吸附疏水性目標物質(zhì)，對脂溶性雜質(zhì)如磷脂和色素，容易形成死體積使作用位點減少，并且小柱易干使目標物保留減少，凈化能力有限。HLB 填料是親水親脂性單體的共聚物，具有高比表面積及強吸附性，也屬于反相吸附機理，能夠克服傳統(tǒng)C18 填料的缺點，除雜能力與C18相比較好，但不能有效去除鮮蛋中的磷脂等干擾物。PRiME HLB 小柱是基于HLB 小柱的升級，同屬反相保留機理，能有效去除鮮蛋中95%以上的基質(zhì)干擾物，特別是對于脂肪、磷脂和色素的去除效果極好。同時，PRiME HLB 與 C18 和 HLB 小柱相比，無需任何活化、洗脫和淋洗，直接上樣，使得樣品凈化過程更加簡單、快速、有效。

3.3 液相色譜條件的優(yōu)化

本實驗選用具有較小填料內(nèi)徑（1.9 μm）的色譜柱對目標物進行分離，6 種藥物均有較強的保留，分離較好。使用乙腈作為洗脫流動相，較甲醇的基線平穩(wěn)，峰形更尖銳，響應(yīng)更高。在ESI 電離模式中，揮發(fā)性的鹽會堵塞取樣孔，沾污透鏡影響聚焦的電位分布，故本實驗使用相對更易揮發(fā)的緩沖鹽乙酸銨來提高目標化合物的電離效率。同時，采用梯度洗脫的方式，適當延長目標物的保留時間，將基質(zhì)的干擾降到最低。由于ESI 質(zhì)譜儀是濃度檢測器，流速越小，在一定注射體積下流出峰的濃度越大，同時，低流速下產(chǎn)生的霧滴更利于霧化并增加信號強度。因此，使用0.2 mL/min 的流速并結(jié)合液相超高壓技術(shù)的應(yīng)用可以獲得更好的峰形和靈敏度。

3.4 質(zhì)譜分析條件的優(yōu)化

據(jù)歐盟2002/657/EC 法案的要求[7]，在農(nóng)藥和獸藥殘留分析中，對于禁用藥物，以質(zhì)譜法需要達到4 個點的要求。多級質(zhì)譜的要求是檢測1 個母離子和2 個產(chǎn)物離子，并分別用于定量定性。從質(zhì)譜調(diào)諧可以看出，五氯酚結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，其分子離子在碰撞室中不易被打碎，很難獲得特征子離子。因此，選擇五氯酚中氯元素的4 個同位素母離子作為質(zhì)譜確認的識別點：262.6、264.3、266.9、268.7。其余 5 種獸藥在碰撞室中均能被不同程度的打碎。通過全掃描方式觀測離子情況，ENR 和CIP 易獲得H+形成穩(wěn)定的（M+H）+分子離子。CAP、FF、TAP 和 PCP 均為酸性化合物，容易丟失H+以形成穩(wěn)定的（M-H）-分子離子，因此，本實驗采用正負離子同時切換掃描對樣品進行分析。在MS 定量分析時，采用了同位素內(nèi)標物質(zhì)，其中，CAP、FF、TAP 以 CAP-D5作為內(nèi)標物，ENR 以 ENRD5作為內(nèi)標物，CIP 以 CIP-D8作為內(nèi)標物，PCP 以PCP-13C6作為內(nèi)標物，以內(nèi)標峰面積與目標物峰面積的比率進行定量分析，用于控制樣品提取凈化、LC進樣、流動相和電離等過程的誤差，提高定量的準確性。

3.5 基質(zhì)效應(yīng)的考察

在UPLC-MS/MS 中，由共流物引起的基質(zhì)效應(yīng)會影響分析方法的靈敏度、精密度和準確度。選取具有代表性的幾種鮮蛋品種，通過對比溶劑標準曲線和空白基質(zhì)工作曲線的差異，來考察不同鮮蛋基質(zhì)對試驗結(jié)果的影響。通過基質(zhì)效應(yīng)（Matrix Effect，ME）計算公式ME=［（基質(zhì)匹配標準曲線斜率/純?nèi)軇藴是€斜率）-1］×100%進行計算。當 ME＜0 時，表現(xiàn)為基質(zhì)抑制；當ME＞0 時，表現(xiàn)為基質(zhì)增強。不同鮮蛋樣品的基質(zhì)效應(yīng)詳見表2。由表2 可知，鵪鶉蛋為弱基質(zhì)增強效應(yīng)，雞蛋、鴨蛋為中等強度基質(zhì)增強效應(yīng)，幾種鮮蛋基質(zhì)均有增強離子化的效果，所以需要配制基質(zhì)匹配標準工作曲線來補償基質(zhì)效應(yīng)。同時，本實驗還通過稀釋樣品溶液、優(yōu)化凈化步驟、優(yōu)化色譜分離條件共同作用來減少基質(zhì)對實驗結(jié)果的影響。

表2 不同鮮蛋樣品的基質(zhì)效應(yīng)（單位：%）

3.6 方法學驗證

3.6.1 線性范圍及檢出限

配制系列基質(zhì)標準工作溶液，以峰面積對應(yīng)的質(zhì)量濃度做工作曲線，每個校準點以隨機順序重復(fù)測量2 次，結(jié)果詳見表3。6 種化合物在質(zhì)量濃度在0.2～20 ng/mL 時均具有良好的線性關(guān)系。符合GB/T 27417—2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》[8]所規(guī)定的對于準確定量的方法，即線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)不小于0.99 的要求。

表3 工作曲線及檢出限

續(xù)表3

3.6.2 回收率及精密度

選用鮮蛋陰性基質(zhì)樣品，在曲線線性范圍中做標準加入法，分別加入 2.5 μg/kg、5.0 μg/kg、25.0 μg/kg 3 個不同濃度梯度量的標準溶液，按照樣品制備過程同法處理，進行回收率實驗，每次測試重復(fù)6 次，CAP 的平均回收率為 98.7%～103.4%，RSD 為 1.6%～3.5%；FF 的平均回收率為 91.5%～95.8%，RSD 為 5.9%～7.8%；TAP 的平均回收率為87.4%～92.2%，RSD 為5.9%～7.3%；ENR 的平均回收率為90.2%～98.2%，RSD 為1.7%～3.5%；CIP 的平均回收率為 94.2%～96.2%，RSD 為1.9%～3.2%；PCP-Na 的平均回收率為 73.2%～75.4%，RSD 為3.1%～8.9%。以上數(shù)據(jù)表明，不同梯度的回收率均符合GB/T 27417—2017 附錄A 規(guī)定的技術(shù)要求（濃度水平范圍＜0.1 mg/kg 時，回收率范圍為60%～120%；精密度小于15%）。

4 結(jié)論

本文建立了PRiME HLB-UPLC-MS/MS 同時測定鮮蛋中6 種藥物殘留量的方法。結(jié)果表明，在本法條件下，優(yōu)化了前處理，提高了準確度和精密度，6種藥物在濃度為0.2～20 ng/mL 時線性良好，適合大批量的日常分析檢測，可為建立同時快速測定獸藥和農(nóng)藥殘留的研究提供技術(shù)支持。