廖友生 康小英

【摘 要】本文通過體外細(xì)胞和裸鼠皮下移植瘤模型來探討姜黃素與組蛋白去乙酰化酶抑制劑SAHA聯(lián)合用藥對乳腺癌的治療效果。實驗結(jié)果表明，姜黃素與SAHA聯(lián)合用藥在體外細(xì)胞和體內(nèi)腫瘤模型中均展現(xiàn)出了良好的抗乳腺癌活性，并強(qiáng)于姜黃素或SAHA單獨用藥;此外，姜黃素與SAHA聯(lián)合用較SAHA單獨用藥具有更高的安全性。這些結(jié)果為乳腺癌的聯(lián)合用藥提供了一定的參考，值得進(jìn)一步研究。

【關(guān)鍵詞】： 姜黃素; 組蛋白去乙?；敢种苿?聯(lián)合用藥; 抗乳腺癌活性

【中圖分類號】R539【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A【文章編號】1005-0019（2020）08--01

乳腺癌已經(jīng)成為全球女性的頭號殺手，其發(fā)病率正在逐年升高，并年輕化。目前在臨床上主要采用激素替代治療法，但是長期用藥容易出現(xiàn)耐藥性[1];此外，有約25%左右的乳腺癌患者是三陰性乳腺癌，由于缺乏治療靶點，傳統(tǒng)的激素替代治療法對其無效，并對化療不敏感，患者生存期較低[2]。因此，發(fā)展新型的治療方法對乳腺癌，尤其是三陰性乳腺癌，具有重要的意義。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，癌癥包括乳腺癌是一個多基因疾病，僅僅抑制單一靶點通常難以取得預(yù)期的治療效果，并很容易出現(xiàn)耐藥性。相應(yīng)地，從多個角度攻擊疾病可克服許多單靶點藥物的缺點，由此產(chǎn)生多靶點治療可以同時調(diào)節(jié)腫瘤網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的多個途徑，能夠提供治療效果并不易產(chǎn)生耐藥性，現(xiàn)已在很低重大疾病治療中開始應(yīng)用[3]。因此，在本研究中我們探討了在單獨使用時對乳腺癌均具有治療效果的姜黃素與組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA在聯(lián)合用藥后對乳腺癌的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與細(xì)胞株

姜黃素和伏立諾他 （SAHA）均購置北京伊諾凱科技有限公司 （質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）;無酚紅的DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購自Hyclone公司;MCF-7、MDA-MB-231、MCF-10A和VERO細(xì)胞株均購自中科院上海細(xì)胞典藏中心。Balb/c裸鼠，4-5 周齡，體重 16-22g，購置北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（SCXK（京） 2016-0011）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將MCF-7、MDA-MB-231和MCF-10A三種細(xì)胞接種于75 mL的培養(yǎng)瓶中，加入含有10%胎牛血清的無酚紅的DMEM培養(yǎng)液，在37 °C、5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育進(jìn)行傳代。

1.3 動物模型構(gòu)建

取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞用胰酶消化后，離心并收集細(xì)胞，然后用Matrigel膠將MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行混懸。于裸鼠右側(cè)肩部皮下種植0.2 mL的MDA-MB-231細(xì)胞混懸液 （4×106 ～ 5 ×10 6細(xì)胞）。

1.4 體外抗腫瘤活性實驗

采用MTT法對姜黃素、SAHA以及姜黃素和SAHA聯(lián)合用藥組進(jìn)行體外抗乳腺癌活性測試。其中乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞株為測試細(xì)胞株，正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A和正常非洲綠猴腎細(xì)胞VERO為對照細(xì)胞株。將測試藥物用DMSO溶解后，再用無酚紅的DMEM培養(yǎng)基稀釋成不同的濃度。取對數(shù)生長期的MCF-7、MDA-MB-231、MCF-10A和VERO細(xì)胞鋪至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL （4～8）×104個/mL的細(xì)胞混懸液。置于37 oC、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育12小時后待細(xì)胞完全貼壁棄去原培養(yǎng)液，每孔加入100 ?L含有不同濃度待測試藥物的培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育3天，加入30 μL 5 mg/mL 的MTT，繼續(xù)孵育4小時后，棄去培養(yǎng)液，每孔每孔加入100 μL 二甲亞砜 （DMSO）溶解。用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定每孔的吸光度（OD）值，并計算出藥物對腫瘤細(xì)胞的抑制率。

1.5 體內(nèi)抗腫瘤活性實驗

向裸鼠接種MCF-7細(xì)胞后，待荷瘤體積長至約50 mm3大小時，隨機(jī)將裸鼠分成空白對照組、姜黃素組、SAHA組和姜黃素與SAHA的聯(lián)合用藥組，每組 4只，均進(jìn)行灌胃給藥，實驗組每組給予 25 mg/kg的劑量，對照組給予等體積的生理鹽水對照，每2天給藥一次，在給藥18天后將所有裸鼠的腫瘤取下，稱量腫瘤的重量，計算出腫瘤的抑制率。腫瘤抑制率 （%） = （1-T/C） × 100，T和C分別表示治療結(jié)束后實驗組和對照組腫瘤的重量。

2 結(jié)果

2.1 體外抗腫瘤活性

體外抗乳腺癌的結(jié)果如表1所示，姜黃素和SAHA對乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231均有明顯地抑制活性，其IC50均低于20 μM。當(dāng)姜黃素和SAHA聯(lián)合用藥時，其抗MCF-7和MDA-MB-231的活性較單獨用姜黃素或SAHA時均明顯地提高。這些結(jié)果說明姜黃素和SAHA聯(lián)合用藥具有更強(qiáng)地抗腫瘤效果。更重要的是，盡管SAHA對正常的乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A沒有毒性，但是其對正常的VERO細(xì)胞卻展現(xiàn)出了一定的毒性 （IC50 = 4.1 μM），而采用聯(lián)合用藥后其毒性明顯地降低 （IC50 = 31.8 μM）。這個結(jié)果表明聯(lián)合用藥組較SAHA單獨用藥具有更高的安全性。

2.2 體內(nèi)抗腫瘤活性

在體外研究中，姜黃素與SAHA聯(lián)合用藥對MDA-MB-231細(xì)胞展現(xiàn)出優(yōu)秀的抗腫瘤活性。因此，我們構(gòu)建了MDA-MB-231動物模型來研究聯(lián)合用藥在動物體內(nèi)抗腫瘤活性，結(jié)果如表2所示。姜黃素和SAHA對腫瘤的抑制率分別為21.1%和49.1%，而聯(lián)合用藥組的抑制率為53.1%。這些結(jié)果說明姜黃素與SAHA聯(lián)合用藥的體內(nèi)抗腫瘤效果也要強(qiáng)于單獨用藥。

3 討論

姜黃素是從中藥姜黃的根莖中提取到的一類酚類色素，具有明顯地抗腫瘤活性。姜黃素的抗腫瘤活性具有多效性和途徑多樣性，對同一腫瘤能同時發(fā)揮多種效能，一類多靶點的藥物[4]。例如，在治療乳腺癌中能同時通過特異性誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡、抑制乳腺癌細(xì)胞代謝、影響乳腺干細(xì)胞等多途徑發(fā)揮治療效果[5]。此外，因其毒副作用小、安全性高等特點常和其他抗腫瘤藥物如卡鉑進(jìn)行聯(lián)合用藥來治療乳腺癌[6]。

組蛋白去乙?；?（histone deacetylase， HDAC）是一類蛋白酶，對染色體的結(jié)構(gòu)修飾與基因表達(dá)調(diào)控發(fā)揮著重要的作用，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在腫瘤細(xì)胞中包括乳腺癌細(xì)胞HDAC呈現(xiàn)出過表達(dá)狀態(tài)[7]。HDAC抑制劑能夠HDAC的表達(dá)，同時抑制腫瘤細(xì)胞的分化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。目前已有多種HDAC抑制劑被開發(fā)用來治療不同的腫瘤[8]。但是，HDAC抑制劑通常具有一定的毒副作用[9]，這限制了其在臨床上的應(yīng)用。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，天然產(chǎn)物不僅具有抗腫瘤活性，而且低毒，將其與其他抗腫瘤藥物聯(lián)用將具有更好的療效和更高的安全性[10]。因此，在本研究中，我們將天然產(chǎn)物姜黃素與HDAC抑制劑SAHA聯(lián)用來治療乳腺癌。我們的結(jié)果表明，姜黃素與SAHA聯(lián)用后不僅較單獨使用姜黃素或SAHA提高了治療乳腺癌的效果，還較SAHA有更高的安全性。這為今后乳腺癌的聯(lián)合用藥治療提供了一定的參考意義。

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