婁興維，羅志軍，胡鵬剛 *，李家斌，王紹江，趙玲燕，潘雪梅

（1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴陽(yáng)單寧科技有限公司，貴州 貴陽(yáng) 550200）

鞣花酸（ellagic acid，EA）是沒(méi)食子酸的二聚衍生物，是一種天然的多酚類化合物，廣泛地存在于石榴、覆盆子、草莓、黑莓、核桃、枸杞等軟果、堅(jiān)果植物中[1]。鞣花酸具有許多有益的藥理功能，如抗氧化，它具有較強(qiáng)的脂質(zhì)抗氧化和捕捉自由基的能力[2]，早有研究表明在體內(nèi)鞣花酸對(duì)線粒體和微粒體中的脂質(zhì)化合物有良好的抑制作用[3]；抗癌、抗突變，特別是對(duì)結(jié)腸癌、食管癌、肝癌、肺癌、舌以及皮膚腫瘤等有很好的抑制作用，主要從抑制致癌物的代謝活動(dòng)、消除致癌物的毒性和清除致癌物[4]等方面來(lái)抑制癌癥。此外，鞣花酸還可預(yù)防和治療炎癥、糖尿病并發(fā)癥、高血壓和哮喘等[5-6]疾病，它的抗氧化性和增白功效也在化妝品中被普遍的使用。鞣花酸具有優(yōu)異的藥理功能，但它的溶解性卻大大的限制了它的使用，因此需要改善鞣花酸的水溶性。

包合技術(shù)，簡(jiǎn)而言之就是將一種分子包藏于另一種分子的空穴結(jié)構(gòu)內(nèi)，形成包合物，常被使用在藥物的制備中。而形成的包合物可以提高藥物的溶解度、液體藥物粉末化和防止揮發(fā)、調(diào)節(jié)藥物釋放速率來(lái)提高藥物的生物利用度、掩蓋藥物的特殊氣味和增加藥物的穩(wěn)定性等[7]。β-環(huán)糊精具有“內(nèi)疏水，外親水”的空腔結(jié)構(gòu)，所以常常被用作包合材料。對(duì)β-環(huán)糊精（β-cyclodextrin，β-CD）進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾，得到β-CD衍生物，如羥丙基-β-環(huán)糊精（hydroxypropylβ-cyclodextrin，HP-β-CD）、二甲基-β-環(huán)糊精（dimethyl-βcyclodextrin，DM-β-CD）、磺丁基-β-環(huán)糊精（sulfobutyl-βcyclodextrin，SBE-β-CD），這些β-環(huán)糊精衍生物的水溶性就遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于β-環(huán)糊精，包合物之間的水溶性也相差很大[8]。有研究表明，鞣花酸經(jīng)過(guò)包合作用后溶解度增加了10倍[9]，包合物有著更好的體外抗炎活性[10-11]，生物利用度也會(huì)顯著提高[12]。除此之外，包合技術(shù)應(yīng)用廣泛，如兒茶素[13]、阿魏酸[14]、白楊素[15]、殼聚糖[16]、芒果苷[17]等許多難溶于水的物質(zhì)，與環(huán)糊精形成包合物后，溶解度顯著增加，抗氧化性、穩(wěn)定性和藥理活性也隨之增加。

利用β-CD、HP-β-CD、DM-β-CD、SBE-β-CD四種環(huán)糊精制備鞣花酸包合物，使其提高鞣花酸溶解度，使用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定其包合物中鞣花酸的含量和包合率，采用傅里葉紅外光譜（fourier transfer infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IP）、X-射線衍射（x-ray diffraction，XRD）、差示掃描量熱分析、掃描電鏡表征包合物是否形成，同時(shí)通過(guò)自由基清除能力評(píng)價(jià)鞣花酸包合物的抗氧化性強(qiáng)弱，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和有效利用鞣花酸抗氧化性作為保健食品、化妝品等領(lǐng)域提供了一定的理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鞣花酸原樣（純度≥90%）：貴陽(yáng)倍隆生物科技公司；β-環(huán)糊精、羥丙基-β-環(huán)糊精、磺丁基-β-環(huán)糊精：山東濱州智源生物科技有限公司；二甲基-β-環(huán)糊精、鄰苯三酚（均為分析純）：美國(guó)阿拉丁公司；鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）：美國(guó)Sigma公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）：上海源葉生物科技有限公司；三（羥甲基）氨基甲烷（tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鄰菲羅啉、硫酸鐵（均為分析純）：天津市政遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；過(guò)硫酸鉀（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ATY224電子分析天平：日本島津公司；HY-5回旋振蕩器：金壇市富華儀器有限公司；-86 ℃冰箱：中國(guó)AUCMA股份有限公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-2700紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；L6-P6高效液相色譜儀：北京譜析通用儀器有限公司；Bruker D8型X射線衍射儀：德國(guó)布魯克公司；Nicolet IS50傅里葉變換紅外光譜儀：美國(guó)賽默飛世爾科技公司；ΣIGMA+X-Max20電子掃描顯微鏡能譜儀：德國(guó)蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 包合物的制備

根據(jù)范高福等[9]制備石榴鞣酸-羥丙基-β-環(huán)糊精的方法，稍加修改制備四種鞣花酸包合物。精密稱取鞣花酸樣品0.151 0 g，加入乙醇溶解，同時(shí)按照摩爾比1∶2準(zhǔn)確稱取四種環(huán)糊精，分別用純水溶解。將制取好的鞣花酸溶液在攪拌下緩慢滴入到環(huán)糊精溶液中，超聲20 min后在室溫下振蕩攪拌36 h，再使用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾混合溶液，混合溶液放入-80 ℃冰箱中預(yù)凍24 h后放入真空冷凍干燥機(jī)干燥，即得包合物。

1.3.2 物理混合物的制備

精密稱取鞣花酸樣品0.151 0 g，按照摩爾比1∶2分別準(zhǔn)確稱取四種環(huán)糊精，將稱取好的鞣花酸與環(huán)糊精直接混合即得。

1.3.3 鞣花酸包合物溶解度的測(cè)定

精密稱取0.002 4 g鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中用水定容，超聲30 min，配制成0.024 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液待用。再分別取標(biāo)準(zhǔn)品0.024 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL于10 mL容量瓶中加水定容。配制成0.0024mg/mL、0.0048 mg/mL、0.007 2mg/mL、0.009 6 mg/mL、0.012 0 mg/mL的鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，于波長(zhǎng)254 nm條件下測(cè)定吸光度值，以鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、對(duì)應(yīng)吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。取10 mL水溶液于燒杯中，分別加入過(guò)量的鞣花酸和四種鞣花酸包合物，使之得到鞣花酸和鞣花酸包合物的飽和溶液，將飽和溶液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，分別稀釋一定倍數(shù)后在254 nm處測(cè)量吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算得到鞣花酸和鞣花酸包合物的溶解度。

1.3.4 鞣花酸包合物的包合率

鞣花酸包合物的包合率采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法進(jìn)行測(cè)定，其色譜條件為[18]：Pgrandsil-STC-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm），流動(dòng)相乙腈-甲酸（1 mL/L）（17∶83，V/V），檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量10 μL，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃。

精密稱取鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品12.30 mg，甲醇溶解，分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.123 μg/mL、0.615 μg/mL、1.23 μg/mL、2.46 μg/mL、4.92 μg/mL、9.84 μg/mL、19.68 μg/mL的對(duì)照品溶液，使用HPLC測(cè)定其對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度下的峰面積，以溶液質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。再精密稱取四種鞣花酸包合物適量，測(cè)定其峰面積，將測(cè)得的峰面積代入測(cè)得的線性回歸方程得到四種包合物中鞣花酸的質(zhì)量濃度，根據(jù)質(zhì)量濃度計(jì)算包合物中鞣花酸的量，進(jìn)一步求得到包合物的包合率，包合率計(jì)算公式如下：

1.3.5 傅里葉紅外光譜表征包合物

分別取適量的鞣花酸、環(huán)糊精、物理混合物、包合物放入研缽中，加入溴化鉀（KBr），研磨均勻后分別壓片掃描，波數(shù)范圍4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1。

1.3.6 X-射線衍射表征包合物

分別取適量的鞣花酸、環(huán)糊精、物理混合物、包合物，在CuKα輻射，管電壓40 kV，管電流40 mA，所有樣品均在10～80°之間的2θ角范圍內(nèi)測(cè)量，掃描速率10°/min，步長(zhǎng)為0.017°。

1.3.7 掃描電鏡表征包合物

分別取鞣花酸、環(huán)糊精、物理混合物、包合物適量，在加速電壓5.0 kV下分別掃描各樣品的形態(tài)。

1.3.8 抗氧化活性

（1）DPPH自由基清除試驗(yàn)

采用饒鳳等[19]的方法，稍加修改測(cè)量鞣花酸包合物對(duì)DPPH自由基的清除率。分別稱取四種鞣花酸包合物適量，配制成質(zhì)量濃度為2.0μg/mL、4.0μg/mL、6.0μg/mL、8.0μg/mL、10.0 μg/mL鞣花酸包合物樣品溶液。再準(zhǔn)確稱取DPPH 0.019 7 g，甲醇定容至100 mL得儲(chǔ)備液，取10 mL儲(chǔ)備液定容至100 mL量瓶中待用。在試管中加入1 mL樣品溶液與3 mL DPPH溶液，混勻后在室溫下避光靜置30 min后，在波長(zhǎng)517 nm條件下測(cè)定吸光度值A(chǔ)1。以1 mL甲醇代替樣品溶液測(cè)定吸光度值A(chǔ)0，以3 mL甲醇代替DPPH溶液測(cè)定吸光度值A(chǔ)2。DPPH自由基清除率由以下公式計(jì)算：

（2）ABTS自由基清除試驗(yàn)

參照徐洪宇等[20]的方法，稍加修改。將7 mmol/L的ABTS溶液與2.45 mmol/L的過(guò)硫酸鉀溶液等體積混合，室溫下避光靜置16 h，即得ABTS自由基儲(chǔ)備液。用無(wú)水乙醇稀釋該儲(chǔ)備液，使其在734 nm處的吸光度值為0.7±0.2，即得ABTS自由基工作液。取不同鞣花酸包合物樣品溶液1 mL，ABTS自由基工作液4 mL加入到試管中，靜置6 min后于734 nm處測(cè)吸光度值，按以下公式計(jì)算ABTS自由基清除率：

式中：AB、AE分別為空白組和樣品組的吸光度值。

（3）羥基自由基清除試驗(yàn)

按照表1[21]反應(yīng)液的組成，在試管中一次加入磷酸緩沖溶液、鄰菲羅啉、硫酸鐵溶液、樣品溶液、蒸餾水和過(guò)氧化氫。然后將試管置于37 ℃恒溫水浴鍋中保溫60 min，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定各組吸光度值，按照以下公式計(jì)算羥基自由基清除率：

表1 反應(yīng)液的組成Table 1 Compositions of reaction solution

（4）超氧陰離子自由基清除試驗(yàn)

以柏宏偉等[22]的方法，略作修改。向pH=8.2、5.7 mL、50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液中加入0.2 mL的四種鞣花酸包合物不同濃度的樣品溶液，在25 ℃下保溫10 min，然后加入25 ℃預(yù)熱6 mmol/L的鄰苯三酚0.1 mL，總體積6 mL。迅速搖勻反應(yīng)1 min后在波長(zhǎng)320 nm下測(cè)定吸光度值A(chǔ)，同時(shí)用相同濃度的樣品溶液作參比，扣除樣品本身顏色的干擾；另取試劑同上，等體積的Tris-HCl緩沖溶液＋鄰苯三酚溶液代替樣品溶液，Tris-HCl緩沖溶液作空白，測(cè)定反應(yīng)1 min時(shí)的吸光度值A(chǔ)0。按照以下公式計(jì)算超氧陰離子自由基率：

2 結(jié)果與分析

2.1 鞣花酸包合物溶解度的檢測(cè)

圖1 鞣花酸紫外吸收光譜Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of ellagic acid

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，以空白水溶液為對(duì)照，在200～800 nm波長(zhǎng)下全波段掃描，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，測(cè)得鞣花酸的最大紫外吸收波長(zhǎng)為254 nm，以鞣花酸質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=8.166 7X-0.006，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7。結(jié)果表明，鞣花酸在0.002 4～0.012 0 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。經(jīng)檢測(cè)幾種鞣花酸包合物的溶解度從低到高分別為：EA=0.011mg/mL、EA/β-CD包合物=0.0373mg/mL、EA/DM-β-CD包合物=0.0938mg/mL、EA/SBE-β-CD包合物=0.0956mg/mL、EA/HP-β-CD包合物=0.123 2 mg/mL，四種鞣花酸包合物相比單體鞣花酸，溶解度增加了240%、750%、770%、102‰。

2.2 HPLC法測(cè)定鞣花酸包合物的包合率

以鞣花酸質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=98 153X+2 670.9，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5，結(jié)果表明，在0.123～19.68 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。測(cè)得EA/β-CD包合物、EA/HP-β-CD包合物、EA/DM-β-CD包合物、EA/SBE-β-CD包合物中的鞣花酸包合率分別為82.58%、89.80%、87.42%、84.64%。

2.3 鞣花酸包合物的表征

2.3.1 傅里葉紅外光譜分析

四種鞣花酸包合物的傅里葉變換紅外光譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 鞣花酸包合物的傅里葉紅外光譜圖Fig.2 Fourier transfer infrared spectroscopy of ellagic acid inclusion complexes

由圖2可知，鞣花酸在波數(shù)3 474 cm-1處為-OH伸縮振動(dòng)吸收峰，波數(shù)1 720 cm-1處為C=O伸縮振動(dòng)吸收峰，波數(shù)1 617 cm-1、1 583 cm-1、1 510 cm-1處是苯環(huán)的典型特征吸收峰。β-CD、HP-β-CD、DM-β-CD、SBE-β-CD的FT-IR譜圖分別在波數(shù)3 381 cm-1、3 414 cm-1、3 440 cm-1、3 432 cm-1處顯示的寬吸收峰為-OH伸縮振動(dòng)吸收峰。物理混合物的FT-IR譜圖中觀察到鞣花酸的特征吸收峰，可以看出為鞣花酸與四種環(huán)糊精的FT-IR譜圖的疊加。四種包合物EA/β-CD、EA/HP-β-CD、EA/DM-β-CD、EA/SBE-β-CD分別在波數(shù)3 385 cm-1、3 410 cm-1、3 419 cm-1、3 425 cm-1處有-OH的寬吸收峰，鞣花酸的-OH特征吸收峰消失，苯環(huán)特征吸收峰消失或減弱，包合物的C=O伸縮振動(dòng)吸收峰已位移變化至波數(shù)1 641 cm-1、1 633 cm-1、1710 cm-1、1 654 cm-1處，表明鞣花酸已經(jīng)包合在環(huán)糊精的空腔中，形成包合物。

2.3.2 X-射線衍射分析

四種鞣花酸包合的X-射線衍射見(jiàn)圖3。

圖3 鞣花酸包合物的X-射線衍射圖Fig.3 X-ray diffraction of ellagic acid inclusion complexes

由圖3可知，鞣花酸在13.98°、20.89°、23.68°、26.13°、28.01°、29.11°處有強(qiáng)烈特征尖峰，表明鞣花酸有晶體性質(zhì)，β-CD在10.69°、11.7°、12.48°、14.71°、15.40°、16.09°、17.11°、18.86°、19.58°、20.77°、22.72°、24.30°、27.08°處有強(qiáng)烈特征尖峰，表明β-CD有晶體性質(zhì)，且與EA晶體性質(zhì)不同，其余三種環(huán)糊精的XRD譜圖中顯示出寬峰，無(wú)晶體衍射峰，無(wú)晶體性質(zhì)。物理混合物的XRD譜圖可以看出，物理混合物中可以找出鞣花酸的特征峰，表明物理混合物XRD譜圖只是簡(jiǎn)單的疊加。然而在EA/β-CD包合物的XRD譜圖中顯示在11.97°、17.54°處出現(xiàn)新的晶體峰，鞣花酸的特征峰消失或減弱，表明EA/β-CD包合物形成。在其余三種鞣花酸包合物中也未出現(xiàn)鞣花酸的特征峰，表明鞣花酸已經(jīng)被包合在環(huán)糊精的腔中，形成包合物。

2.3.3 掃描電鏡分析

四種鞣花酸包合物的掃描電鏡圖見(jiàn)圖4。

由圖4可知，鞣花酸形態(tài)呈不規(guī)則絮狀結(jié)構(gòu)，β-CD、HP-β-CD、SBE-β-CD、DM-β-CD四種環(huán)糊精分別呈不規(guī)則塊狀結(jié)構(gòu)、球形腔、球體腔、腔體碎片結(jié)構(gòu)，在物理混合物中，可以觀察出是鞣花酸與環(huán)糊精的混合形態(tài)結(jié)構(gòu)，表明鞣花酸與環(huán)糊精是簡(jiǎn)單的混合，主客分子之間的形態(tài)并未改變，而包合物顯示的結(jié)構(gòu)中完全與物理混合物截然不同，EA/β-CD包合物呈現(xiàn)出規(guī)則的塊狀結(jié)構(gòu)，EA/HP-β-CD、EA/DM-β-CD、EA/SBE-β-CD三種包合物中的球形腔體結(jié)構(gòu)完全消失，表明包合物形成。

圖4 鞣花酸包合物的電鏡掃描圖Fig.4 Scanning electron microscope of ellagic acid inclusion complexes

2.4 鞣花酸包合物抗氧化性試驗(yàn)

2.4.1 DPPH自由基清除分析

圖5 DPPH自由基清除率Fig.5 Scavenging rate of DPPH free radical

由圖5可知，在質(zhì)量濃度2～10 μg/mL范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增加，鞣花酸以及四種包合物對(duì)DPPH自由基的清除率也隨之增加，達(dá)到一定質(zhì)量濃度時(shí)，清除率逐漸趨于平穩(wěn)，這與刁玉林等[23]測(cè)定秀麗莓中鞣花酸抗氧化性得到的數(shù)據(jù)結(jié)果變化相似，只是達(dá)到相同清除率所需鞣花酸濃度不同，原因可能為不同樣品之間含量不同。半數(shù)清除率半數(shù)清除率（50%elimination ratio，EC50）可以判斷抗氧化能力的強(qiáng)弱，EC50值越小，表明物質(zhì)抗氧化能力越強(qiáng)。鞣花酸和四種鞣花酸包合物EA/β-CD、EA/HP-β-CD、EA/DM-β-CD、EA/SBE-β-CD的EC50值分別為6.47 μg/mL、6.31 μg/mL、3.45 μg/mL、3.63 μg/mL、3.92 μg/mL，DPPH自由基的清除能力順序?yàn)椋篍A/HP-β-CD＞EA/DM-β-CD＞EA/SBE-β-CD＞EA/β-CD＞EA。從EC50值可以得到鞣花酸包合物對(duì)DPPH自由基清除能力都高于鞣花酸，EA/HP-β-CD、EA/DM-β-CD、EA/SBE-β-CD包合物的DPPH自由基清除率相差不大，但明顯高于EA，說(shuō)明包合作用可以增加EA對(duì)DPPH自由基的清除能力。

2.4.2 ABTS自由基清除分析

圖6 ABTS自由基清除率Fig.6 Scavenging rate of ABTS free radical

由圖6可知，EA/β-CD、EA/HP-β-CD、EA/DM-β-CD、EA/SBE-β-CD四種鞣花酸包合物對(duì)ABTS均有較好的清除作用，隨著質(zhì)量濃度的加大，ABTS自由基的清除率也隨之加大，達(dá)到一定濃度時(shí)，清除率趨于平穩(wěn)。EA和EA/β-CD、EA/HP-β-CD、EA/DM-β-CD、EA/SBE-β-CD包合物的EC50值分別為13.53 μg/mL、12.11 μg/mL、7.00 μg/mL、7.66 μg/mL、7.77μg/mL，ABTS自由基的清除能力順序?yàn)椋篍A/HP-β-CD＞EA/DM-β-CD＞EA/SBE-β-CD＞EA/β-CD＞EA。EA/HPβ-CD包合物清除ABTS自由基能力最強(qiáng)，EA/DM-β-CD、EA/SBE-β-CD包合物沒(méi)有太大懸殊，但與EA相差很大，說(shuō)明包合作用可以提高EA對(duì)ABTS自由基的清除能力。

2.4.3 羥基自由基清除分析

圖7 羥基自由基清除率Fig.7 Scavenging rate of hydroxyl free radical

由圖7可知，四種不同鞣花酸包合物對(duì)羥基自由基均有清除作用，在0.05～0.15 μg/mL時(shí)，鞣花酸和鞣花酸包合物對(duì)羥基自由基的清除率和鞣花酸質(zhì)量濃度存在線性正比關(guān)系，0.15～0.25 μg/mL時(shí)，隨著質(zhì)量濃度的變化，羥基自由基的清除率變化逐漸平緩，雖與崔珊珊等[24]在研究樹(shù)莓鞣花酸羥基自由基清除試驗(yàn)中濃度變化不同，但數(shù)據(jù)趨勢(shì)變化類似。EA和EA/β-CD、EA/HP-β-CD、EA/DM-β-CD、EA/SBE-β-CD 包合物的EC50值分別 為0.133 6 μg/mL、0.136 3 μg/mL、0.108 2 μg/mL、0.108 3 μg/mL、0.105 5 μg/mL，羥基自由基的清除能力順序?yàn)椋篍A/SBE-β-CD＞EA/HP-β-CD＞EA/DM-β-CD＞EA＞EA/β-CD，從EC50的數(shù)值得到，與其他類型自由基清除相比，羥基自由基EC50值的變化沒(méi)有那么顯著，但根據(jù)EC50值微弱的變化，以及圖像中的清除率的變化，基本可以得出鞣花酸包合物的羥基自由基清除能力高于EA，說(shuō)明包合作用可以提高EA對(duì)羥基自由基的清除能力。

2.4.4 超氧陰離子自由基清除分析

圖8 超氧陰離子自由基清除率Fig.8 Scavenging rate of superoxide anion free radical

由圖8可知，四種不同鞣花酸包合物對(duì)超氧陰離子自由基都具有較強(qiáng)的清除能力，與其他三種自由基清除有著類似情形，隨著濃度的增加，自由基清除率也會(huì)隨之增加，這與楊笑笑[25]提取石榴中鞣花酸超氧自由基清除試驗(yàn)得到的結(jié)果相似。EA和EA/β-CD、EA/HP-β-CD、EA/DM-β-CD、EA/SBE-β-CD包合物的EC50值分別為89.41 μg/mL、59.71 μg/mL、55.20 μg/mL、58.32 μg/mL、55.29 μg/mL，超氧自由基清除能力順序?yàn)椋篍A/HP-β-CD＞EA/SBE-β-CD＞EA/DM-β-CD＞EA/β-CD＞EA。從EC50值可以看出，其中EA/HP-β-CD的超氧陰離子自由基的清除能力最好，與EA/DM-β-CD、EA/SBE-β-CD包合物差異不大，但四種鞣花酸包合物的明顯高于EA，可以得出包合作用可以提高EA對(duì)超氧自由基的清除能力。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)四種不同環(huán)糊精制備鞣花酸包合物，并使用HPLC測(cè)定包合物中鞣花酸的含量和包合率，采用傅里葉紅外光譜、X-射線衍射、差示掃描量熱分析、掃描電鏡四種方法進(jìn)行包合物的鑒定，同時(shí)通過(guò)自由基清除能力評(píng)價(jià)鞣花酸包合物的抗氧化性強(qiáng)弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EA/β-CD、EA/DM-β-CD、EA/SBE-β-CD和EA/HP-β-CD包合物的溶解度與單體鞣花酸相比，四種鞣花酸包合物溶解度分別增加了240%、750%、770%、102‰。四種包合物的DPPH自由基清除能力：EA/HP-β-CD＞EA/DM-β-CD＞EA/SBE-β-CD＞EA/β-CD＞EA，ABTS自由基清除能力：EA/HP-β-CD＞EA/DM-β-CD＞EA/SBE-β-CD＞EA/β-CD＞EA，羥基自由基清除能力EA/SBE-β-CD＞EA/HP-β-CD＞EA/DM-β-CD＞EA＞EA/β-CD，超氧自由基清除能力：EA/HP-β-CD＞EA/SBE-β-CD＞EA/DM-β-CD＞EA/β-CD＞EA。四種鞣花酸包合物的溶解度和清除自由基能力都優(yōu)于單體鞣花酸，結(jié)果表明包合作用可以提高鞣花酸的溶解度與抗氧化性。