徐 靜 ， 馮永其 ， 段俊堂 ， 劉 蓬

(上海野生動物園 ， 上海 浦東 201399)

檸檬酸桿菌(Citrobacter)屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，是發(fā)酵型革蘭陰性菌，周身有鞭毛，無莢膜，無芽孢，廣泛存在于土壤、水、食物等自然環(huán)境中，是水體污染的重要細菌學指標之一[1-3]。其中，弗氏檸檬酸桿菌常與人和動物的感染有關。弗氏檸檬酸桿菌是人和動物腸道內的正常菌群，并且也普遍存在于自然界中，是條件致病菌。近年來，不斷有報道表明該菌可引起人和動物腹瀉、肺炎及食物中毒等癥狀，能引起細菌性的系統(tǒng)敗血癥。本文報道了弗氏檸檬酸桿菌引起灰鸚鵡敗血癥的病例，為同行診治提供參考。

1 發(fā)病情況

2019年5月17日，本園1只灰鸚鵡死亡，隨即進行剖檢診斷，發(fā)現(xiàn)其肝臟腫大，有散在出血點，腸道呈現(xiàn)大片出血。在無菌條件下，從灰鸚鵡心、肝、脾、肺、腎和腸道取樣，劃線接種于哥倫比亞血瓊脂平板上。

2 實驗室診斷

2.1 細菌培養(yǎng)特征 各臟器培養(yǎng)均有細菌生長，且在哥倫比亞血瓊脂平板上生長良好，菌落形態(tài)呈圓形、表面光滑、中間隆起、邊緣整齊，有α溶血現(xiàn)象。挑選單個菌落進行純化培養(yǎng)，并用鑒定培養(yǎng)基鑒定：在顯色培養(yǎng)基麥康凱上為無色，S.S.瓊脂上為黑色，伊紅-美藍上為銅黑色，中國藍上為藍色。革蘭染色結果為革蘭陰性，短桿狀，兩端鈍圓，無芽孢。將此分離株命名為SH20190518。

2.2 細菌16S rDNA檢測 將細菌分離株提取核酸，并進行16S rDNA鑒定。其PCR擴增在1 500 bp左右出現(xiàn)特異性條帶，目的條帶與預期大小一致(圖1)。將PCR擴增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

圖1 16S rDNA PCR結果

2.3 測序結果比對 將細菌分離株SH20190518序列提交到NCBI上進行BLAST比對，結果顯示，分離株16S rDNA與弗氏檸檬酸桿菌的相似度達到了97.97%以上。選取同源性較高的弗氏檸檬酸桿菌的16S rDNA基因序列作為內群；同時，選取沙門菌、大腸桿菌、志賀菌、肺炎克雷伯菌作為外群,利用MEGA 6.0 軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果顯示，分離株與弗氏檸檬酸桿菌聚為一類(圖2)。綜上所述，分離株SH20190518為弗氏檸檬酸桿菌。

2.4 藥敏試驗 按標準紙片瓊脂擴散法對分離株進行藥敏試驗，結果顯示，分離株對頭孢克洛、頭孢克肟高度敏感；對氧氟沙星、恩諾沙星、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星中度敏感；對阿奇霉素、阿莫西林不敏感。

2.5 動物試驗 用6～8周齡雌性的SPF BALB/c 小鼠進行細菌的毒力試驗，分為腹腔注射組和空白對照組，每組3只，每只0.5 mL(細菌濃度為109CFU/mL)。 結果顯示：空白對照組小鼠精神狀態(tài)無異常；腹腔注射組3只小鼠于24 h內全部死亡，取其中1只小鼠進行剖檢分析并進行臟器細菌培養(yǎng)。死亡小鼠心、肝、脾、肺、腎均出現(xiàn)不同程度出血、壞死，分離出的細菌形態(tài)與接種的弗氏檸檬酸桿菌形態(tài)一致，但是細菌出現(xiàn)β溶血現(xiàn)象。由此可見，分離株弗氏檸檬酸桿菌有一定的致病性，并且在小鼠體內復制后致病性增強。

圖2 分離株系統(tǒng)進化樹

3 討論

筆者從患病的灰鸚鵡臟器中分離到1株細菌，基于該菌的形態(tài)學及16S rDNA基因序列分析，與弗氏檸檬酸桿菌的相似度達97.97%以上，確認該菌為弗氏檸檬酸桿菌。

弗氏檸檬酸桿菌屬于腸桿菌科，該細菌主要引起呼吸道、消化道以及泌尿生殖道感染，尤其是在嬰幼兒及免疫功能不全的人群中，可引起腦膜炎、腦膿腫及新生兒敗血癥等。2000—2012年，我國先后有5起弗氏檸檬酸桿菌引起人食源性中毒，進而發(fā)生嚴重腹瀉的報道[4-6]。然而，弗氏檸檬酸桿菌對動物致病的重要性尚未確定。近年來，該菌引起魚、鱉、蝦、大鯢、蟹等水產(chǎn)動物感染發(fā)病的報道較多[7-9]。弗氏檸檬酸桿菌對水生動物的致病報道多于非水生動物，且對哺乳動物的感染主要集中在腸道內，對鳥類和爬行動物的感染主要在腸道外。2011年，Ewers等[10]報道了該菌對犬、貓、馬和鸚鵡存在致病性。

有研究表明，弗氏檸檬酸桿菌的致病性與其脂多糖結構、耐藥基因及致病基因有很大關系。嚴玉霖等[11]研究發(fā)現(xiàn)，內毒素為脂多糖中的主要毒力成分，可在細菌溶解或活躍繁殖時釋放，并引起宿主免疫應答，危害人畜健康。周加利[12]發(fā)現(xiàn)，弗氏檸檬酸桿菌脂多糖中的O抗原種類對人和動物有很強的感染力，并且對內毒素的毒力作用有調控能力。本文根據(jù)分離株的藥敏試驗，對同群灰鸚鵡進行頭孢菌素類藥物預防，以減少動物死亡。小鼠毒力試驗表明，分離株在小鼠體內復制后，毒力增強。因此，應當加強細菌的致病基因與其致病性之間的作用機理的研究。