劉 萍 ， 鐘 佳 ， 卞藝斐 ， 鐘 沅 ， 劉鐘杰

(1. 浙江農(nóng)林大學(xué)動物科技學(xué)院·動物醫(yī)學(xué)院 ， 浙江 杭州 311304 ； 2. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193 ； 3. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 ， 北京 海淀 100193)

槐花散是中獸醫(yī)傳統(tǒng)方劑，最早見于《普濟(jì)本事方》?；被ㄉ⒂苫被?SophorajaponicaL.)、側(cè)柏葉[Platycladusorientalis(L.)Franco]、荊芥(SchizonepetatenuifoliaBriq.)和枳殼(CitrusaurantiumL.)成方。全方清腸止血，疏風(fēng)行氣，是治療腸風(fēng)、臟毒的常用方。本研究應(yīng)用葡聚糖硫酸鈉(Dextran sulphate sodium, DSS)誘導(dǎo)大鼠試驗(yàn)性結(jié)腸炎模型，探究槐花散對結(jié)腸炎大鼠的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 槐花(炒)、側(cè)柏(炒炭)、荊芥(炒炭)和枳殼(炒)，均購自北京同仁堂馬連洼分店。葡聚糖硫酸鈉(DSS，分子量36 000～50 000)，購自北京酷來搏科技有限公司；便隱血試劑盒，購自珠海貝索生物科技有限公司；大鼠C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)和大鼠單核細(xì)胞趨化蛋白-1(Monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1) ELISA試劑盒，均購自武漢默沙克生物科技有限公司；大鼠白介素1β(Interleukin-1β, IL-1β)和大鼠腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α) ELISA試劑盒，均購自美國R&D公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級SD大鼠，7周齡，體重(260±20)g， 購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。試驗(yàn)前飼養(yǎng)于通風(fēng)獨(dú)立籠具系統(tǒng)3 d，以消除應(yīng)激。

1.3 方法

1.3.1 槐花散藥液的制備 準(zhǔn)確稱量槐花100 g，側(cè)柏100 g，荊芥100 g，枳殼100 g，與3.2 L的蒸餾水混合，浸泡30 min后，加熱至沸騰。沸騰15 min后，倒出一半藥液，再小火煮沸30 min，濾出剩余藥液[1]。合并2次濾液后，經(jīng)3層濾紙過濾去除多余濾渣。過濾后的槐花散藥液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(45～50 ℃) 濃縮成濃度為1 g/mL的生藥液，分裝密封于-20 ℃ 保存。臨用前用蒸餾水配成工作藥液，使用蒸餾水作為空白對照。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動物分組和處理 大鼠隨機(jī)分為5組，每組6只。分別為空白對照組(CON)、模型對照組(DSS)、高濃度槐花散組(DSS/HA)、低濃度槐花散組(DSS/HB)和槐花散對照組(HHS)。灌胃1次/d(10:00)，每次2 mL，持續(xù)8 d。從灌胃第2天開始，給予5% DSS飲水，持續(xù)7 d?？瞻讓φ战M大鼠自由飲蒸餾水，每日2 mL蒸餾水灌胃；模型對照組大鼠自由飲5% DSS溶液，每日2 mL蒸餾水灌胃；高濃度槐花散組大鼠自由飲5% DSS溶液，每日2 mL 5.76 g/(kg·bw)槐花散溶液灌胃給藥；低濃度藥物組大鼠自由飲5% DSS溶液，每日2 mL 2.88 g/(kg·bw)槐花散溶液灌胃給藥；槐花散對照組大鼠自由飲蒸餾水，每日2 mL，5.76 g/(kg·bw)槐花散溶液灌胃給藥。

1.3.3 檢測指標(biāo)與方法

1.3.3.1 腸炎疾病活動指數(shù)(Disease activity index,DAI)評分 參照文獻(xiàn)[2]進(jìn)行大鼠DAI判定。評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。其中，通過眼觀糞便顏色，同時按照潛血試劑盒說明書進(jìn)行糞便隱血檢測。DAI由體重降低率評分、糞便性狀評分和隱血評分相加而得。

表1 大鼠腸炎活動指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.3.2 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察 取結(jié)腸段固定于中性甲醛24 h后，石蠟包埋、切片、H.E.染色，進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.3.3.3 細(xì)胞因子水平測定 心臟采血4 ℃靜置過夜，3 000 r/min離心10 min取上清后，按照試劑盒說明書進(jìn)行血清TNF-α和IL-1β水平檢測；取1 g結(jié)腸組織，制成10%勻漿取上清后，按照試劑盒說明書進(jìn)行組織MCP-1和CRP水平檢測。

1.4 數(shù)據(jù)處理 使用SPSS 17.0軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析處理。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示，單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗(yàn)試驗(yàn)組間差異性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 槐花散對大鼠腸炎癥狀的影響 造模第2天起，除空白對照組和槐花散對照組，給予DSS飲水的各組大鼠均出現(xiàn)不同程度腹瀉，精神沉郁和弓背表現(xiàn)。造模第4天，模型對照組出現(xiàn)糞便隱血強(qiáng)陽性甚至明顯血便，而各藥物治療組大鼠腹瀉、弓背癥狀相對改善。造模第7天，模型對照組大鼠腹瀉嚴(yán)重，弓背明顯，蜷縮扎堆，被毛逆立，精神萎靡。高濃度槐花散組和低濃度槐花散組大鼠癥狀有不同程度的減輕。

2.2 槐花散對腸炎DAI評分的影響 如圖1所示，與空白對照組大鼠相比，模型對照組大鼠DAI評分顯著升高(P<0.05)；與模型對照組大鼠相比，高濃度槐花散組大鼠腸炎DAI顯著降低(P<0.05)，而低濃度槐花散組雖然有降低趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)。

圖1 大鼠腸炎DAI評分情況

2.3 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察 如中插彩版圖2所示，空白對照組大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞排列整齊，微絨毛清晰可見，腺體結(jié)構(gòu)完整，隱窩結(jié)構(gòu)完整；模型對照組大鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞嚴(yán)重脫落，微絨毛完全消失，隱窩結(jié)構(gòu)模糊不清，炎性細(xì)胞廣泛浸潤；高濃度槐花散組大鼠結(jié)腸黏膜完整，上皮細(xì)胞排列較整齊，微絨毛可見，隱窩結(jié)構(gòu)完整，伴有輕微炎性細(xì)胞浸潤；低濃度槐花散組大鼠結(jié)腸黏膜較完整，無明顯上皮細(xì)胞脫落，微絨毛不明顯，隱窩結(jié)構(gòu)較完整。

2.4 槐花散對結(jié)腸炎大鼠血清TNF-α和IL-1β水平的影響 如圖3所示，與空白對照組相比，模型對照組大鼠的血清TNF-α水平顯著性升高(P<0.05)。與模型對照組相比，高濃度槐花散組和低濃度槐花散組的血清TNF-α水平顯著性降低(P<0.05)；與空白對照組相比，模型對照組大鼠的IL-1β水平顯著性升高(P<0.05)。與模型對照組相比，高濃度槐花散組和低濃度槐花散組大鼠血清IL-1β水平顯著性降低(P<0.05)。

圖3 槐花散對大鼠血清TNF-α和IL-1β水平的影響

2.5 槐花散對結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸MCP-1和CRP水平的影響 如圖4所示，與空白對照組相比，模型對照組大鼠的結(jié)腸CRP水平顯著性升高(P<0.05)。與模型對照組相比，高濃度槐花散組和低濃度槐花散組的結(jié)腸CRP水平顯著性降低(P<0.05)；與空白對照組相比，模型對照組大鼠結(jié)腸MCP-1水平顯著性升高(P<0.05)。與模型對照組相比，高濃度槐花散組和低濃度槐花散組大鼠結(jié)腸MCP-1水平顯著性降低(P<0.05)。

圖4 槐花散對大鼠結(jié)腸CRP和MCP-1水平的影響

3 討論

槐花散是中藥傳統(tǒng)方劑，最早見于南宋《普濟(jì)本事方》?；被ㄉ⒂苫被?、側(cè)柏葉、荊芥、枳殼構(gòu)成，方中槐花為君藥，清大腸濕熱、涼血止血；側(cè)柏葉、荊芥為臣藥，側(cè)柏助槐花涼血止血，荊芥祛風(fēng)理血；枳殼為佐、使藥，寬腸利氣[3]。全方清腸止血，疏風(fēng)行氣，治腸風(fēng)，臟毒，證屬濕熱內(nèi)蘊(yùn)者。近年來，槐花散常用于治療一系列出血性下消化道疾病，如潰瘍性結(jié)腸炎和出血性腸炎[4-5]。本研究利用DSS誘導(dǎo)大鼠急性試驗(yàn)性結(jié)腸炎，以評估槐花散水煎劑對急性試驗(yàn)性結(jié)腸炎的保護(hù)作用。

葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型發(fā)病機(jī)制和臨床表現(xiàn)與人類的潰瘍性結(jié)腸炎類似[6]。本試驗(yàn)中，大鼠接受5% DSS飲水7 d后，表現(xiàn)出嚴(yán)重腹瀉，血便，被毛逆立，萎靡扎堆。結(jié)腸組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞嚴(yán)重脫落，隱窩結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，伴有廣泛的炎性細(xì)胞浸潤。說明本試驗(yàn)成功建立了DSS致大鼠急性試驗(yàn)性結(jié)腸炎模型。為了進(jìn)一步研究槐花散對結(jié)腸炎大鼠的治療作用，本試驗(yàn)使用DAI判斷大鼠腸炎活動性程度；通過TNF-α和IL-1β水平評估大鼠全身炎性反應(yīng)程度，同時通過結(jié)腸組織病理學(xué)觀察和結(jié)腸炎性因子CRP和MCP-1水平評估局部炎性反應(yīng)程度，以綜合判斷槐花散對試驗(yàn)性結(jié)腸炎的有效性。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)槐花散給藥劑量為每天5.76 g/(kg·bw)時，腸炎大鼠的DAI顯著降低。給藥劑量較低為2.88 g/(kg·bw)時，腸炎大鼠DAI有降低趨勢，但無顯著性差異。DAI結(jié)果表明，槐花散能有效降低急性期腸炎活動性。從結(jié)腸病理學(xué)觀察結(jié)果來看，2.88 g/(kg·bw)、5.76 g/(kg·bw)劑量槐花散皆能有效維持結(jié)腸黏膜完整性，降低炎性細(xì)胞浸潤和以及緩解腸炎大鼠結(jié)腸炎癥反應(yīng)。槐花散有效降低血清中炎性因子TNF-α和IL-1β的濃度，以減弱腸炎進(jìn)程中的全身性炎癥，保護(hù)腸炎大鼠。此外，2.88 g/(kg·bw)、5.76 g/(kg·bw)劑量槐花散能顯著降低結(jié)腸CRP和MCP-1水平。腸炎進(jìn)程中，CRP是炎癥急性反應(yīng)期重要蛋白標(biāo)志物之一[7]，MCP-1在炎癥反應(yīng)中激活和趨化單核細(xì)胞[8]。二者的變化反映了槐花散能有效抑制結(jié)腸局部炎癥，控制炎癥進(jìn)展。

本試驗(yàn)表明，槐花散能顯著緩解試驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠癥狀，修復(fù)結(jié)腸黏膜損傷，降低血清促炎因子TNF-α和IL-1β濃度，下調(diào)結(jié)腸CRP和MCP-1水平?；被ㄉ⒑胸S富的蘆丁、槲皮素、山奈酚、黃芩苷等有效成分，這些成分均被證明有良好的體內(nèi)體外抗炎和抗氧化效果[9-11]，這可能是槐花散發(fā)揮抗炎作用，有效治療下消化道出血的主要原因。后續(xù)研究可針對槐花散及其主要成分的主要抗炎靶點(diǎn)做進(jìn)一步探討。