李玲 周偉 李璐 王洋 孫學亮 梁麗雅 馬儷珍

摘 要：采用高通量轉錄組測序和實時定量聚合酶鏈式反應（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）

技術，在分子水平揭示養(yǎng)殖密度對斑節(jié)對蝦肌肉品質形成的影響機制。選取養(yǎng)殖密度100 尾/m2、300 尾/m2的斑節(jié)對蝦為實驗材料，進行轉錄組測序和qRT-PCR驗證。結果表明：所有樣本Q20和Q30的最小值均大于90%，測序數(shù)據(jù)均滿足生物信息學分析的要求;不同密度養(yǎng)殖條件下，斑節(jié)對蝦的差異表達基因為778 個;將差異基因序列與7 個數(shù)據(jù)庫進行比對，得到不同密度養(yǎng)殖的斑節(jié)對蝦中與肌肉品質相關的差異基因分布在膠原蛋白代謝、蛋白水解、蛋白轉運、細胞蛋白代謝、細胞骨架組織、肌肉連接及葡萄糖代謝途徑;qRT-PCR驗證結果與轉錄組測序結果一致。

關鍵詞：斑節(jié)對蝦;養(yǎng)殖密度;肌肉品質;轉錄組;分子機制

Transcriptomic Analysis of the Molecular Mechanism of the Effect of Stocking Density on the Quality of Penaeus monodon

LI Ling1， ZHOU Wei1， LI Lu1， WANG Yang2， SUN Xueliang2， LIANG Liya1， MA Lizhen1，*

（1.College of Food Science and Biological Engineering， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China;

2.College of Aquaculture， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China）

Abstract： The molecular mechanism of the effect of stocking density on the muscle quality of Penaeus monodon was elucidated by high-throughput transcriptome sequencing and quantitative real time polymerase chain reaction （qRT-PCR）. Two stocking densities of 100 and 300 tails/m2 were selected in this study. Among the 6 samples， the minimum values of Q20 and Q30 were more than 90%， and all sequencing data met the requirements of biological information analysis. A total of 778 differentially expressed genes were found between the stocking densities， and their sequences were aligned against seven databases. The differentially expressed genes related to shrimp muscle quality were mainly involved in collagen metabolism， proteolysis， protein transport， cell protein metabolism， cytoskeletal tissues， muscle connectivity， and glucose metabolism. The qRT-PCR results were consistent with transcriptome sequencing.

Keywords： Penaeus monodon; stocking density; muscle quality; transcriptome; molecular mechanism

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200924-233

中圖分類號：TS254.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）12-0001-06

引文格式：

李玲， 周偉， 李璐， 等. 基于轉錄組學的養(yǎng)殖密度影響斑節(jié)對蝦品質的分子機制[J]. 肉類研究， 2020， 34（12）： 1-6. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200924-233.? ? http：//www.rlyj.net.cn

LI Ling， ZHOU Wei， LI Lu， et al. Transcriptomic analysis of the molecular mechanism of the effect of stocking density on the quality of Penaeus monodon[J]. Meat Research， 2020， 34（12）： 1-6. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200924-233.

http：//www.rlyj.net.cn

斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）俗稱虎蝦，與中華對蝦和南美白對蝦并稱為世界三大水產養(yǎng)殖蝦[1]。斑節(jié)對蝦具有生長快、抗病力和對環(huán)境適應性強、養(yǎng)殖成本低、肉質鮮美、營養(yǎng)豐富等特點，深受養(yǎng)殖戶和消費者喜愛，是東南亞和我國重要的水產養(yǎng)殖經濟物種[2]。在工廠化養(yǎng)殖過程中，密度會影響水生動物的生存和生長、福利和健康、生理代謝等。提高養(yǎng)殖密度有利于增加產量并降低生產成本，但是當養(yǎng)殖密度過高時，水生動物又會產生應激生理反應和種內競爭，其生長、生存和生理代謝會受到影響。隨著水產養(yǎng)殖工業(yè)化的快速發(fā)展，一些養(yǎng)殖者盲目提高養(yǎng)殖密度以追求高產量，結果會加劇種內競爭、疾病惡化和水環(huán)境污染。因此，養(yǎng)殖密度是影響水產品質量的重要因素之一，研究養(yǎng)殖密度對水產品肌肉品質的影響具有重要意義。

養(yǎng)殖密度對水產品肉質和風味影響的報道較少，主要集中在對大菱鲆、鯧鲹魚、克氏原螯蝦、羅氏沼蝦等生理指標方面的研究。目前利用轉錄組測序技術研究肉品質的形成主要集中在金茅黑雞胸肌的品質性狀[3]、南方黃牛肌肉嫩度相關信號通路及其關鍵基因[4]等方面，鮮見關于水產動物肉品質轉錄組測序方面的研究。在分子層面上，決定肉質性狀的大多數(shù)肌內脂肪和肌纖維受基因調控[5]，具有穩(wěn)定的高度遺傳性[6]，已經確定影響肉品質的主要基因為Halothane（Hal）和Rendement Napole（RN）基因[7]。目前通過轉錄組測序技術研究肉品質形成的分子機制已有一些研究。張鳳[8]通過Illumina Solexa測序技術獲得與豬脂肪發(fā)育相關的基因是WISP2和KLF6。邢凱等[9]用轉錄組測序篩選到長白豬、松遼黑豬中調控脂肪沉積的多個重要基因和通路。

Li Guoxi等[10]采用miRNA-seq研究不同日齡榮昌豬背部皮下脂肪中的差異miRNA。彭興[11]構建不同發(fā)育時間點的豬骨骼肌miRNA文庫，并結合Solexa高通量測序初步確定影響肌肉增殖分化、參與骨骼肌生長調控的miRNA及其靶基因。Hou Xinhua等[12]在通城豬背最長肌混合RNA文庫中檢測出275 個miRNAs，確定miR-378與骨形成蛋白2和絲裂原活化蛋白激酶1有關。朱嘉宇[13]以豬不同類型肌肉組織為樣本，采用轉錄組測序技術研究肌肉發(fā)育和肌纖維類型的關系。湖羊的肌肉生長發(fā)育及肉質形成與MYL3、ACTG2基因及ACTG2基因5端非翻譯區(qū)（長度83 bp）的剪接形式有關[14]。

目前應用高通量測序技術揭示水生動物肉品質形成的研究還很少。通過分析比較不同密度養(yǎng)殖的斑節(jié)對蝦的一系列品質和風味指標，本團隊已經確定隨著養(yǎng)殖密度的增大，蝦肌肉水分和灰分含量升高，粗蛋白和總糖含量降低，持水力極顯著降低，感官和質構品質降低[15]。

100 尾/m2密度養(yǎng)殖的斑節(jié)對蝦品質和風味更好[16]，但是具體機制尚不清楚。所以，本研究采用高通量轉錄組測序和實時定量聚合酶鏈式反應（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術，在分子水平上揭示養(yǎng)殖密度對斑節(jié)對蝦肌肉品質的影響機理，以期為養(yǎng)殖戶選擇適宜的養(yǎng)殖密度、提高斑節(jié)對蝦的肌肉品質、優(yōu)化養(yǎng)殖模式、降低養(yǎng)殖成本等方面提供數(shù)據(jù)支持和理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘南海1號斑節(jié)對蝦苗，長度2 cm，購自中國水產科學研究院南海水產研究所，在天津橫潛水產養(yǎng)殖有限公司進行養(yǎng)殖。養(yǎng)殖密度為100 尾/m2（M1）和300 尾/m2（M3）。高位池養(yǎng)殖模式，養(yǎng)殖條件為溶解氧5 mg/L以上，透明度30～40 cm，水溫26～28 ℃，餌料人工喂養(yǎng)，每天投喂4～5 次，養(yǎng)殖周期84 d。整個養(yǎng)殖過程中蝦生長、發(fā)育情況良好。每個養(yǎng)殖條件同時做3 次重復，蝦長成后取樣進行實驗。

Green Real-time PCR Master Mix 日本Toyobo公司。

1.2 儀器與設備

NanoDrop微量紫外-可見分光光度計 美國Thermo Fisher科技公司;Qubit熒光定量儀 美國ABI公司;Agilent 2100生物分析儀 美國安捷倫公司;CFX96 qRT-PCR儀 美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取和高通量測序

用Trizol法提取斑節(jié)對蝦肌肉總RNA。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA是否發(fā)生降解和被污染。用微量紫外-可見分光光度計檢測RNA的純度（OD260 nm/OD280 nm）。利用熒光定量儀和生物分析儀分別對RNA濃度和完整性進行精確定量，確保用于轉錄組測序的RNA質量。然后由諾禾致源基因研究中心完成測序文庫構建和高通量測序（Illumina HiSeqTM）。數(shù)據(jù)處理和分析參考鄺良德[17]、Bemer[18]等的方法。依據(jù)測序結果中的基因功能（gene ontology，GO）注釋，并結合KEGG數(shù)據(jù)庫分析差異顯著基因參與的代謝通路。

1.3.2 不同樣本中差異基因相對表達量分析

參照Brown等[19]的方法，通過qRT-PCR技術，分析轉錄組測序數(shù)據(jù)中差異倍數(shù)較大的部分基因的相對表達量，所用引物如表1所示。

qRT-PCR擴增體系：20 ng cDNA樣品中加入2.5 μL SYBR? Green Real-time PCR Master Mix、400 nmol/L特異性引物，用雙蒸水將體系體積補至25 μL。待測體系置于CFX96 qRT-PCR儀中，設定擴增條件為：95 ℃預變性1 min;95℃、15 s，60℃、15 s，72℃、45 s，以此條件擴增40 個循環(huán);結束后在95～60 ℃（16 s）條件下繪制溶解曲線。以actin為內參基因，以2-ΔΔCt計算待測基因相對表達量，ΔΔCt按下式計算。

ΔΔCt=（CtTarget-Ctactin）M3-（CtTarget-Ctactin）M1

式中：CtTarget為待測基因循環(huán)閾（cycle threshold，Ct）

值;Ctactin為內參基因Ct值;M1代表100 尾/m2密度養(yǎng)殖的樣品;M3代表300 尾/m2密度養(yǎng)殖的樣品。

1.4 數(shù)據(jù)處理

轉錄組測序數(shù)據(jù)用CASAVA Base Calling軟件、RSEM軟件分析，并與Nr（NCBI Non-Redundant Protein Sequences）、Nt（NCBI Nucleotide Sequences）、Pfam（Protein Family）、KOG（Eukaryotic Ortholog Groups）、Swiss-Prot（A Manually Annotated and Reviewed Protein Sequence Database）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）、GO 7 個數(shù)據(jù)庫進行比對。最終的數(shù)據(jù)通過Origin 95軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 斑節(jié)對蝦轉錄組測序數(shù)據(jù)質量評估

將原始序列（Raw Reads）作為原始數(shù)據(jù)文件，通過CASAVA Base Calling軟件進行分析。因為原始序列包含接頭和低質量的序列，為了確保測序結果分析的準確性，必須對原始序列進行過濾，獲得Clean Reads。隨后的生物信息學分析都基于Clean Reads。測序數(shù)據(jù)的質量如表2所示。

下同。

由表2可知，在6 組樣品中，Q20的最小值為96.33%，Q30的最小值為90.57%，Q20和Q30均超過90%，表明所有測序數(shù)據(jù)均符合生物信息學分析的要求。

2.2 斑節(jié)對蝦轉錄組測序Reads與參考序列的比對

通過Trinity拼接獲得用于轉錄組分析的參考序列（ref），并將每個樣品的Clean Reads與參考序列進行比對。比對時采用RSEM軟件，Bowtie2設置為默認參數(shù)mismatches 0。

由表3可知，Clean Reads與參考序列匹配率為61.10%～66.86%，說明測序結果對于無參轉錄組的分析是可靠的。

2.3 差異基因的篩選

以不同密度養(yǎng)殖的斑節(jié)對蝦中基因Reads數(shù)之比為差異倍數(shù)，繪制火山圖，可以直觀顯示Pval和log2（差異倍數(shù)）

之間的關系，縱坐標為差異顯著性，-lg（Pval）越大，差異越顯著;P<0.05和|log2（差異倍數(shù)）|>1即為差異表達的基因。

Pval. 校正后的P值。

由圖1可知，不同密度養(yǎng)殖的斑節(jié)對蝦有778 個差異表達基因，其中365 個是上調基因，413 個是下調基因。

2.4 不同密度養(yǎng)殖的斑節(jié)對蝦肌肉中與品質相關的差異基因

不同密度養(yǎng)殖的斑節(jié)對蝦的差異基因涉及蛋白質代謝、肌肉發(fā)育和生長、碳水化合物代謝途徑。由圖2可知，100 尾/m2和300 尾/m2密度養(yǎng)殖的斑節(jié)對蝦肌肉中存在4 個與膠原蛋白相關的差異基因，包括2 個上調基因和2 個下調基因。與蛋白水解作用相關的差異表達基因有3 個，包括2 個上調基因和1 個下調基因。6 個上調基因參與蛋白質運輸。6 個上調基因與細胞蛋白質代謝調節(jié)相關。與細胞骨架組織有關的基因有12 個，包括2 個下調基因和10 個上調基因。2 個上調基因與骨骼系統(tǒng)發(fā)育相關。2 個下調基因與肌肉連通性相關。與糖酵解或糖異生有關的上調基因是細胞色素氧化酶C亞基Ⅷ、丙酮酸脫氫酶（乙酰轉移蛋白）激酶、丙酮酸脫氫酶激酶2/3/4、保守的假設蛋白和假設蛋白CAPTEDRAFT_177854基因，下調基因是ADP特異的磷酸果糖激酶、細胞色素C氧化酶集合因子2和細胞色素C氧化酶亞基Ⅱ基因。

2.5 與肌肉品質相關的差異基因的相對表達量

選擇轉錄組測序數(shù)據(jù)中具有顯著性差異和代表性的基因進行qRT-PCR驗證。以M1組基因的表達水平為基準，確定M3組相應基因的相對表達量。由表4可知，相比于100 尾/m2密度養(yǎng)殖，在300 尾/m2密度養(yǎng)殖的斑節(jié)對蝦中，神經絲重多肽、細胞色素P450 4C1、細胞色素氧化酶C亞基Ⅷ、丙酮酸脫氫酶（乙酰轉移）激酶、泛素結合酶E2O、網格蛋白適配復合物、突觸融合蛋白-8、微管蛋白復合物和ADP-核糖基化因子家族的相對表達量下調，其中細胞色素氧化酶C亞基Ⅷ、泛素結合酶E2O和ADP-核糖基化因子家族的相對表達量分別為0.049 3、0.048 2和0.080 9。這些基因的下調表達導致斑節(jié)對蝦蛋白代謝、糖代謝、蛋白質的泛素化修飾等途徑受到顯著抑制，對肉品質造成負面影響。其余基因在300 尾/m2密度養(yǎng)殖的斑節(jié)對蝦中表達上調，緊密連接蛋白ZO-1在M3組的表達量是M1組的13.973 1 倍，細胞色素C氧化酶集合因子2基因在M3組的相對表達量為9.049 3。

3 討 論

轉錄組測序結果揭示不同密度養(yǎng)殖的斑節(jié)對蝦的差異基因位于蛋白質代謝、肌肉發(fā)育和生長、碳水化合物代謝途徑。qRT-PCR進一步驗證了轉錄組測序的結果。神經絲重多肽是軸突的主要結構蛋白，是成熟髓鞘結構形成的重要標志之一[20]。Wang等[21]證實，神經絲重多肽是一種中間纖維成分，保護足狀突細胞免受損傷。細胞色素C氧化酶位于線粒體呼吸鏈末端，參與電子傳遞，并將質子從線粒體膜內側泵到線粒體膜外側[22]。丙酮酸脫氫酶系在糖代謝調控中起重要作用，催化丙酮酸不可逆氧化脫羧生成乙酰輔酶A，并將糖酵解途徑與檸檬酸循環(huán)連通[23-24]。丙酮酸脫氫酶激酶可以通過磷酸化調節(jié)丙酮酸脫氫酶系的活性[25]。泛素化是真核生物中一種常見的蛋白質降解途徑，調節(jié)細胞周期、DNA修復、逆境脅迫和蛋白質的細胞內定位等生物學過程[26]。泛素結合酶是泛素/蛋白酶體途徑的重要組成部分，在蛋白質泛素化中有重要作用。網格蛋白適配器復合體在協(xié)調網格蛋白涂層的組裝中發(fā)揮了重要作用[27]。Renigunta等[28]研究發(fā)現(xiàn)，通過網格蛋白介導的內吞作用，以協(xié)同方式將未組裝的突觸融合蛋白-8和鉀通道內化。ADP核糖基化因子在所有真核細胞中均有表達，并涉及囊泡運輸、脂質代謝、微管動力學和細胞過程等方面[29]。300 尾/m2高密度養(yǎng)殖導致斑節(jié)對蝦額外的能量代謝增強，與倪嘉豪等[30]對銀鯧幼魚的研究一致，降低了斑節(jié)對蝦的生長性能，導致肉品質遠低于100 尾/m2低密度養(yǎng)殖組。