吳 蔚，趙艷霞

(武漢職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院,武漢 430074)

漢麻，俗稱大麻，漢麻籽中油脂和蛋白質(zhì)含量分別為40%～50%和25%～30%[1]。我國是全球漢麻籽最大生產(chǎn)國和出口國，目前漢麻籽的主要利用方式是提取漢麻纖維和制備高端植物油，而剩下大量富含蛋白質(zhì)的漢麻籽粕。如何充分利用豐富的漢麻籽粕資源開發(fā)高品質(zhì)的漢麻籽蛋白粉及其衍生物，已成為目前漢麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大問題[2]。

漢麻蛋白含有25%～37%的白蛋白和67%～75%的球蛋白，相比大豆分離蛋白，漢麻蛋白必需氨基酸含量更高[1]，同時富含含硫氨基酸[3]，且不含胰蛋白酶抑制劑，因而具有良好的消化吸收特性。此外，研究表明漢麻蛋白中精氨酸與賴氨酸的比值為5.5[4]，表明漢麻蛋白在預(yù)防心血管疾病等方面具有更高的潛在應(yīng)用價值。目前，食品生產(chǎn)加工過程中漢麻蛋白的應(yīng)用越來越多，如漢麻蛋白食用膜[5]、漢麻蛋白飲料[6]、漢麻面包[7]等。對漢麻蛋白深加工利用也有很多報道，如降血壓漢麻肽[8]、抗氧化漢麻肽[9]等。此外，還有研究報道漢麻蛋白具有增強免疫力和抗疲勞等功效[10-11]，因此漢麻蛋白在開發(fā)功能性產(chǎn)品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計顯示，全球約有1/3的人處于疲勞狀態(tài)，疲勞會降低學(xué)習(xí)和工作效率，特別是對于競技體育訓(xùn)練運動而言，如何緩解高強度訓(xùn)練疲勞程度，有效提高運動員的競技能力，是目前食品科學(xué)研究的一個熱點問題。目前，已有研究報道各種蛋白水解物具有一定的抗疲勞功能，如高F值玉米肽[12]、富含支鏈氨基酸多肽[13]等。然而，目前還沒有高F值或富含支鏈氨基酸漢麻肽的研究報道。

本試驗以漢麻籽粕為主要原料，采用胃蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶依次對漢麻籽粕進行酶解，然后利用活性炭將芳香族氨基酸除去，得到富含支鏈氨基酸的漢麻分離蛋白酶解物，并對其溶解特性和抗氧化性進行研究，為提高漢麻籽粕附加值和精深加工提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

漢麻籽粕：廣西巴馬，蛋白質(zhì)含量(53.15±1.33)%、脂肪含量小于1%。胃蛋白酶(50 100 U/g)、風(fēng)味蛋白酶(102 400 U/g)，上海索萊寶生物科技有限公司；2，2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)，Sigma公司；鹽酸、鄰苯三酚、鐵氰化鉀、三氯化鐵均為分析純。

pH-2型酸度計；LAMBDA 365紫外光譜，美國珀金埃爾默股份有限公司；恒溫水浴鍋；BS224S分析天平，賽多利斯科學(xué)有限公司；高速離心機；HX-1800全自動氨基酸分析儀；ALPHA 1-4 LD plus冷凍干燥機，德國Christ。

1.2 試驗方法

1.2.1 富含支鏈氨基酸漢麻分離蛋白酶解物生產(chǎn)工藝

漢麻籽粕(60 目)→堿提酸沉→漢麻分離蛋白(HPI)→胃蛋白酶酶解→風(fēng)味蛋白酶酶解→活性炭脫芳→冷凍干燥→富含支鏈氨基的漢麻分離蛋白酶解物(E-HPI)。

堿提酸沉工藝：按料液比1∶10加入0.05 mol/L氫氧化鈉溶液在pH 8條件下堿提1 h，離心(4 000 r/min，30 min)，上清液用1 mol/L HCl調(diào)pH至5，靜置30 min，離心(4 000 r/min，30 min)，將沉淀用適量蒸餾水溶解，調(diào)pH至7，冷凍干燥得到漢麻分離蛋白[4]。

HPI提取率=HPI中蛋白質(zhì)含量/原料中蛋白質(zhì)含量×100%

胃蛋白酶酶解工藝：取10 g HPI加入一定量的去離子水搖勻，加入一定量胃蛋白酶，在一定溫度下酶解一定時間，得到初步酶解液。

風(fēng)味蛋白酶酶解工藝：采用風(fēng)味蛋白酶酶解初步酶解液，以水解度為評價指標，在設(shè)定條件下，分別考察酶添加量、酶解時間、酶解溫度和酶解pH對酶解效果的影響。

脫芳工藝：取風(fēng)味蛋白酶酶解液按料液比1∶10 加入活性炭，在pH 3、溫度40℃條件下振蕩脫芳2 h。

1.2.2 水解度測定

參照GB/T 5009.39—2003，采用甲醛滴定法測定水解度。

1.2.3 芳香族氨基酸含量測定

參照劉金偉[12]的方法測定芳香族氨基酸含量。將脫芳離心后的酶解液稀釋100倍后在280 nm波長下測定吸光值，以A280表示酶解液中芳香族氨基酸含量，終產(chǎn)品中的芳香族氨基酸含量采用氨基酸自動分析儀進行測定。

1.2.4 氨基酸組成測定及F值計算

氨基酸組成測定采用HX-1800全自動氨基酸分析儀參照Ursu等[14]的方法進行，樣品在6 mol/L HCl、110℃條件下酸解22 h后過濾上樣，結(jié)果取兩次平均值，F(xiàn)值按下式計算[12]。

F值=(Val+Ile+Leu)/(Phe+Tyr)

注：式中氨基酸簡寫指摩爾數(shù)。

1.2.5 抗氧化性分析

1.2.5.1 DPPH自由基清除率測定

根據(jù)Nicklisch等[15]的方法測定DPPH自由基清除率。

1.2.5.2 羥基自由基(·OH)清除率的測定

·OH清除率的測定參照Nimse等[16]的方法。

1.2.6 溶解度測定

溶解度測定參考Malomo等[4]的方法。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2013、Origin 2017和SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行處理、繪圖和顯著性分析(LSD，P<0.05)，除有特殊說明外，試驗均進行3次平行試驗，結(jié)果以“平均值±標準偏差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 胃蛋白酶酶解工藝

2.1.1 單因素試驗

2.1.1.1 料液比對水解度的影響

堿提酸沉得到的HPI蛋白質(zhì)含量為(86.23±2.37)%，提取率為(67.78±1.93)%。在酶添加量0.6%、酶解pH 3、酶解時間3 h、酶解溫度37℃條件下，考察不同料液比對HPI水解度的影響，結(jié)果如圖1所示。

注：不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)，下同。
圖1 料液比對水解度的影響

由圖1可知，胃蛋白酶酶解過程中水解度隨著料液比增大先增大后趨于平穩(wěn)。酶添加量一定時，料液比決定了酶與底物濃度大小，當(dāng)料液比小于 1∶5時，酶與底物結(jié)合未飽和，可能是在低料液比條件下，體系黏稠度較大，阻礙了酶與底物的結(jié)合，因而在料液比由1∶3增大至1∶5過程中，水解度以較大速率增大；在料液比為1∶5時，底物與酶結(jié)合達到飽和狀態(tài)，此時水解度為8.63%，且隨著料液比繼續(xù)增大，酶與底物濃度均被稀釋，導(dǎo)致結(jié)合速率減慢，因而水解度增長緩慢[17]。因此，選取料液比 1∶5為宜。

2.1.1.2 酶添加量對水解度的影響

在料液比1∶5、酶解pH 3、酶解時間3 h、酶解溫度37℃條件下，考察不同酶添加量對HPI水解度的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，隨著酶添加量的增大，水解度逐漸增大并趨于平穩(wěn)。當(dāng)酶添加量小于0.9%時，底物濃度相對于酶濃度過剩，因而隨著酶添加量的增大，酶與底物結(jié)合量增多，水解度增大；在酶添加量為0.9%時，酶與底物結(jié)合基本達到飽和，水解度為9.56%；而當(dāng)酶添加量繼續(xù)增大，酶過量，酶之間存在競爭結(jié)合位點，因而導(dǎo)致水解度增長緩慢。因此，選取酶添加量0.9%為宜。

圖2 酶添加量對水解度的影響

2.1.1.3 酶解pH對水解度的影響

在料液比1∶5、酶添加量0.9%、酶解時間3 h、酶解溫度37℃條件下，考察不同酶解pH對HPI水解度的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 酶解pH對水解度的影響

由圖3可知，在pH 2～4范圍內(nèi)，水解度先增大后急劇減小，在pH 2.5時水解度最大，為9.88%。這是因為胃蛋白酶最適pH 在2.5左右，當(dāng)pH偏離2.5后，胃蛋白酶部分失活，導(dǎo)致水解度下降。因此，選取酶解pH 2.5為宜。

2.1.1.4 酶解時間對水解度的影響

在料液比1∶5、酶添加量0.9%、酶解pH 2.5、酶解溫度37℃條件下，考察不同酶解時間對HPI水解度的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 酶解時間對水解度的影響

由圖4可知，水解度隨著酶解時間的延長先增大后趨于平穩(wěn)，酶解4 h水解度達到最大值，為10.87%。在酶解時間短于4 h時，酶與底物充足且結(jié)合未達到飽和，因而隨著酶解時間的延長，水解度增加；而當(dāng)酶解時間超過4 h后，底物減少，且部分酶失活，導(dǎo)致水解度增長緩慢，甚至不增長。因而，選取酶解時間4 h為宜。

2.1.2 正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，固定酶解溫度為37℃，以料液比、酶添加量、酶解pH、酶解時間為因素，以水解度為響應(yīng)指標，通過四因素三水平L9(34)正交試驗對胃蛋白酶酶解工藝進行優(yōu)化，正交試驗因素水平見表1，正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 正交試驗因素水平

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

由表2可知：4個因素對水解度的影響程度大小依次為A>D>B>C，即料液比>酶解時間>酶添加量>酶解pH；經(jīng)正交試驗優(yōu)化得到的胃蛋白酶酶解HPI最佳工藝條件為A2B2C2D3，即料液比1∶5、酶添加量0.9%、酶解pH 2.5和酶解時間5 h，在該條件下進行3次驗證試驗，得到的水解度為(14.52±0.23)%。

2.2 風(fēng)味蛋白酶酶解工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗

采用2.1.2優(yōu)化的胃蛋白酶酶解條件對HPI進行酶解后，測定其A280為0.102±0.003，進行下一步風(fēng)味蛋白酶酶解試驗。

2.2.1.1 酶解溫度對水解度和A280的影響

設(shè)定酶添加量為0.6%、酶解pH為7、酶解時間為3 h，考察不同酶解溫度對HPI水解度和A280的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 酶解溫度對水解度和A280的影響

由圖5可知，A280和水解度隨著酶解溫度的增大呈先增大后減小的趨勢，當(dāng)酶解溫度為50℃時，水解度達到最大，為21.45%。A280與水解度變化趨勢基本一致，推測可能是因為HPI經(jīng)胃蛋白酶廣泛特異性切開疏水性氨基，使得肽鏈兩端的芳香族氨基酸含量增加，而風(fēng)味蛋白酶具有專一性切除N端芳香族氨基酸的能力，且A280與芳香族氨基酸含量存在線性關(guān)系，因而A280與水解度變化趨勢基本一致[18]。風(fēng)味蛋白酶最適溫度為50℃左右，因此選取酶解溫度為50℃。

2.2.1.2 酶添加量對水解度和A280的影響

設(shè)定酶解溫度為50℃、酶解pH為7、酶解時間為3 h，考察不同酶添加量對HPI水解度和A280的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 酶添加量對水解度和A280的影響

由圖6可知，隨著酶添加量的增大，A280和水解度逐漸增大并趨于平穩(wěn)。當(dāng)酶添加量小于0.8%時，底物濃度大于酶濃度，因而隨著酶添加量的增大，酶與底物結(jié)合量增多，水解度增大；在酶添加量為0.8%時，酶與底物結(jié)合基本達到飽和，水解度為24.78%；而當(dāng)酶添加量繼續(xù)增大，酶過量，酶之間存在競爭結(jié)合位點，因而導(dǎo)致水解度增長緩慢。因此，選取酶添加量為0.8%。

2.2.1.3 酶解pH對水解度和A280的影響

設(shè)定酶解溫度為50℃、酶添加量為0.8%、酶解時間為3 h，考察不同酶解pH對HPI水解度和A280的影響，結(jié)果如圖7所示。

圖7 酶解pH對水解度和A280的影響

由圖7可知，在pH 6～8范圍內(nèi)，A280和水解度先增大后減小，在pH 7時水解度最大,為28.33%。這是因為風(fēng)味蛋白酶最適pH 在7左右，當(dāng)pH偏離7后，風(fēng)味蛋白酶部分失活，導(dǎo)致水解度下降。因此，選擇酶解pH 7較適宜。

2.2.1.4 酶解時間對水解度和A280的影響

設(shè)定酶解溫度為50℃、酶添加量為0.8%、酶解pH為7，考察不同酶解時間對HPI水解度和A280的影響，結(jié)果如圖8所示。

圖8 酶解時間對水解度和A280的影響

由圖8可知，A280和水解度隨著酶解時間的延長先增大后趨于平穩(wěn)，基本在酶解4 h后水解度達到最大值，為28.89%。在酶解時間短于4 h時，酶與底物充足且結(jié)合未達到飽和，因而隨著酶解時間的延長，水解度增加；當(dāng)酶解時間超過4 h后，底物減少，且部分酶失活[12]，導(dǎo)致水解度增長緩慢。因此，選擇酶解時間4 h為宜。

2.2.2 正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以水解度和A280為響應(yīng)指標，通過四因素三水平L9(34)正交試驗對風(fēng)味蛋白酶酶解工藝進行優(yōu)化，正交試驗因素水平見表3，正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表4。

表3 正交試驗因素水平

表4 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

由表4可知：4個因素對水解度的影響程度大小依次為A>C>D>B，即酶解溫度>酶解pH>酶解時間>酶添加量；對A280的影響程度大小依次為A>D>C>B，即酶解溫度>酶解時間>酶解pH>酶添加量。經(jīng)正交試驗得到水解度最大的最佳工藝條件為A2B2C2D2，而A280最大的最佳工藝條件為A2B3C2D3，經(jīng)綜合分析最終確定風(fēng)味蛋白酶最佳工藝條件為酶解溫度50℃、酶添加量0.8%、酶解pH 7和酶解時間4 h，在該條件下進行3次驗證試驗，水解度為(33.01±0.43)%，A280為0.321±0.002。

2.3 氨基酸組成

HPI及E-HPI的氨基酸組成分析結(jié)果見圖9。

注：1.天冬氨酸； 2.蘇氨酸； 3.絲氨酸； 4.谷氨酸； 5.甘氨酸； 6.丙氨酸； 7.半胱氨酸； 8.纈氨酸； 9.甲硫氨酸； 10.異亮氨酸； 11.亮氨酸； 12.酪氨酸； 13.苯丙氨酸； 14.組氨酸； 15.賴氨酸； 16.精氨酸； 17.脯氨酸。
圖9 HPI與E-HPI的氨基酸組成

由圖9可知，HPI酶解后氨基酸組成發(fā)生很大變化，其中芳香族氨基酸變化最大，E-HPI中其含量最少，這是因為胃蛋白酶將兩頭具有芳香族氨基酸的肽鍵切開后，進一步經(jīng)過風(fēng)味蛋白酶將暴露的疏水性氨基酸切掉[18]，最后通過活性炭將游離的芳香族氨基酸吸附除去。因此，E-HPI中苯丙氨酸和酪氨酸含量最少。

酶解前，HPI中支鏈氨基酸含量為18.42%，E-HPI 中的含量為23.37%，經(jīng)過胃蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶解后支鏈氨基酸含量顯著提高，F(xiàn)值由原來的2.07提升至22.35。表明該工藝制備的E-HPI 富含支鏈氨基酸，具有作為增肌運動蛋白粉的潛在應(yīng)用價值。

2.4 E-HPI品質(zhì)評價

2.4.1 溶解性

不同pH對HPI及E-HPI溶解度的影響見圖10。

圖10 不同pH對HPI和E-HPI溶解度的影響

從圖10可以看出，與HPI相比，E-HPI的溶解度極顯著提高(P<0.01)，改善了HPI溶解性差的缺陷，pH 5條件下E-HPI也具有相當(dāng)高的溶解度，表明經(jīng)過兩步酶解后，徹底改變了大部分HPI原有分子結(jié)構(gòu)，使得E-HPI溶解度得到大大提升，pH 7時其溶解度為(83.67±2.45)%,這為漢麻分離蛋白在飲料等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了可能。

2.4.2 抗氧化性(見表5)

表5 HPI與E-HPI的抗氧化性 %

注：同列不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。HPI與E-HPI的質(zhì)量濃度均為1 mg/mL。

由表5可知，E-HPI的·OH清除率和DPPH·清除率分別為75.96%和65.46%，相比HPI，分別提高了1.15倍和1.58倍，這與Teh等[8]研究漢麻蛋白經(jīng)過蛋白酶水解后DPPH·清除率提高結(jié)果相符。E-HPI抗氧化性的提高可能與酶解過程中產(chǎn)生的小肽有關(guān)。

3 結(jié) 論

本試驗采用胃蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶分步酶解、輔助活性炭脫芳制備富含支鏈氨基酸的漢麻分離蛋白酶解物，經(jīng)正交試驗得到最佳工藝條件：第一步胃蛋白酶酶解條件為料液比1∶5、酶添加量0.9%、酶解pH 2.5、酶解時間5 h、酶解溫度37℃；第二步風(fēng)味蛋白酶酶解條件為酶解溫度50℃、酶添加量0.8%、酶解pH 7、酶解時間4 h。經(jīng)兩步酶解后得到的E-HPI水解度為(33.01±0.43)%、A280為0.321±0.002。與HPI相比，E-HPI溶解度得到極大的改善，pH 7時E-HPI溶解度為(83.67±2.45)%。

氨基酸分析結(jié)果顯示，E-HPI支鏈氨基酸含量為23.37%，顯著高于漢麻分離蛋白中支鏈氨基酸的含量，表明該工藝條件制備的E-HPI富含支鏈氨基酸，具有作為增肌運動蛋白粉的潛在應(yīng)用價值。同時抗氧化研究結(jié)果顯示，E-HPI的·OH清除率和DPPH·清除率相比HPI分別提高了1.15倍和1.58倍，即E-HPI具有一定的清除自由基能力，表明富含支鏈氨基酸的E-HPI用于增肌的同時，還能清除劇烈運動產(chǎn)生的大量自由基，減少體內(nèi)脂質(zhì)過氧化帶來的損傷。