洪家兵 ， 王 萍 ， 王曉玥 ， 于非可 ， 劉文曉 ， 李永清

[1.江西農業(yè)大學動物科學技術學院 ， 江西 南昌 330045 ； 2.北京市農林科學院畜牧獸醫(yī)研究所 畜禽疫病防控技術北京市重點實驗室 ， 北京 海淀 100097 ； 3. 北京農學院 獸醫(yī)學(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室 ， 北京 昌平 102206]

雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由雞傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的一種急性、高度接觸性的免疫抑制性疾病[1-2]。IBDV主要感染3周齡左右的幼雞，病雞通常表現(xiàn)出精神沉郁、下痢、共濟失調等臨床癥狀[3]。自1962年美國首次報道該病以來，IBD不斷在世界范圍內蔓延，給我國乃至全世界的養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經濟損失[4]。

IBDV對許多消毒劑具有很強的抵抗力，很難從受污染的家禽場所中清除，疫苗接種仍是防治IBD的唯一可行選擇?，F(xiàn)階段傳統(tǒng)經典毒株的減毒活疫苗和滅活疫苗仍是防治IBDV應用最廣泛的疫苗[5-6]，但是鑒于IBDV易變異、毒力返強的特點，傳統(tǒng)疫苗已不能對IBDV產生有效保護作用。作為一類新型疫苗，亞單位疫苗具有安全性高、純度高和穩(wěn)定性好等優(yōu)點，現(xiàn)已成為研究的熱點。

IBDV是雙鏈RNA病毒科的一類直徑約為70 nm 的非囊膜病毒，其基因組由2個大小不等的片段組成，A片段主要編碼VP2、VP3、VP4和VP5蛋白，B片段編碼具有RNA聚合酶活性的VP1蛋白[7-8]。作為IBDV的主要結構蛋白，VP2蛋白主要存在于病毒的核衣殼外表面，攜帶了病毒主要的中和性抗原表位，可誘導產生中和抗體，是開發(fā)雞IBD基因工程亞單位疫苗的首選蛋白[9-11]。本試驗利用Bac-to-Bac昆蟲表達系統(tǒng)高效、穩(wěn)定的分泌表達了IBDV VP2蛋白，為IBDV診斷試劑盒和基因工程亞單位疫苗的研究提供了有力工具。

1 材料與方法

1.1 材料 卡那霉素、X-Gal、氨芐青霉素、無內毒素質粒小提中量試劑盒，均購自天根生化科技(北京)有限公司；慶大霉素、四環(huán)素，均購自北京索萊寶科技有限公司；DNA膠回收試劑盒，購自OMEGA公司；FITC標記的山羊抗鼠IgG、HRP標記的山羊抗鼠IgG、DAPI、IPTG，均購自Sigma公司；HF502C昆蟲細胞無血清培養(yǎng)基，購自蘇州市沃美生物技術有限公司。

1.2 序列優(yōu)化及引物合成 從GenBank中下載已公布的雞IBDVVP2基因序列(登錄號KU530208.1)，根據(jù)昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)的密碼子偏好性對其進行密碼子優(yōu)化。在VP2序列的N端添加蜂毒肽[12]序列，C端添加6×His序列，優(yōu)化后的序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

根據(jù)桿狀病毒表達載體的核苷酸序列及優(yōu)化后的IBDVVP2基因，設計了1對同源臂擴增引物，在上下游引物分別添加酶切位點XhoI和NdeⅠ，由北京擎科生物科技有限公司合成。引物序列信息見表1。

1.3 桿狀病毒轉移載體的構建與鑒定 以密碼子優(yōu)化的VP2基因序列為模板，利用引物IBD029和IBD030進行PCR擴增，反應體系：10 μL 5×Prime-STAR Buffer (Mg2+Plus)，4 μL dNTP Mix，0.5 μL Prime STAR HS DNA Polymerase，1 μL IBD029，1 μL IBD030，1 μL模板和32.5 μL ddH2O；反應條件：94 ℃ 變性2 min,98 ℃變性10 s,56 ℃退火15 s，72 ℃延伸90 s，總延伸10 min。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果，回收PCR產物。利用限制性內切酶XhoI和NdeI處理pFast BacTM1，利用諾唯贊同源臂連接試劑盒將含有同源臂的VP2序列定向克隆到線性化的pFast BacTM1載體上，連接體系：0.65 μL線性化載體，3 μL插入片段，4 μL 5×CE Ⅱ Buffer，2 μL Exnase Ⅱ，10.35 μL ddH2O。將連接產物轉化感受態(tài)細胞DH5α，次日挑取陽性克隆，送北京擎科生物科技有限公司測序。

1.4 重組穿梭質粒的構建及鑒定 將構建成功的pFast-VP2轉移載體轉化新鮮制備的DH10BAC感受態(tài)細胞，在SOC培養(yǎng)基中37 ℃震蕩培養(yǎng)4 h。取100 μL菌液均勻涂布在含卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、IPTG和X-Gal的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取單個白色菌落，利用特異性引物和PUC/M13通用引物進行PCR鑒定，獲得重組桿粒rBac-VP2。擴大培養(yǎng)后，提取重組桿粒。

1.5 重組桿狀病毒的拯救與傳代 利用Invitrogen公司的ExpiFectamine Sf Transfection Reagent轉染試劑盒將重組穿梭質粒轉染至昆蟲細胞SF9，28 ℃培養(yǎng)。每天觀察細胞狀態(tài)，待第4天細胞出現(xiàn)明顯病變時，收集細胞培養(yǎng)上清為P0代桿狀病毒。將P0代桿狀病毒接種昆蟲細胞SF9，盲傳至P3代，鑒定重組桿狀病毒。

1.6 VP2蛋白在SF9細胞中的表達及鑒定

1.6.1 PCR鑒定 提取P2代重組桿狀病毒基因組，利用特異性引物和M13通用引物采用1.3中的反應體系和程序進行PCR鑒定。

1.6.2 間接免疫熒光(IFA)鑒定 將P2代毒接種于6孔板，感染生長良好的SF9細胞，27 ℃避光培養(yǎng)72 h。當細胞病變達到70%左右時，參考文獻[13]的方法進行IFA鑒定，6×His單抗(1∶500倍稀釋)為一抗、FITC標記的山羊抗鼠IgG(1∶10 000倍稀釋)為二抗。

1.6.3 Western Blot鑒定 將P2代重組桿狀病毒接種于透氣的T175細胞培養(yǎng)瓶，感染處于對數(shù)生長期的SF9細胞，待細胞病變達到70%左右時，將細胞悉數(shù)吹下，3 000 r/min離心6 min，分別收集細胞培養(yǎng)上清和細胞沉淀。按照常規(guī)Western Blot操作步驟進行試驗，6×His單抗(1∶5 000倍稀釋)為一抗、HRP標記的山羊抗鼠IgG(1∶10 000倍稀釋)為二抗。

1.7 VP2蛋白的表達條件優(yōu)化與純化 將P3代毒接種三角搖瓶，感染處于對數(shù)生長期的High Five細胞，分別于48、60、72、84 h和96 h取1 mL細胞培養(yǎng)液，離心分別收集細胞培養(yǎng)上清進行Western Blot鑒定，以確定VP2蛋白的最佳表達條件。擴大培養(yǎng)，收集感染病毒的細胞培養(yǎng)液，用His純化柱純化目的蛋白。

1.8 VP2蛋白反應原性研究 將P3代重組桿狀病毒接種100 mL High Five細胞，培養(yǎng)72 h。12 000 r/min 離心10 min，分別收集細胞沉淀和細胞上清。細胞沉淀經PBS重懸后，超聲裂解，離心收集上清。參照文獻[14]的方法進行瓊脂擴散試驗，檢測重組VP2蛋白與IBDV陽性血清的反應原性。

2 結果

2.1VP2基因的PCR擴增 利用設計的同源臂引物PCR擴增IBDVVP2基因，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得了大小約為1 470 bp的擴增產物，與預期結果相符，見圖1。

圖1 VP2基因片段PCR擴增

2.2 重組穿梭質粒rBac-VP2的PCR鑒定 以M13通用引物和VP2特異性引物對重組穿梭質粒rBac-VP2進行PCR鑒定。如圖2所示，特異性引物擴增得到大小約為1 470 bp的目的條帶，M13通用引物擴增得到大小約為3 770 bp的條帶，均與目的大小相符，表明重組桿狀病毒質粒Bacmid-VP2構建成功。

2.3 重組桿狀病毒的PCR鑒定 提取P2代重組桿狀病毒基因組，用VP2特異性引物進行檢測，在1 470 bp 左右出現(xiàn)特異性條帶(如圖3所示)，說明VP2基因與桿狀病毒發(fā)生同源重組并成功感染了SF9細胞。

圖3 PCR鑒定VP2-Bac重組桿狀病毒

2.4 VP2蛋白的IFA鑒定 結果如中插彩版圖4所示，未感染重組桿狀病毒的SF9細胞無熒光，感染重組桿狀病毒的SF9細胞能檢測到明亮的綠色熒光。說明重組VP2蛋白在SF9細胞中成功表達。

2.5 VP2蛋白的Western Blot鑒定 結果如圖5所示，細胞培養(yǎng)上清和細胞沉淀中均可出現(xiàn)特異性條帶。再次說明重組VP2蛋白在SF9細胞中成功表達，并且可分泌到細胞培養(yǎng)上清中。

圖5 表達產物的Western Blot鑒定

2.6 VP2蛋白的純化 參照預表達結果，在大量表達VP2蛋白時選擇在接毒72 h后收獲細胞上清。經離心抽濾后，4 ℃條件下用蠕動泵掛鎳柱。然后用梯度濃度的咪唑(20、50 mmol/L和400 mmol/L)純化并洗脫VP2蛋白，各洗脫峰進行SDS-PAGE鑒定。結果如圖6所示，VP2蛋白掛鎳柱后50 mmol/L咪唑洗脫峰可見較大量的目的蛋白。

圖6 VP2蛋白SDS-PAGE分析

2.7 重組VP2蛋白的反應原性 以IBDV陽性血清作為中間孔，細胞培養(yǎng)上清和細胞沉淀超聲上清依次倍比稀釋后添加至周圍孔。加樣擴散24 h后，可見1∶8細胞培養(yǎng)上清稀釋孔仍可出現(xiàn)蛋白沉淀線，說明本試驗構建的重組桿狀病毒可以作為IBDV亞單位疫苗的候選株。見中插彩版圖7。

3 討論

1962年，IBDV首次在美國被發(fā)現(xiàn)，隨后傳播到全球每一個養(yǎng)禽的國家。我國學者周蛟1982年首次分離得到IBDV[15]，現(xiàn)今IBDV已在我國廣泛流行，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經濟損失。由于尚未出現(xiàn)IBD的特效藥，疫苗免疫仍然是防治IBDV的有效手段。目前市場上應用最多的還是經典毒株的減毒活疫苗和滅活疫苗，在一定程度上能降低IBDV的感染。但是變異株和超強毒株的出現(xiàn)加大了防控難度，因此亞單位疫苗成為了研究中關注的新方向。作為IBDV的主要結構蛋白，VP2蛋白主要存在于病毒的核衣殼外表面，攜帶了病毒主要的中和性抗原表位，可誘導中和抗體的產生，是開發(fā)雞IBDV亞單位疫苗的首選蛋白。目前，重組VP2蛋白已在不同的外源表達系統(tǒng)中得以表達，但是蛋白不能正確可溶性表達、表達量低仍舊是一大難題。

Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)對表達產物具有良好的翻譯后修飾作用，能使所表達的蛋白接近于天然蛋白的結構和活性。目前，該系統(tǒng)已成為外源重組蛋白表達的有力工具。本試驗先根據(jù)昆蟲細胞密碼子偏好性對VP2序列進行了密碼子優(yōu)化，采用同源臂連接技術，直接將目的基因定向克隆至表達載體pFast BacTM 1，這樣直接省去了連接克隆載體和酶切鑒定等一系列繁瑣步驟，大大的節(jié)省了人力物力。其次，本試驗在序列前端引入了蜂毒信號肽，Westren Blot結果顯示，目的蛋白可以分泌到細胞培養(yǎng)上清中，這在一定程度上減少了目的蛋白的降解，并且簡化了蛋白純化的步驟。同時本課題組利用Westren Blot對感染重組桿狀病毒后48、60、72、84 h和96 h目的蛋白表達量進行研究，結果顯示，48～72 h時蛋白表達量逐漸增加，72 h之后蛋白出現(xiàn)不同程度的降解。通過對蛋白表達時效的比較，能判斷出蛋白純化的最佳時間點。瓊脂擴散試驗顯示，細胞培養(yǎng)上清1∶8稀釋后仍可出現(xiàn)蛋白沉淀線，說明本試驗篩選獲得的重組桿狀病毒可以作為雞傳染性法氏囊病病毒亞單位疫苗的候選株，接下來本課題組將進一步對重組VP2蛋白的免疫效果進行評價，有望為IBDV的防治提供更加有效的制品。