向春艷

（重慶市萬(wàn)州食品藥品檢驗(yàn)所 重慶 404000）

1 前言

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus Aureus）是一種廣泛存在于自然界中的常見致病菌，不僅存在于水、空氣、土壤中，也常寄生于人和動(dòng)物的皮膚及與外界相通的腔道中?！恫芗?xì)菌鑒定手冊(cè)》（第八版）[1]中將其列為革蘭氏陽(yáng)性球菌，是微球菌科葡萄球菌屬的一個(gè)種。當(dāng)空氣中氧分低時(shí)，較易產(chǎn)生腸毒素，可引起食物中毒[2]。金黃色葡萄球菌也是人類化膿感染中最常見的病原菌，可引起化膿性炎癥，倘若感染進(jìn)入血液，可造成肺炎、心包炎等內(nèi)臟器官感染，嚴(yán)重的甚至可造成敗血癥、膿毒血癥等全身感染。隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，化妝品的使用越來(lái)越廣泛，幾乎成為人們生活中必不可少的日用品。化妝品中含有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能為微生物提供良好的生長(zhǎng)環(huán)境，在生產(chǎn)、儲(chǔ)藏和使用過(guò)程中均有受微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)。2017 年3 月1 日，原國(guó)家質(zhì)檢總局公布的403 批次不合格進(jìn)口食品化妝品質(zhì)量問(wèn)題中，韓國(guó)品牌蘭芝有3 款護(hù)膚品檢出金黃色葡萄球菌，而《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 年版）[3]中規(guī)定不得檢出金黃色葡萄球菌。因此，化妝品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

為了提高實(shí)驗(yàn)室金黃色葡萄球菌的檢測(cè)能力，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室人員的專業(yè)能力，重慶市萬(wàn)州食品藥品檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)室參加了2019 年中國(guó)食品藥品檢定研究院組織的NIFDC-PT-188 化妝品金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證。分別采用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)熒光PCR 法對(duì)能力驗(yàn)證樣本的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行相互印證，并比較2 種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為參加能力驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)室提供參考。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 培養(yǎng)基

SCDLP 液體培養(yǎng)基（批號(hào)：1076871）、Baird Parker瓊脂基礎(chǔ)（批號(hào)：1075571）、金黃色葡萄球菌顯色平板（批號(hào)：J0613Y）、BHI 肉湯（批號(hào)：1076421）（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；血瓊脂平板（重慶龐通醫(yī)療器械有限公司，批號(hào)：19E0601）；甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基（北京三藥科技開發(fā)公司，批號(hào)：180627）。

2.1.2 試劑

凍干兔血漿（批號(hào)：6105167）、卵黃亞蹄酸鉀增菌液（批號(hào)：6105242）（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；金黃色葡萄球菌單重?zé)晒釶CR 檢測(cè)試劑盒（北京億森寶生物科技有限公司，批號(hào)：20190302）。

2.1.3 儀器

立式壓力蒸汽滅菌鍋（LDZH-100KBS，上海申安醫(yī)療器械公司）；生物安全柜（BHC-1300ⅡA2，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9272 型，上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；離心機(jī)（Thermo FRESCO17，賽默飛世爾科技有限公司）；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀（LightCycler96，瑞士羅氏公司）；顯微鏡（DM500，德國(guó)徠卡公司）； 漩渦混合器（VORTEX GENIUS3，德國(guó)艾卡公司）。

2.1.4 樣本

NIFDC-PT-188 化妝品能力驗(yàn)證樣本，編號(hào)為TC01880136、TC01880231。樣本為白色球狀，真空放置于含有粉底膏的西林瓶中，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

2.1.5 菌種

金黃色葡萄球菌（CMCC26003）、表皮葡萄球菌（ATCC49134）（廣東省微生物菌種保藏中心）。

2.2 方法

按照NIFDC-PT-188 化妝品金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證作業(yè)指導(dǎo)書和《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 年版）的規(guī)定進(jìn)行增菌培養(yǎng)、分離鑒定。同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光PCR 法對(duì)樣品進(jìn)行平行檢測(cè)，綜合2 種方法結(jié)果出具報(bào)告。

2.2.1 樣品前處理

在生物安全柜中打開樣本西林瓶，無(wú)菌操作向2支西林瓶中分別加入6 mL 大豆酪蛋白葡萄糖磷脂吐溫80（SCDLP）液體培養(yǎng)基，將樣本完全混勻，使其分散混懸（樣本粉底膏具有一定的濕度，呈黏稠塊狀，不易溶解，需要借助旋渦混合器以漩渦形式混合，并且要控制轉(zhuǎn)速不能太快），轉(zhuǎn)移到滅菌試管中，再用SCDLP液體培養(yǎng)基潤(rùn)洗西林瓶4 次，每次1 mL，合并，待用。同時(shí)，取金黃色葡萄球菌菌液1 mL（＜100 CFU/mL）接種至10 mL SCDLP 液體培養(yǎng)基中作為陽(yáng)性對(duì)照，另取10 mL SCDLP 液體培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。

2.2.2 國(guó)標(biāo)法

（1）增菌培養(yǎng)

將上述樣本液、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照置于36℃培養(yǎng)24 h。

（2）分離培養(yǎng)

初步分離：自上述增菌培養(yǎng)液中挑取1 環(huán)，分別劃線接種于Baird Parker 平板和金黃色葡萄球菌顯色平板上，置36℃培養(yǎng)，Baird Parker 平板培養(yǎng)48 h，顯色平板培養(yǎng)24 h。

分純培養(yǎng)：挑取上述平板中典型及可疑菌落，分別接種到血瓊脂平板上，置36℃培養(yǎng)24 h。

（3）鑒定試驗(yàn)

染色鏡檢：分別挑取分純菌落，涂片，革蘭氏染色，鏡檢。

甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)：取上述分純菌落接種到甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基液面上加入2～3 mm 的滅菌液體石蠟，置36℃培養(yǎng)24 h。

血漿凝固酶試驗(yàn)：吸取0.3 mL 分純菌落24 h 腦心浸液（BHI）肉湯培養(yǎng)物，加入0.5 mL 凍干兔血漿中，置于36℃培養(yǎng)箱中，每0.5 h 觀察一次，觀察6 h，呈現(xiàn)凝結(jié)塊即為陽(yáng)性，同時(shí)以金黃色葡萄球菌陽(yáng)性菌BHI 肉湯培養(yǎng)物作為陽(yáng)性對(duì)照，以表皮葡萄球菌BHI 肉湯培養(yǎng)物作為陰性對(duì)照，以BHI 肉湯培養(yǎng)液作為空白對(duì)照。

2.2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR 法

（1）脫氧核糖核酸（DNA）提取

取上述增菌培養(yǎng)液100 μL 加到1.5 mL 無(wú)菌離心管中，8 000 r/min 離心3 min，盡量吸取上清液，加入50 μL DNA 抽提液充分混勻，100℃恒溫 10 min，13 000 r/min 離心3 min，取上清液備用。

（2）試劑的準(zhǔn)備

向5 個(gè)PCR 反應(yīng)管中分別加入15 μL 熒光PCR反應(yīng)液，分別加入空白對(duì)照、2 個(gè)樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照，各5 μL，蓋上蓋子，放入實(shí)時(shí)熒光PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)。

（3）PCR 反應(yīng)條件

檢測(cè)通道：FAM 熒光檢測(cè)；

循環(huán)參數(shù)設(shè)置：50℃、2 min；預(yù)變性，95℃、10 min；PCR 擴(kuò)增，95℃、15 s，60℃、60 s，循環(huán) 40 次。

3 結(jié)果與分析

3.1 國(guó)標(biāo)法

樣品經(jīng)過(guò)增菌，劃線接種在3 種平板上的分離培養(yǎng)結(jié)果詳見表1，生化鑒定結(jié)果詳見表2。由表1、表2 可知，2 個(gè)樣本都和陽(yáng)性對(duì)照的分離鑒定結(jié)果一致，均檢出金黃色葡萄球菌。2 個(gè)樣本在Baird Parker 平板和顯色平板上劃線接種后均有2 種形態(tài)的菌落產(chǎn)生，并且在Baird Parker 平板上大部分的菌落是沒(méi)有渾濁帶和透明圈的，需要仔細(xì)分辨才能找到可疑菌落。在顯色平板上，盡管2 種顏色的菌落容易分辨，但由于交錯(cuò)生長(zhǎng)在一起，挑取可疑菌落并不容易。為了更準(zhǔn)確地挑取典型菌落及可疑菌落進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，本文將上述可疑菌落再次劃線接種于顯色平板上進(jìn)一步分離，然后挑取典型菌落接種于血瓊脂平板上，進(jìn)行純化培養(yǎng)。純化后平板上菌落的顏色形態(tài)基本一致。

表1 增菌及分離培養(yǎng)結(jié)果

表2 生化鑒定結(jié)果

3.2 實(shí)時(shí)熒光PCR 法

樣品組織密度（Ct）值詳見表3，PCR 擴(kuò)增曲線詳見圖1。由表3 和圖1 可以看出，空白對(duì)照和陰性對(duì)照無(wú)FAM 熒光信號(hào)檢出，陽(yáng)性對(duì)照有FAM 熒光信號(hào)檢出，且FAM 通道出現(xiàn)典型的“S”型擴(kuò)增曲線，Ct 值為 16.97，小于 35，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。2 份樣本有FAM 熒光信號(hào)檢出，F(xiàn)AM 通道同樣出現(xiàn)典型的“S”型擴(kuò)增曲線，Ct 值分別為 17.50 和 21.19，均小于35，表明2 個(gè)樣本中均檢出金黃色葡萄球菌。這與國(guó)標(biāo)法的檢測(cè)結(jié)果一致。

表3 樣品的Ct 值

圖1 實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增曲線

3.3 2 種方法優(yōu)缺點(diǎn)的比較

近年來(lái)，PCR 及雜交探針、基因芯片等分子生物學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的檢測(cè)鑒定，該法耗時(shí)短，檢測(cè)靈敏度高，但該方法受多種因素影響，如果操作不當(dāng)，比如，樣本前處理不當(dāng)導(dǎo)致DNA 未被提出，或者加樣本DNA 模板時(shí)，由于是微量加樣，操作稍有不慎，將樣液附著于PCR 反應(yīng)管壁并產(chǎn)生氣泡，都容易造成假陰性?；趥鹘y(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)的國(guó)標(biāo)法，仍是目前檢測(cè)的主流方法，但該方法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)靈敏度低，容易造成漏檢。并且在能力驗(yàn)證考核中，為了增大難度，會(huì)加入多種雜菌進(jìn)行干擾，在BP 平板上菌落的顏色和形態(tài)具有很大的相似度，不容易識(shí)別目標(biāo)菌落，更大程度上依賴于檢驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn)和專業(yè)素養(yǎng)。而顯色培養(yǎng)基的應(yīng)用，使目標(biāo)菌呈現(xiàn)出特殊顏色與其他雜菌相區(qū)分，大大提高了目標(biāo)菌的檢出率，且縮短了分離純化的時(shí)間[4-6]。目前一些基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)和小型企業(yè)并未配置PCR 檢測(cè)儀、全自動(dòng)生化鑒定儀等高端設(shè)備，因此，使用顯色培養(yǎng)基是最經(jīng)濟(jì)實(shí)用的有效手段[7-10]。

4 討論

能力驗(yàn)證是評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力的重要手段，要做好能力驗(yàn)證就要從檢驗(yàn)人員、檢驗(yàn)器具和設(shè)備、檢驗(yàn)材料、檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)環(huán)境（簡(jiǎn)稱“人”“機(jī)”“料”“法”“環(huán)”）5 個(gè)方面來(lái)控制。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，“人”就是加強(qiáng)人員理論和操作培訓(xùn)，“機(jī)” 就是保證實(shí)驗(yàn)所需設(shè)備的性能處于良好狀態(tài)，“料” 就是對(duì)實(shí)驗(yàn)所需培養(yǎng)基、試劑、菌種進(jìn)行驗(yàn)證以保證質(zhì)量，“法”就是研讀標(biāo)準(zhǔn)、正確使用并做好方法確認(rèn)，“環(huán)”就是實(shí)驗(yàn)室環(huán)境應(yīng)符合使用要求，布局應(yīng)合理防止交叉污染。通過(guò)這5 個(gè)方面的控制，本次能力驗(yàn)證重慶市萬(wàn)州食品藥品檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)室取得滿意結(jié)果。

根據(jù)NIFDC-PT-188 化妝品中金黃色葡萄球菌檢出能力驗(yàn)證結(jié)果報(bào)告可以得知，本次能力驗(yàn)證計(jì)劃共有134 家實(shí)驗(yàn)室參加，118 家結(jié)果評(píng)定為滿意，滿意率為88.1%。有5 家實(shí)驗(yàn)室存在假陽(yáng)性結(jié)果，可能是實(shí)驗(yàn)室在檢驗(yàn)過(guò)程中操作不當(dāng)或者環(huán)境不能達(dá)到要求，存在交叉污染。有11 家實(shí)驗(yàn)室存在假陰性結(jié)果，原因可能有以下3 個(gè)方面：（1）培養(yǎng)基的質(zhì)量可能存在問(wèn)題。增菌液質(zhì)量不好，會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)菌增菌不足，在分離平板上形成的典型菌落較少或沒(méi)有；分離平板質(zhì)量不好，目標(biāo)菌不能在平板上形成典型菌落與背景菌區(qū)分，導(dǎo)致無(wú)法挑取目標(biāo)菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。（2）分離鑒定方法單一。如果僅用一種分離平板進(jìn)行鑒定，而目標(biāo)菌在平板上的菌落形態(tài)不一定很典型，比如，金黃色葡萄球菌在某些情況下不會(huì)產(chǎn)生明顯的色素，以顏色判定的話很容易造成漏檢，有條件的實(shí)驗(yàn)室可以采取多種檢測(cè)手段相互印證結(jié)果。（3）操作技術(shù)未掌握。比如，染色鏡檢時(shí)，盡管是球菌，卻因染色劑過(guò)期或者脫色時(shí)間延長(zhǎng)而將本是革蘭氏陽(yáng)性的球菌判斷成陰性球菌，造成假陰性；或是因?yàn)榻?jīng)驗(yàn)不足未能挑取典型菌落進(jìn)行鑒定而造成假陰性。