張勤 李丹 白寶玲 萬春蕾 肖宗慧

隨著中國二胎政策的實施, 控制出生缺陷, 提高人口質(zhì)量, 越來越成為民生關(guān)注的重點問題。神經(jīng)管畸形(Neural tube defects，NTDs)是由于神經(jīng)管閉合(neural tube closure，NTC)失敗或閉合過早引起的重度先天復(fù)雜畸形，包括無腦兒、顱脊柱裂、脊柱裂、腦膨出、脊髓脊膜膨出等多種疾病表型, 是致死、致殘率極高的一類出生缺陷。新生兒中NTDs 畸形率高達(dá)1‰～5‰，2018年發(fā)表的一項研究表明全球2015年NTDs畸形率是1.86‰[1]。與其他國家相比，中國是NTDs 的高發(fā)地區(qū)，特別是中國北部山西省NTDs 的發(fā)病率最高。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2014 年山西省NTDs 的發(fā)病率為3.15‰[2]，是世界范圍內(nèi)NTDs 發(fā)病率最高的地區(qū)之一。NTDs是中國排名前10的重度高發(fā)出生缺陷[3], 絕大多數(shù)的NTDs患兒發(fā)生自然流產(chǎn)、人工終止妊娠、死產(chǎn)和新生兒死亡，極少數(shù)非開放性脊柱裂的患兒能幸存，但往往伴隨終身的發(fā)育障礙和殘疾，給個人、家庭和社會帶來嚴(yán)重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[4]。深入研究 NTDs 的發(fā)病機(jī)制及防治辦法對提高人口質(zhì)量有重要的意義。近年的一些研究提示同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)的代謝異常與NTDs的發(fā)生密切相關(guān), 高Hcy可導(dǎo)致NTDs的發(fā)生[5-10]。但是Hcy升高增加出生缺陷的機(jī)制目前仍不明確。

基于質(zhì)譜(MS)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)能夠發(fā)現(xiàn)差異蛋白，為疾病的機(jī)制研究提供線索。作為定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法中的重要研究手段，iTRAQ同位素標(biāo)記定量技術(shù)廣泛應(yīng)用于差異表達(dá)蛋白質(zhì)的鑒定。既往研究表明，高Hcy可誘導(dǎo)雞胚產(chǎn)生NTDs表型。本研究采用Hcy代謝物同型半胱氨酸硫代內(nèi)酯(homocysteine thiolactone，HTL)處理雞胚可誘導(dǎo)明顯的脊柱裂表型。本研究利用此動物模型，采用iTRAQ技術(shù)，對高HTL處理的雞胚腦組織和正常未處理的雞胚腦組織差異蛋白進(jìn)行比較，以發(fā)現(xiàn)差異蛋白富集通路并解釋神經(jīng)管畸形發(fā)生機(jī)制。

材料與方法

一、材料

白色萊杭雞種蛋購于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)小牧場；試劑包括L-Homocysteine Thiolactone hydrochloride(同型半胱氨酸硫內(nèi)酯，sigma，USA)；臺式液(1 mM葡萄糖，3.5 mM氯化鉀，100 mM氯化鈉，0.02 mM磷酸二氫鈉，12 mM碳酸氫鈉，北京化工廠)；酚紅(北京化工廠)； Trypsin(Promega，USA)。iTRAQ試劑盒購置于美國AB SCIEX；Urea試劑、DTT試劑、四乙基溴化銨(TEAB)和碘乙酰胺試劑購自美國Sigma； Bradford kit試劑盒， C18脫鹽柱、真空濃縮儀和超聲清洗儀由Eppendorf公司提供； NanoLC高效液相(UltiMate 3000 RSLCnano System，Dionex)和Q Exactive HF2.8 質(zhì)譜(Thermo)購置于美國；孵化器購置于日本Showa Furanki公司。

二、方法

1. 動物模型的制備：收集經(jīng)人工授精的白來航種雞雞蛋120枚，孵化器中進(jìn)行孵育，孵育條件為孵化溫度為38 ℃, 相對濕度為55%～65%, 90°轉(zhuǎn)角, 30分間隔自動翻蛋, 繼續(xù)孵化，此時記為第0天(E0)。將孵化約27 h的雞種蛋取出用酒精棉擦拭表面消毒后, 使用牙科鉆磨去直徑約3～4 mm左右的蛋殼，用鑷子揭去蛋殼膜, 暴露胚胎。鏡下檢出活胚，棄除未受精蛋6枚及未發(fā)育蛋4枚后，將剩余110枚蛋按照隨機(jī)數(shù)表法分成2組, 其中正常組50枚, 處理組60枚。處理組進(jìn)行0.5 μL 0.5 mM HTL(溶解于臺式液中)神經(jīng)溝注射，其中5枚未正確注射到神經(jīng)溝，最終獲得處理組55枚。同時對50枚正常組種蛋進(jìn)行0.5 μL臺式液(不含HTL)神經(jīng)溝注射，其中2枚未正確注射到神經(jīng)溝，最終獲得正常組48枚。然后將所有的種蛋放回孵化器，鈍端向上，繼續(xù)孵化。在神經(jīng)管閉合后的E5時取胚胎。用攝子敲除雞胚外殼后用彎頭鑷小心剝離雞胚胚胎外膜并將雞胚放置于體視顯微鏡下檢測胚胎有無畸形和死亡，畸形判斷參照《雞胚發(fā)育的一系列正常階段》[11]。體視顯微鏡下判斷為神經(jīng)管畸形樣本腦組織以3個合并為1份樣本，共納入8份樣本作為NTDs組，正常組中選擇發(fā)育正常腦組織也以3個合并為1份樣本，共15份樣本作為正常組，凍存于-80℃冰箱。

2. 一步法提全蛋白：采用One Step Animal Tissue Active Protein Extraction Kit(生工，貨號：C500006)提取全蛋白，主要步驟如下：選取NTDs組與對照組雞胚腦組織各3份樣本，每份稱取100 mg，加入1 mL 預(yù)冷的抽提試劑(使用前加入1 μL的蛋白酶抑制劑，5 μL的蛋白酶抑制劑，1 μL的DTT和10 μL的PMSF)后用勻漿器將組織磨碎后超聲破碎，每次30 秒，8～10次，每次間隔1min 14 000 g，離心15 min并將上清轉(zhuǎn)移到另一個新的預(yù)冷低吸附EP管中，進(jìn)行下一步FASP超濾濃縮實驗。

3. FASP超濾濃縮：提取的雞胚總蛋白用3 KD filter進(jìn)行超濾濃縮, 每個樣本100 ug總蛋白, 加入300 μL 尿素溶液，14 000 g離心30 min; 加入30 uL 10 mM DTT(297 μL UA+ 3 μL 1 M DTT), 金屬浴37℃ 1 h; 加入15 μL 1M的碘乙酰胺 , 在黑暗處室溫靜置20 min，14 000 g離心45 min; 加入300 μL 尿素溶液洗滌3次; 加入300 μL NH4HCO3 洗滌3次; 最后加入100 μL TEAB溶液于超濾管中溶解并收集總蛋白。

4. iTRAQ標(biāo)記：取50 μL FASP樣品(約100 μg酶解產(chǎn)物)，其中NTDs組2份，正常組2份，加入iTRAQ四標(biāo)試劑(114，115，116，117)中的一個標(biāo)記組分，混合均勻后將標(biāo)記肽段用分級柱分級以進(jìn)行質(zhì)譜分析。

5. Nano-HPLC/MS/MS分析：各分級樣品通過連接到UltiMate 3000 RSLCnano系統(tǒng)的自動進(jìn)樣器上樣并用Q Exactive HF Orbitrap質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。離子噴霧電壓保持在2.2 kV，毛細(xì)管溫度320℃，S-Lens射頻水平為60。在數(shù)據(jù)依賴性采集模式下，以60 000的分辨率進(jìn)行一級質(zhì)譜 (mass spectrum，MS) 掃描(m/z 300～1 500)，分離出20個最強(qiáng)烈的母離子，在HCD碎裂模式下，iTRAQ標(biāo)記的肽段被打成片段后，以30 000的分辨率進(jìn)行二級質(zhì)譜 (MS/MS) 掃描。

6. 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析：使用Proteome Discoverer軟件(版本2.1.0.81，Thermo Fisher Scientific)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以Uniprot上下載的雞全蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索(www.uniprot.org)。檢索條件為：蛋白經(jīng)胰蛋白酶消化后，允許最大的漏切位點數(shù)為2，前體質(zhì)量偏差容忍度為10 ppm，碎片質(zhì)量偏差容忍度為0.02 Da，相對峰度根據(jù)信噪比(S/N)來計算，應(yīng)用Total peptide mount對各標(biāo)記之間進(jìn)行均一化。固定修飾為iTRAQ 4-plex (N，K) 和Carbamidomethyl (C)，可變修飾為iTRAQ 4-plex (Y) 和Oxidation (M)。當(dāng)P<0.05和FDR(錯誤發(fā)現(xiàn)率)<0.01時數(shù)據(jù)可信。搜庫完成以后，將數(shù)據(jù)以Excel的形式導(dǎo)出做后續(xù)分析。

7. 生物信息學(xué)分析：將NTDs組與對照組差異倍數(shù)大于等于1.2倍的蛋白定義為差異蛋白，因此選擇1.2倍的閾值條件對差異蛋白進(jìn)行篩選。 FC≥1.2為上調(diào)(up)， FC≤0.833為下調(diào)(down)。應(yīng)用京都基因和基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes database，KEGG)，確定差異蛋白所參與的物質(zhì)代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。使用在線免費分析工具DAVID (www.david.abcc.ncifcrf.gov) 對差異蛋白質(zhì)進(jìn)行Gene Ontology (GO) 分析。根據(jù)GO的三個分析方面即生物過程 (biological process)、細(xì)胞成分 (cellular component)和分子功能(molecular function)對蛋白進(jìn)行注釋和分類，以判斷這些差異表達(dá)蛋白在哪些生物學(xué)過程中發(fā)揮作用。

8.PRM分析：將前述正常組和NTDs組各3份雞胚腦組織經(jīng)FASP后的樣本進(jìn)行常規(guī)質(zhì)譜分析，選擇感興趣的蛋白的質(zhì)譜信息，提取m/z和RT時間信息，并在此基礎(chǔ)上將RT時間 ±3.5 min，做成目標(biāo)母離子，并將母離子信息添加到質(zhì)譜分析的母離子列表中進(jìn)行重點碎裂。質(zhì)譜上機(jī)檢測同Nano-HPLC/MS/MS，獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)PD 2.1軟件分析后，導(dǎo)出目標(biāo)蛋白的肽段信息，導(dǎo)入到Skyline(版本3.5.0.9319；AB Sciex)中選擇“Import PRM Peptide Search”模塊，進(jìn)行參數(shù)設(shè)置后進(jìn)行比較分析，其參數(shù)設(shè)置如下：Cut-off score: 0.95；precursor charges: 2，3，4；ion charges: 1，2；ion type: y.p.b；ion match tolerance: 0.05；pick 3 product ions；precursor mass analysis: obitrap；max missed cleayages: 0。

結(jié) 果

一、 HTL誘導(dǎo)雞胚產(chǎn)生NTDs表型

正常對照組雞胚存活率為95.8%(46/48)，僅1例出現(xiàn)畸形為NTDs，神經(jīng)管畸形率2.1%(1/48)。處理組雞胚存活率為67%(37/55)，24例 NTDs，神經(jīng)管畸形率為43.6%(24/55)。24例NTDs包括腦發(fā)育異常合并脊柱裂2例，腦膨出3例，中腦萎縮7例，后腦發(fā)育缺陷2例，間腦發(fā)育缺陷3例，腦泡皺褶3例，脊柱裂4例。其余畸形包括心臟缺損2例，面部畸形1例，短尾畸形1例。另有發(fā)育遲緩5例，死胎8例。14例雞胚發(fā)育正常。圖1A顯示E8典型的開放性脊柱裂表型，1B為E5開放性脊柱裂表型。

圖1 HTL誘導(dǎo)的脊柱裂表型Figure 1 The bifid spine induced by HTLA: HTL處理后E8天的脊柱裂表型；B：HTL 處理后E5天的脊柱裂表型A：The bifid spine of E8 induced by HTL；B：The bifid spine of E5 induced by HTL

二、iTRAQ定量獲得HTL誘導(dǎo)的雞胚NTDs腦組織蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)

質(zhì)譜獲得的數(shù)據(jù)經(jīng)PD分析，雞胚胎腦組織中共鑒定到4 305種蛋白質(zhì)，其中差異表達(dá)蛋白共369個，有256個表達(dá)水平上升，113個表達(dá)下降。將差異蛋白采用DAVID軟件分類，其中包括細(xì)胞質(zhì)蛋白33個，金屬結(jié)合蛋白33個，運輸?shù)鞍?7個，核苷酸結(jié)合蛋白27個，細(xì)胞骨架蛋白9個，氧化還原酶9個，SH3結(jié)合域蛋白8個，微管蛋白6個，血紅素蛋白5個等。

三、 雞胚NTDs腦組織蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)的生物信息學(xué)分析

進(jìn)一步對選出的差異蛋白進(jìn)行分析，根據(jù)現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫注釋和生物信息學(xué)分析工具，對鑒定出的369個差異蛋白進(jìn)行功能分析。從KEGG(圖2A)通路分析來看，差異表達(dá)蛋白富集在代謝通路、氧化磷酸化通路、內(nèi)吞通路和核糖體通路。圖3A顯示差異蛋白在氧化磷酸化通路的富集，藍(lán)色為富集的蛋白，分別為ATP5L、ATP5MF、ATP5H、COX3和ATP6，提示氧化磷酸化通路參與HTL誘導(dǎo)的NTDs發(fā)生。從GO分析的結(jié)果來看，從生物過程(圖2B)注釋情況來看，差異表達(dá)蛋白主要參與生物粘附、生物調(diào)節(jié)、生長和代謝過程等過程。從細(xì)胞組成(圖2C)分布情況來看，差異表達(dá)蛋白主要分布在細(xì)胞膜、大分子復(fù)合物和細(xì)胞器中。從分子功能(圖2D)注釋情況來看，差異表達(dá)蛋白多為連接蛋白、酶相關(guān)、蛋白受體和轉(zhuǎn)運活性蛋白。

四、 NTDs雞胚腦組織PRM結(jié)果顯示氧化磷酸化通路ATP5H和ATP5MF表達(dá)下降

為明確氧化磷酸化通路蛋白ATP5H和ATP5MF的表達(dá)水平，運用靶向定量PRM技術(shù)定向檢測ATP5H和ATP5MF的表達(dá)水平。Skyline軟件分析發(fā)現(xiàn)與正常組比較，HTL處理的雞胚模型中的蛋白ATP5H和 ATP5MF的定量肽段“IAEYEQQLQK”(P=0.02)和“SVYAHFPINVVIQDNGSLVEIR”(P=0.03)表達(dá)水平降低(圖3B)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這與高Hcy雞胚NTDs腦組織中iTRAQ表達(dá)趨勢一致，提示氧化磷酸化通路蛋白在HTL誘導(dǎo)的NTDs中表達(dá)降低。

討 論

NTDs是由于神經(jīng)管閉合失敗或閉合過早引起的重度先天復(fù)雜畸形，由多基因和環(huán)境交互作用導(dǎo)致產(chǎn)生。近年的一些研究提示同型半胱氨酸的代謝異常與NTDs的發(fā)生密切相關(guān)。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)懷孕期間母體高同型半胱氨酸血癥與子女發(fā)生NTDs風(fēng)險增加相關(guān)[5-7]。在早孕期維生素B12相匹配的實驗中，在NTDs受累的孕婦中，同型半胱氨酸水平顯著高于對照組[8]。前期本課題組在中國山西NTDs高發(fā)區(qū)調(diào)查也發(fā)現(xiàn)，NTDs孕婦血清中葉酸水平降低，同時一碳循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物Hcy升高[9-10]。在荷蘭的一項研究中，與曾生下正常嬰兒的對照組相比，曾生下NTDs患兒的非孕期婦女在空腹?fàn)顟B(tài)和攝取甲硫氨酸負(fù)荷6 h后的血漿總同型半胱氨酸水平都顯著升高，而且部分NTDs畸形兒的羊水中Hcy水平高于正常胎兒[12]。這些研究結(jié)果提示母體高Hcy血癥與NTDs的發(fā)生成正相關(guān)，Hcy蓄積是NTDs的危險因素之一, 但是Hcy升高增加出生缺陷的機(jī)制目前仍不明確。

圖2 差異表達(dá)蛋白GO和KEGG分析Figure 2 GO and KEGG analysis of differentially expressed proteinA：KEGG分析差異蛋白的通路富集情況；B：GO分析差異蛋白在生物過程中的富集；C：GO分析差異蛋白在細(xì)胞組成中的富集；D：GO分析差異蛋白在分子功能上的富集。A:KEGG analysis of differential proteins pathway enrichment; B: GO analysis of differential proteins enrichment in biological processes; C: GO analysis of differential proteins enrichment in cell composition; D: GO analysis of differential proteins enrichment in molecular function.

圖3 氧化磷酸化通路富集的差異蛋白Figure 3 The differentially expressed proteins enriched in oxidative phosphorylation pathwayA：圖示氧化磷酸化通路上富集的差異蛋白，藍(lán)色標(biāo)記為富集差異蛋白；B：PRM驗證氧化磷酸化蛋白ATP5H肽段IAEYEQQLQK和ATP5MF肽段SVYAHFPINVVIQDNGSLVEIR在NTDs中表達(dá)降低A:The differential protein enriched in the oxidative phosphorylation pathway. The differential protein marked blue. B: PRM validated that IAEYEQLQK and SVYAHFPINVVIQDNGSLVEIR of ATP5H and ATP5MF were down-regulated in NTDs

實驗動物模型在探討疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制中有著重要的作用，而雞胚由于有培育周期短，成本低，發(fā)育過程清楚等優(yōu)點，已作為胚胎發(fā)育研究的常用動物模型。一個多世紀(jì)以來，雞胚在研究顱面發(fā)育和疾病發(fā)病機(jī)制的研究中發(fā)揮了重要作用[13]。雞是研究神經(jīng)管發(fā)育的合適動物模型，具有胚胎發(fā)生時間短、成本低等優(yōu)點，且神經(jīng)管閉合基因在雞和人胚胎中的表達(dá)模式相似。研究表明，Hcy對神經(jīng)胚形成期和器官形成期的胚胎均有顯著的致畸性并與劑量呈正相關(guān)，雞胚發(fā)生NTDs的主要表現(xiàn)是露腦、裂腦和脊柱裂。注射5 μg葉酸可明顯拮抗Hcy的致畸性，NTDs發(fā)生率顯著下降[14]。最近一個Hcy誘導(dǎo)NTDs雞胚模型研究表明Hcy處理可能通過影響神經(jīng)細(xì)胞的增殖和分化從而參與NTDs的發(fā)生[15]。同時還有研究表明在雞胚發(fā)育的早期用Hcy的代謝物HTL干預(yù)也可導(dǎo)致雞胚產(chǎn)生NTDs[16]。采用HTL注射雞胚發(fā)現(xiàn)明顯的無腦和脊柱裂表型, 并以此動物模型為基礎(chǔ)研究高Hcy導(dǎo)致的NTDs的發(fā)病機(jī)制。

利用高HTL誘導(dǎo)的雞胚NTDs腦組織，用itraq標(biāo)記的蛋白組方法比較NTDs的腦組織差異蛋白，結(jié)果表明差異蛋白富集在氧化磷酸化通路，且全部顯示為下調(diào)。氧化磷酸化，發(fā)生在真核細(xì)胞的線粒體內(nèi)膜或原核生物的細(xì)胞質(zhì)中，是物質(zhì)在體內(nèi)氧化時釋放的能量通過呼吸鏈供給ADP與無機(jī)磷酸合成ATP的偶聯(lián)反應(yīng)。生物體內(nèi)95%的ATP來自這種方式，特別對高耗能的腦組織。ATP是細(xì)胞內(nèi)含有高能磷酸鍵的化合物，是細(xì)胞內(nèi)能直接利用的能源。ATP合成量不足，可誘發(fā)不可逆的細(xì)胞壞死。

研究發(fā)現(xiàn)雞胚NTDs中氧化磷酸化通路中ATP5L、ATP5MF、ATP5H、ATP6和COX3表達(dá)下降，其中ATP5L、ATP5MF、ATP5H、ATP6為ATP合成酶的組成成分。ATP合成酶是生物體能量代謝的關(guān)鍵酶。ATP合成酶可以在跨膜質(zhì)子動力勢的推動下，利用ADP和Pi催化合成生物體的能量“通貨”—ATP。一般來說，機(jī)體所需的大多數(shù)ATP都是由ATP合酶產(chǎn)生的。ATP合酶功能紊亂與多種疾病相關(guān)， 例如ATP5A1缺失可導(dǎo)致致命的新生兒線粒體腦病[17]、 ATP5E突變可導(dǎo)致線粒體ATP合酶缺乏癥[18]、ATP5D表達(dá)下調(diào)與肌萎縮側(cè)索硬化癥相關(guān)[19]；而ATP合成酶β亞基功能失常對多種代謝疾病的發(fā)生至關(guān)重要，如糖尿病、肥胖等。ATP5L、ATP5MF、ATP5H、ATP6的表達(dá)異?？蓪?dǎo)致ATP合成酶異常而導(dǎo)致ATP合成量不足，這可能是導(dǎo)致HTL誘導(dǎo)NTDs的產(chǎn)生原因之一，而其具體導(dǎo)致NTDs發(fā)生的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。