殷莉陽 ， 鄭明學(xué) ， 呂強華 ， 白 瑞 ， 張 黎 ， 康慧鑫 ， 范炳靈 ， 段步婷

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 山西 太谷 030801)

雞球蟲病是由艾美耳球蟲屬的一種或多種球蟲寄生于雞腸道細胞引起的寄生性原蟲病[1-2]。柔嫩艾美耳球蟲(Emeriatenella,E.tenella)、毒害艾美耳球蟲(E.necatrix)、巨型艾美耳球蟲(E.maxima)和堆型艾美耳球蟲(E.acervulina)在雞場普遍存在且對雞的致病力強[3]，主要損傷雞的腸道，嚴重者可致死，病雞即使痊愈，其生長發(fā)育也會受到一定影響，增重緩慢，產(chǎn)蛋率降低[4]。據(jù)報道，全球的養(yǎng)雞業(yè)每年因此遭受的損失高達30億美元[5]。

化學(xué)藥物是多數(shù)雞場使用的一種防治雞球蟲病的方法，但其導(dǎo)致的耐藥性、藥物殘留和環(huán)境污染等問題無法解決，因此要尋找一條安全高效的途徑來防治雞球蟲病[6]。早熟弱毒活疫苗潛隱期短，致病力低，免疫原性得到保留，遺傳性能穩(wěn)定[7]，是防治雞球蟲病的最佳選擇，所以本試驗旨在對由E.tenella、E.necatrix、E.acervulina和E.maxima(山東株和山西株)早熟株制備的雞球蟲病四價五株活疫苗進行實驗室安全性研究，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 疫苗 雞球蟲病四價五株活疫苗(柔嫩艾美耳球蟲PTSX株+毒害艾美耳球蟲PNSX株+巨型艾美耳球蟲PMSX株+巨型艾美耳球蟲PMSD株+堆型艾美耳球蟲PASX株)，每羽份含孢子化卵囊(2 700±270)個，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)病理實驗室保存與提供。

1.1.2 實驗動物 1日齡SPF雛雞，由北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司提供SPF種雞蛋孵化而來。

1.2 試驗方法

1.2.1 一次單劑量接種 選40只體重相近的4日齡SPF雛雞，隨機分為一次單劑量接種組(T1、T2)和空白對照組(C1、C2)，每組10只。接種組以每只雞1羽份的推薦免疫劑量于4日齡雛雞進行1次接種，空白組不接種。接種后從精神、飲食、糞便、死亡數(shù)量方面每天觀察雞只并記錄，第5天時記錄血便記分。C1、T1組于第7天對雞只進行空腹稱重后剖檢，系統(tǒng)全面觀察心、肝、脾、肺、腎、腺胃、肌胃和三段腸道(十二指腸、空腸和盲腸)病理變化和3個腸段病變記分，取心、肝、脾、肺、腎、腺胃、肌胃和三段腸道，石蠟切片，H.E.染色，進行病理組織學(xué)檢查。C2、T2組于第14天進行稱重，之后處理同C1、T1組。

1.2.2 單劑量重復(fù)接種 將40只體重相近的4日齡SPF雛雞，隨機分為單劑量重復(fù)接種組(T3、T4)和空白對照組(C3、C4)，每組10只。接種組以每只雞1羽份的推薦免疫劑量于雞只4日齡和18日齡時各接種1次，空白組不處理。接種后臨床觀察方法同1.2.1項，并于二次接種后第7天和第14天分別對T3、C3組和T4、C4組雞只空腹稱重，剖檢與組織學(xué)檢查方法也同1.2.1項。

1.2.3 一次超劑量接種 將260只體重相近的4日齡SPF雛雞，隨機分為一次超劑量接種組(A11～A34/B11～B34)和空白對照組(C5、C6)，每組10只，共26組。A11～A34組和B11～B34組分別以3批疫苗(第1批、第2批、第3批)按推薦免疫劑量的10、20、30倍和100倍進行接種，C5、C6組不接種。接種后臨床觀察方法同1.2.1項，并于接種后第7天和第14天對A11～A34、C5組和B11～B34、C6組雞只空腹稱重，剖檢與組織學(xué)檢查方法也同1.2.1項。

1.3 檢測指標 參照郭鈺玨等[8]方法計算相對增重率(RWG)、死亡率，參照Johnson等[9]方法進行腸道(十二指腸、空腸和盲腸)病變記分。

1.4 數(shù)據(jù)處理 使用SPSS Statistics 22軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，用平均數(shù)±標準誤表示。

2 結(jié)果

2.1 一次單劑量接種 一次單劑量接種后雞只表現(xiàn)未見異常，未見死亡。接種后第7天(T1)和第14天(T2)接種組的RWG均≥80%，各組腸道病變記分均≤1，與空白對照組無顯著差異(P>0.05)，見表1。

剖檢發(fā)現(xiàn)，接種后第7天(T1組)少數(shù)雞只盲腸黏膜上有輕微出血點，其他腸段和組織器官無眼觀病變。鏡檢發(fā)現(xiàn)，雞只在接種第7天后十二指腸絨毛整體結(jié)構(gòu)完好，只有少量上皮細胞脫落，少量蟲體寄生于腸黏膜固有層內(nèi)；空腸、盲腸黏膜上皮損傷輕微，結(jié)構(gòu)較完整，固有層可見炎性細胞浸潤，可見少數(shù)蟲體寄生時的空泡和合子；接種雞只第14天(T2組)時，十二指腸未見蟲體寄生，只有少量上皮細胞呈局灶性輕微脫落；空腸、盲腸黏膜上皮無明顯脫落，結(jié)構(gòu)較完整，固有層內(nèi)有極少數(shù)蟲體寄生時的空泡和合子。空白對照組各組織器官剖檢和鏡檢均未見眼觀病變和病理變化。

表1 一次單劑量接種結(jié)果

2.2 單劑量重復(fù)接種 接種之后，各組雞只臨床癥狀均無異樣，也沒有死亡。二次接種后第7天(T3)和第14天(T4)接種組的RWG均≥80%，且T4組的RWG極顯著高于T3組(P<0.01)；各接種組雞腸道病變記分均≤1，T3組盲腸病變記分顯著高于對照組(P<0.05)，其他各組各腸道與空白對照組相比病變記分無顯著差異(P>0.05)，見表2。

剖檢發(fā)現(xiàn)，二次接種后第7天(T3組)，雞的十二指腸部位散在少量白色結(jié)節(jié)，少數(shù)雞只空腸輕微脹氣，極少數(shù)雞只盲腸有零星出血點，其余組織器官無眼觀病變。鏡檢發(fā)現(xiàn)，大部分十二指腸絨毛上皮細胞完好，只有少量的輕度脫落，有不同發(fā)育期的蟲體寄生于黏膜固有層內(nèi)(見中插彩版圖1)，空腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)較完整，上皮細胞少量脫落，有多數(shù)大配子體和合子存在黏膜固有層(見中插彩版圖2)，大部分盲腸絨毛結(jié)構(gòu)完好，上皮細胞灶狀脫落，固有層內(nèi)有個別蟲體寄生時留下的空泡和合子(見中插彩版圖3)；二次接種后第14天(T4組)鏡檢發(fā)現(xiàn)雞的十二指腸的個別絨毛不完整，有少量上皮細胞呈局灶性脫落，少量大配子體和合子存在于黏膜固有層；空腸和盲腸少量黏膜上皮細胞脫落，固有層內(nèi)可見少量合子?？瞻讓φ战M(C3、C4組)剖檢和鏡檢各組織器官未見眼觀病變和病理變化。

表2 單劑量重復(fù)接種結(jié)果

2.3 一次超劑量接種 接種第2天，100倍劑量接種組的雞只幾乎全部萎靡不振，食欲廢絕，蜷縮扎堆，站立不穩(wěn)，接種后6 d內(nèi)死亡率高達80.0%；其余劑量組雞只無死亡，未見明顯異常表現(xiàn)。按10、20、30、100倍推薦劑量接種的雞，隨接種劑量的加大RWG逐漸降低，3個腸段病變記分逐漸升高。接種組接種后第7天(A11～A34組)與對照組(C5組)各腸道病變記分差異顯著(P<0.05)，接種后第14天(B11～B34組)與對照組(C6組)各腸道病變記分差異不顯著(P>0.05)，各接種組至少有8只雞腸道病變記分≤1。

接種第7天，剖檢發(fā)現(xiàn)，10、20、30倍劑量試驗組雛雞，除3個腸段有少量白色結(jié)節(jié)或出血點外，其他組織器官無眼觀病變。100倍劑量接種組雛雞十二指腸黏膜嚴重出血，有成片的白色結(jié)節(jié)；空腸明顯脹氣；盲腸黏膜出血嚴重，腸腔內(nèi)含有大量血液或盲腸芯；病死雞喙部呈黑色，嗉囊腫脹明顯，內(nèi)容物為飼料顆粒和大量淡黃色液體；肝臟呈土黃色且顏色不均；腺胃乳頭腫脹，擠壓時可見淡黃色液體流出；少數(shù)雞只肌胃角質(zhì)層輕微糜爛；腎臟被膜剝離后，可見零星出血點；其余組織器官未見眼觀病變。

鏡檢100倍劑量接種組：十二指腸黏膜上皮少量脫落(見中插彩版圖4)，有不同發(fā)育期的蟲體寄生于固有層；空腸和盲腸黏膜上皮損傷較輕微，呈局部灶狀脫落(見中插彩版圖5、圖6)，上皮和固有層內(nèi)可見多量大配子體；肝細胞出現(xiàn)顆粒變性或水泡變性，一些細胞核溶解或濃縮壞死(見中插彩版圖7)；心肌纖維發(fā)生輕度顆粒變性(見中插彩版圖8)；腺胃黏膜皺襞灶狀斷裂，其上皮細胞變性、壞死、脫落(見中插彩版圖9)；腎小管上皮細胞多數(shù)腫脹、變性，部分細胞核溶解壞死，胞漿呈空泡狀(見中插彩版圖10)。

鏡檢10、20倍和30倍劑量接種組：3個腸段上皮細胞均有少量灶狀脫落，不同發(fā)育期的蟲體寄生在腸黏膜上皮層和固有層內(nèi)；其余組織器官未見病變?？瞻讓φ战M各組織器官均未見病理變化。

3 討論

一次單劑量接種、單劑量重復(fù)接種和10、20、30倍超劑量接種后雞只未見明顯異常表現(xiàn)，全部存活；剖檢后腸道病理變化不明顯，且所有雞只各腸道病變記分≤1.0，其他組織器官無眼觀病變。段嘉樹等[10]通過組織學(xué)觀察到早熟株的第2代裂殖子會變小，正是因為內(nèi)生發(fā)育最后1～2代裂殖生殖的缺陷，才導(dǎo)致早熟株的致病性大大降低。一次單劑量接種和單劑量重復(fù)接種雞的RWG均≥80%，超劑量接種時平均增重和RWG與接種劑量呈負相關(guān)，在一定程度上影響雞的增重，但屬于安全范圍。說明該疫苗單劑量一次和重復(fù)接種及10、20、30倍超劑量接種對雞是安全的，這和郭鈺玨等的試驗結(jié)果相符[8]。

100倍推薦劑量接種時雛雞表現(xiàn)異常、死亡率≥80%， 剖檢時腸道病變明顯，其他臟器表現(xiàn)不同程度的病理變化。崔小珍等[11]研究表明，0.464 g/(kg·bw)以上的重鉻酸鉀對雛雞的各內(nèi)臟器官均有不同程度的損傷，其對雛雞的LD50為0.501 g/(kg·bw)。剖檢和鏡檢100倍劑量組的雞發(fā)現(xiàn)其病理特性與崔小珍報道的重鉻酸鉀對臟器損傷的病理特性極為相似，并且100倍劑量接種的活疫苗中重鉻酸鉀的劑量約為0.676 g/(kg·bw)，遠大于LD50，因此，造成100倍劑量組雛雞死亡率高的原因主要是由于重鉻酸鉀濃度過高所致，所以不建議使用此劑量接種。