孫雨閣 李宸葳 杜再慧 許文濤，2

（1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083；2. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價（食用）重點實驗室，北京 100083）

生物傳感器（Biosensors）是將生物活性物質(zhì)和物理化學(xué)檢測器相結(jié)合的設(shè)備，由固定化的生物敏感材料作為識別元件對生物活性物質(zhì)進(jìn)行特異性的識別，然后將生化信號轉(zhuǎn)換為物理化學(xué)信號，再將信號進(jìn)行輸出的一類可以用于測定各種生物物質(zhì)及濃度的設(shè)備。至今已有50 多年的發(fā)展歷史。生物傳感器根據(jù)其識別元件即敏感元件的不同，可分為7類：酶傳感器、微生物傳感器、細(xì)胞傳感器、組織傳感器、免疫傳感器、核酸傳感器及分子印跡生物傳感器［1］。酶傳感器是最早出現(xiàn)的生物傳感器，因為具有高靈敏度和高特異性，并且操作簡單，反應(yīng)溫度一般在30-60℃之間，因此在生化分析及臨床應(yīng)用中得到了較大的發(fā)展。

FEN1 酶是一種結(jié)構(gòu)特異性核酸酶，只識別特異性的結(jié)構(gòu)而不依賴序列，并且有著高效穩(wěn)定的切割效率，已被廣泛應(yīng)用于生物傳感器中靶物質(zhì)的信號循環(huán)放大過程中。在FEN1酶所介導(dǎo)的生物傳感器中，對三堿基重疊結(jié)構(gòu)進(jìn)行識別，再通過搭載不同的信號循環(huán)和信號放大方式，可實現(xiàn)對靶物質(zhì)的精準(zhǔn)檢測。本文首先對FEN1 酶的發(fā)現(xiàn)過程、性質(zhì)及作用進(jìn)行介紹，再根據(jù)靶物質(zhì)的不同對FEN1 酶所介導(dǎo)的生物傳感器進(jìn)行分類綜述。此外，還對FEN1 酶在體內(nèi)的成像和治療進(jìn)行了介紹，旨在使人們更多的了解FEN1 酶在生物傳感器上的應(yīng)用及發(fā)展現(xiàn)狀，為今后所用。

1 FEN1 酶的簡介

1.1 FEN1酶的發(fā)現(xiàn)

瓣狀核酸內(nèi)切酶-1（Flap endonuclease 1，F(xiàn)EN1）是1994 年Harrington 和Libber［2］根據(jù)底物的形狀特征進(jìn)行命名的結(jié)構(gòu)特異性核酸酶。其發(fā)現(xiàn)可以追溯到1968 年，首先由Klett 等［3］發(fā)現(xiàn)大腸桿菌聚合酶具有5'-3'外切酶活性；次年，Kelly 等［4］發(fā)現(xiàn)大腸桿菌聚合酶同時具有內(nèi)切酶活性，并且可以切除由于輻射損傷造成的多聚胸腺區(qū)域的錯配序列；同年，Lindahl 等［5］從兔子組織中分離得到一種能降解雙鏈DNA 的外切酶DNase Ⅳ，分子量約為42 000，并且DNase Ⅳ降解合成多核苷酸的速度遠(yuǎn)快于天然多核苷酸DNA，與大腸桿菌聚合酶有著共同特性；1971 年，Setlow 等［6］報道大腸桿菌DNA聚合酶在體外可被水解成兩個酶活性結(jié)構(gòu)域，較大片段（分子量為76 kD）具有聚合酶和3'-5'外切酶活性，較小片段（分子量為36 kD）具有5'-3'核酸外切酶活性；Masamune 和Richardson［7］推測大腸桿菌聚合酶在DNA 單鏈斷裂，合成新的序列過程中會產(chǎn)生大量的DNA 分枝；到1982 年，Lundquist 和Olivera［8］發(fā)現(xiàn)大腸桿菌聚合酶的外切酶活性中最理想的底物為分枝結(jié)構(gòu)單鏈。

1.2 FEN1酶的性質(zhì)

FEN1 酶是一種金屬核酸酶，需要二價陽離子鎂（Mg2+）和錳（Mn2+）的參與才能執(zhí)行功能。在Mg2+濃度為1 mmol/L-10 mmol/L 時，F(xiàn)EN1 酶可以發(fā)揮最佳的切割能力［2］。除此之外，F(xiàn)EN1 酶的切割效率會受到鹽離子的影響，如當(dāng)氯化鈉濃度為50 mmol/L 時，F(xiàn)EN1 酶的切割效率受到大大抑制［2］。FEN1 酶在25-85℃具有切割活性，哺乳動物FEN1酶在37℃下活性最強［9］。

FEN1 酶具有5'分枝結(jié)構(gòu)內(nèi)切酶活性（Flap endonucleases，F(xiàn)EN）、缺口依賴性核酸內(nèi)切酶活性（Gap endonuclease，GEN） 和5'外切酶活 性（Exonuclease，EXO）。

FEN1 酶5'分枝結(jié)構(gòu)內(nèi)切酶活性（FEN）的最佳底物結(jié)構(gòu)（圖1）為雙分枝DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)（Double Flap），并且FEN1 上有一疏水口袋恰好容納3'分枝結(jié)構(gòu)［10］。分枝結(jié)構(gòu)核苷酸在20 個以內(nèi)可以被FEN1酶快速有效剪切，但超過20 個核苷酸時，F(xiàn)EN1酶的剪切活性迅速降低，并且分枝結(jié)構(gòu)上結(jié)合了DNA 雙鏈或者大分子結(jié)構(gòu)也會抑制FEN1 酶的剪切 活性［11］。

圖1 分枝結(jié)構(gòu)內(nèi)切酶（FEN1）活性底物

FEN1 酶缺口依賴性內(nèi)切酶活性底物結(jié)構(gòu)（圖2）包括Y 型DNA 結(jié)構(gòu)、氣泡狀結(jié)構(gòu)（Bubble）等。其活性相較于分枝結(jié)構(gòu)內(nèi)切酶活性較低［12］。

FEN1 酶核酸外切酶活性底物結(jié)構(gòu)（圖3）包括缺刻結(jié)構(gòu)（Nick）、缺口結(jié)構(gòu)（Gap）、平末端雙鏈DNA（Blunt）、霍利迪連接體（Holiday junction）等結(jié)構(gòu)［12］。

圖2 缺口依賴性內(nèi)切酶（GEN）活性底物

圖3 核酸外切酶活性（EXO）底物

FEN1 酶在體外行使其活性使DNA 雙鏈斷裂的過程［12］：首先FEN1 酶識別5'Flap 片段并對其切割產(chǎn)生刻痕，當(dāng)DNA 雙鏈上出現(xiàn)缺口時，F(xiàn)EN1 酶可以從5'端移除一些核苷酸，然后在模板鏈上裂解，使最終得雙鏈DNA 斷裂（圖4）。

圖4 FEN1 酶體外切割DNA 雙鏈過程

1.3 FEN1酶的作用

FEN1 酶在生物細(xì)胞的DNA 代謝中扮演重要角色，參與DNA 復(fù)制過程和損傷修復(fù)過程，不僅如此，F(xiàn)EN1 酶在多種腫瘤組織中過度表達(dá)，并且通過不同的調(diào)控機制促進(jìn)腫瘤的發(fā)展及耐藥。

FEN1 酶在DNA 復(fù)制過程中主要參與岡崎片段的RNA 引物的過程降解，主要有兩種切除方式。第一種方式為在RNA 酶H（RNase H）切除大部分的RNA 引物后，在DNA-RNA 交匯處留下一個RNA殘基，此時FEN1 酶行使外切酶活性將其切除。第二種方式是RNA 引物發(fā)生移位，形成一個5'Flap結(jié)構(gòu)，此時FEN1 酶行使分枝結(jié)構(gòu)內(nèi)切酶活性將其 切除［13-15］。

DNA 損傷可根據(jù)來源分為兩類，一類源于體內(nèi)代謝產(chǎn)物的損傷［2］；另一類為體外環(huán)境及某些分子化合物的攻擊。而DNA 損傷的修復(fù)通路有光復(fù)活修復(fù)、堿基切除修復(fù)、重組修復(fù)以及SOS 緊急修復(fù)等。FEN1 酶目前闡述最清楚的是堿基切除修復(fù)過程。

FEN1 酶多態(tài)性改變和基因突變與腫瘤的發(fā)生相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)多肽位點69G →A 和4150G →T 與肺癌、乳腺癌及消化道腫瘤有關(guān)，并且這兩種多肽位點的改變與FEN1mRNA 表達(dá)下降有關(guān)［16-17］，因此這兩種多肽位點的改變可以用做癌癥的檢測。而改變FEN1 酶和Mg2+的結(jié)合位點，使得突變頻繁發(fā)生，無法進(jìn)行外源性DNA 損傷修復(fù)，使得小鼠患慢性炎癥和癌癥［18］。

FEN1 酶的表達(dá)改變也與腫瘤的發(fā)生相關(guān)。當(dāng)單倍體量不足時，F(xiàn)EN1 酶的活性降低，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Singh 等［19］發(fā)現(xiàn)FEN1 在乳腺癌、子宮癌、腎癌、卵巢癌及結(jié)腸癌組織中表達(dá)升高。研究發(fā)現(xiàn)FEN1 蛋白水平幾乎在所有腫瘤中都有所增加，并且FEN1 蛋白在大部分神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤和星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中表達(dá)也升高。

2 基于不同物質(zhì)與核酸作用的FEN1 酶生物傳感器

FEN1 酶所介導(dǎo)的生物傳感器多采用核酸侵入反應(yīng)（Invader assay）來進(jìn)行核酸的信號放大。該方法的檢測原理是基于FEN1 酶所具有的結(jié)構(gòu)特異性對錯配的序列的高度敏感性。反應(yīng)過程為FEN1 酶識別寡核苷酸與目標(biāo)DNA 形成三堿基的重疊結(jié)構(gòu)，并切割相應(yīng)的寡核苷酸，將產(chǎn)生的Flaps 片段作為識別信號，再通過二次裂解熒光共振轉(zhuǎn)移發(fā)卡探針（FRET probe）等方法進(jìn)行信號放大檢測（圖5）［20］。

2.1 單核苷酸多態(tài)性檢測

圖5 核酸侵入反應(yīng)原理圖［20］

單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）是人類基因組DNA 序列中最常見的變異形式，指在基因組水平上由單個核苷酸變異引起的DNA 序列多態(tài)性，包括置換、顛換、缺失和插入。在過去的幾年中，許多大規(guī)模的工作已經(jīng)確定了大量的SNP，并且到目前為止，用于這些多態(tài)性的公共存儲庫db- SNP（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP）包含了大約1 000 萬個SNP 的信息［21］。

Hall 等［22］將兩種侵入性裂解反應(yīng)結(jié)合成單一均勻試驗的分析方法，解決了初始侵入者分析方法的困難。如圖6 所示，這種連續(xù)入侵信號放大反應(yīng)（Serial invasive signal amplification reaction，SISAR）為目前使用的大多數(shù)入侵檢測方法奠定了基礎(chǔ)。該方法最初應(yīng)用于單核苷酸反應(yīng)，要求在單獨的反應(yīng)中研究每個SNP 等位基因。隨后，使用兩個單獨的FRET 盒式寡核苷酸將該實驗轉(zhuǎn)化為單管雙重檢驗，可以得到兩個SNP 等位基因的熒光信號。

圖6 連續(xù)入侵信號放大反應(yīng)（SISAR）原理圖［22］

2.2 甲基化檢測

現(xiàn)代DNA 甲基化作為最早發(fā)現(xiàn)的修飾途徑之一，是指由S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）將其胞嘧啶催化為 5-甲基胞嘧啶的過程［23］。

2012 年，臨床化學(xué)上刊登了對糞便中結(jié)直腸癌相關(guān)甲基化基因的檢測方法（圖7），QuARTS 法（Quantitative allele-specific real-time target andsignal amplification），該方法將實時熒光 PCR 與核酸侵入信號擴增反應(yīng)相結(jié)合，利用核酸侵入反應(yīng)序列識別的高特異性和 PCR 擴增的高靈敏性提高了檢測的特異性。該方法分為3 個部分，首先先對靶標(biāo)進(jìn)行擴增，隨后利用FEN1 酶的對所形成三堿基結(jié)構(gòu)進(jìn)行切割釋放Flaps 片段，最后再通過熒光能量共振轉(zhuǎn)移的方法獲得信號。QuARTS 法檢測甲基化標(biāo)記物可檢測出大多數(shù)大腸癌和腺瘤，特異性閾值高達(dá)95%［24］。

圖7 核酸侵入反應(yīng)偶聯(lián)PCR 定量檢測DNA 甲基化水平（QuARTS）的原理圖［24］

2.3 基因型檢測

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，人類疾病都直接或間接地與基因有關(guān)，利用P53 基因來診斷癌癥等都表明檢測基因型對現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的重要性。

FEN1 酶所介導(dǎo)的核酸生物傳感器是一種快速、精確的對基因型進(jìn)行檢測的方法，具有巨大的醫(yī)療價值。為降低FRET 的檢測成本，促進(jìn)其更好的被利用，可以采用以下兩種方法對其進(jìn)行替代：第1種方法是采用檢測偏振光的變化［25］，熒光分子可以被平面偏振光激發(fā)產(chǎn)生熒光偏振（Fluorescence polarization FP），而熒光偏振依賴于染料分子的分子量。Hsu 等［25］在使用FP 進(jìn)行檢測中使用兩個不同熒光體的信號探針，熒光素和羧基四甲基羅丹明（Carboxytetramethylrhodamine TAMRA）。因此，可以在一個反應(yīng)中測定每個樣品，從而節(jié)省時間和減少基因型雜合。第2 種方法是使用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（Matrix-assisted laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）的方式進(jìn)行替代［26］。MALDI-TOF 質(zhì)譜法可以對短DNA 探針進(jìn)行溫和分析并且具有較高靈敏度的方法，同時飛行時間（TOF）探測器提供了很好的分辨率。并且在該方法中，混合物的每一組分在質(zhì)譜上幾乎都有一個單峰。MALDI-TOF 質(zhì)譜法成為分析復(fù)雜混合物的一種選擇方法，并且近年來，此技術(shù)已廣泛應(yīng)用于DNA、PNA 和抗生素的定量分析中［27］。因此，采用MALDI-TOF MS 檢測反應(yīng)中產(chǎn)生的Flap 分子，可對多個基因同時分型檢測。

不僅如此，美國Third Wave Technologies 公司（Madison，WI）開發(fā)了一種新的基于微滴度板的測定方法［28］，稱為InvaderTM，可用于基因型的檢測。該方法將核酸侵入反應(yīng)與和使用微滴度板相結(jié)合，在發(fā)生裂解之后可以采用微滴度板檢測熒光標(biāo)記的產(chǎn)品，基因型由凈野生型/突變信號比決定。2000 年，Hessner 等［29］對1 369 個個體進(jìn)行導(dǎo)致活化蛋白C（Activated protein C，APC）耐藥的突變因子（FactorVleiden，F(xiàn)VL）進(jìn)行基因分型，分型結(jié)果與樣本結(jié)果一致，因此此方法被認(rèn)為是一種對FVL 進(jìn)行基因分型的快速、可靠的方法。

2.4 RNA檢測

RNA 定量在醫(yī)學(xué)研究上發(fā)揮越來越重要的作用。例如，病毒RNA 的定量可以預(yù)測疾病的進(jìn)展和治療效果，RNA 幾乎密切參與所有的細(xì)胞生理機制，隨著人類基因組計劃的重點轉(zhuǎn)向基因表達(dá)分析，該領(lǐng)域?qū)⑿枰环N靈活的RNA 分析技術(shù)，能夠定量檢測多種形式的交替轉(zhuǎn)錄或處理過的RNA。

2001 年，Eis 等［30］利用核酸侵入原理來對總RNA 和細(xì)胞裂解樣品中的RNA 進(jìn)行檢測。利用此種方法可以對高度同源的RNA 進(jìn)行檢測，反應(yīng)分為兩部分。在初級反應(yīng)中（圖8-A），侵入性寡核苷酸和探針特異性地與它們各自的RNA 靶標(biāo)形成重疊結(jié)構(gòu)，隨后進(jìn)行切割、退火。初級反應(yīng)完成后，裂解的5'-Flap 然后在第二反應(yīng)中充當(dāng)侵入性寡核苷酸（圖8-B），與二級反應(yīng)模板（Secondary-reaction template，SRT）結(jié)合，所形成的5'-Flap-SRT 復(fù)合物切割多個FRET 脫氧寡核苷酸時產(chǎn)生熒光信號。

圖8 核酸侵入反應(yīng)偶聯(lián)PCR 定量檢測RNA 的原理圖［30］

RNA 侵入性切割測定的形式與用于基因組DNA檢測的主要有以下幾點不同。首先，RNA 侵入切割測定需要兩個寡核苷酸（FRET 和STR），DNA 檢測中只需要一種寡核苷酸。其次，因為RNA 侵入切割測定是一種依賴于靶物質(zhì)和時間的線性擴增信號，所以在測定過程中要注意兩個反應(yīng)的順序操作，以防止形成X-結(jié)構(gòu)。而對基因組DNA 的檢測是兩個反應(yīng)同時進(jìn)行，并將信號放大作為目標(biāo)水平［22］。

MicroRNA（miRNA）是一類小的內(nèi)源性非編碼RNA 分子，大概由21-25 個核苷酸組成，可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。近年來研究表明，miRNA 參與包括發(fā)育，細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡，脂肪代謝，激素分泌和腫瘤發(fā)展等過程［31］。所以可以通過開發(fā)研究期新方法，促進(jìn)人們對miRNA 的理解。

Allawi 等［32］及其同事對核酸侵入反應(yīng)進(jìn)行改進(jìn)，新開發(fā)出一種用于miRNA 敏感性和特異性的方法，命名為Invader miRNA。該方法是對先前設(shè)計的Invader mRNA 的擴展應(yīng)用［30，33］。在Invader mRNA中使用Cleavase 酶對形成的三堿基重疊結(jié)構(gòu)進(jìn)行剪切并釋放5'Flap 片段，而Cleavase 酶是FEN1 酶家族中的一員［34］。而miRNA 因為其較小所以需要對入侵結(jié)構(gòu)和探針進(jìn)行一些修飾。設(shè)計入侵結(jié)構(gòu)和探針在5'和3'末端含有自身互補序列（圖9-C），使miRNA 靶特異性區(qū)域（Target specific region，TSR）的兩側(cè)都形成側(cè)翼發(fā)夾結(jié)構(gòu)。這些側(cè)翼結(jié)構(gòu)通過促進(jìn)三堿基重疊結(jié)合的形成，以達(dá)到穩(wěn)定miRNA 靶序列與探針系統(tǒng)的作用，并且還提高Cleavase 酶反應(yīng)的效率。待Cleavase 酶切割后，與mRNA 測定一樣，然后釋放的5'Flap 片段可以結(jié)合二級反應(yīng)模板再次切割反應(yīng)以產(chǎn)生熒光信號。（圖9-B）。

圖9 核酸侵入反應(yīng)偶聯(lián)PCR 檢測mRNA 及miRNAD 的原理圖［32］

Chenna 和Tian 等［35］通過對Invader mRNA 方法的進(jìn)一步改進(jìn)，使其達(dá)到多通量檢測mRNA 的目的。該方法描述了一種使用電泳標(biāo)記（Electrophoretic tags，eTag）來編碼和量化mRNA 目標(biāo)的多路復(fù)用方法，eTag 是一種小熒光分子庫，它們具有相同的熒光性質(zhì)，但又具有不同的電荷質(zhì)量比，通過激光誘導(dǎo)熒光（Laser-induced fluorescence，LIF）作用后產(chǎn)生預(yù)定義的電泳特性。首先將兩個目標(biāo)特異性的探針與mRNA 三堿基重疊結(jié)構(gòu)，信號探針在其5'末端的堿基處連接一個eTag 分子（圖10-A）。然后利用Cleavase 酶將5'Flap 片段與eTag 分子一起裂解，釋放，再通過激發(fā)誘導(dǎo)熒光以及毛細(xì)管電泳（Capillary electrophoresis，CE）實現(xiàn)對mRNA 的檢測（圖10-B）。多路復(fù)用是通過將不同的eTag 分子分配給多個目標(biāo)特異性信號探針來實現(xiàn)的。采用LIF 結(jié)合 CE 的方式大大提高了反應(yīng)的靈敏度，并且因為CE 的檢測限（Limit of detection，LOD）一般在亞皮摩爾范圍，因此只需進(jìn)行一次Invader mRNA 便可以直接測定粗裂解液中的mRNA，在eTag 多重檢測mRNA 系統(tǒng)中實現(xiàn)了前所未有的基因表達(dá)簡化分析。

2.5 病毒檢測

丙型肝炎病毒（HepatitisCvirus，HCV）感染是一個全球性的公共衛(wèi)生問題，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球HCV 的感染率約為3%，每年約有3.5 萬新發(fā)HCV 感染病例［36］。在我國，HCV 感染病例約2 000 萬例，HCV 感染在我國是繼乙型肝炎、肺結(jié)核、痢疾之后第四大常見的感染性疾?。?7］。HCV 感染可能導(dǎo)致慢性肝炎，甚至發(fā)展成潛在的致命性肝硬化和肝細(xì)胞癌。因此，可以對HCV 進(jìn)行相應(yīng)的檢測。

2013 年，Kenichi 等［38］采用實時PCR 檢測核酸侵入反應(yīng)（Q-Invader 法）對HCV-1b 核心區(qū)域中70/91 位的突變進(jìn)行檢測。侵入反應(yīng)對于檢測基因組DNA 或PCR 產(chǎn)物中的單核苷酸差異具有較高的特異性，再通過實時熒光PCR 可以獲得高靈敏度的定量分析。通過對上述兩個位置（70 和91）的野生型/突變序列標(biāo)記不同的熒光基團，對123 名患者進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示Q-Invader 法可以對突變體變體的檢測低至總量的1%。

2018 年，Kenichi Tadokoro 團隊［39］再次利用Q-Invader 法與直接測序法比較測定了HCV 感染中的Y93H 突變。結(jié)果顯示Q-Invader 測定的靈敏度與用于HCV 檢測的直接測序分析的靈敏度相同，并且Q-Invader 測定可以檢測通過直接測序分析無法檢測的次要菌株。因此，Q-Invader 測定可以用于臨床環(huán)境中對HCV 患者的檢測。

圖10 核酸侵入反應(yīng)偶聯(lián)eTag 多重檢測mRNA 的原理圖［35］

2.6 腫瘤檢測

大腸癌是消化道惡性腫瘤中常見的一種癌，發(fā)病率僅次于胃癌和食管癌，死亡率在惡性腫瘤中占第3-6 位。大腸癌早期并沒有明顯癥狀，不易被發(fā)現(xiàn)，一旦發(fā)現(xiàn)便血等癥狀，病程已經(jīng)達(dá)到中晚期。而手術(shù)效果與患病階段有密切關(guān)系：早期發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行手術(shù)患者存活率可高達(dá)90%以上；晚期癌即使手術(shù)，存活率也不足10%。因此，早期發(fā)現(xiàn)，早期治療是防治大腸癌的關(guān)鍵。

而大腸癌的發(fā)生發(fā)展與多個基因的甲基化密切相關(guān)，而核酸侵入反應(yīng)偶聯(lián) PCR 定量檢測 DNA 甲基化水平為大腸癌的檢測提供了一種新思路?；騿幼訁^(qū)超甲基化造成骨形態(tài)發(fā)生蛋白3（Bone morphogenetic protein 3，BMP3）基因表達(dá)下調(diào)，是引發(fā)結(jié)直腸癌的重要機制之一［40-42］。NDRG4 基因也與2014 年被美國美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and drug administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)作為大腸癌糞便檢測的其中一種靶標(biāo)［42］。

嚴(yán)志進(jìn)等［43］對 QuARTS 法進(jìn)行了改進(jìn)，通過△CT 法［44］進(jìn)行甲基化定量。反應(yīng)中以 NDRG4 為目的基因，引入ACTB 作為參比基因，對檢測體系進(jìn)行優(yōu)化，使兩基因的擴增效率均接近 100%，通過測定目的基因與參比基因的 CT 值的差值，計算出甲基化基因的相對甲基化水平，以此來對甲基化進(jìn)行定量。劉琳琳［40］等采用相同的核酸侵入反應(yīng)偶聯(lián) PCR 定量檢測 DNA 甲基化水平的方法對BMP3基因進(jìn)行了定量檢測（圖11）。該方法可以準(zhǔn)確檢測低至 0. 01%的DNA 甲基化。并且該方法避免了使用高濃度標(biāo)準(zhǔn)目的基因片段測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，降低了污染風(fēng)險，同時簡化了實驗操作，在低豐度甲基化基因的臨床定量檢測中有著巨大的應(yīng)用前景。

肺癌是當(dāng)今癌癥死亡的主要原因，根據(jù)《中國腫瘤年報2015》的數(shù)據(jù)顯示，我國每年肺癌發(fā)病78.1 萬例，死亡病例約62.6 萬［45］。非小型細(xì)胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌中的主要類型，約占肺癌中的80%-85%，通過大規(guī)模的基因測序工程后發(fā)現(xiàn)，表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）的突變與肺癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，EGFR 突變已被報道為非小型細(xì)胞肺癌治療中一個非常重要的因素［46］。

圖11 核酸侵入反應(yīng)偶聯(lián) PCR 定量檢測 DNA 甲基化水平的原理圖［40］

Naoki 等［47］通過核酸侵入反應(yīng)偶聯(lián)PCR 的過程對非小型細(xì)胞肺癌中的EGFR 突變位點進(jìn)行檢測（圖12），可以檢測稀釋100-1 000 倍的肺癌細(xì)胞系的已知EGFR 突變，顯現(xiàn)了較高的靈敏度，在臨床檢測上具有較高的應(yīng)用價值。

2.7 微生物檢測

細(xì)菌（Bacteria）是生物的主要類群之一，也是所有生物中數(shù)量最多的一類。細(xì)菌對人類活動產(chǎn)生較大的影響，一方面，細(xì)菌是許多疾病的病原體：另一方面，人類也利用細(xì)菌進(jìn)行酸奶的制造和部分抗生素的制造。實時PCR 是最常用的細(xì)菌定量分析方法之一，但是不管是采用熒光探針或者插入熒光染料，都使得對細(xì)菌成本的檢測較高。針對以上狀況，Kenichi 等［48］改進(jìn)了對病毒進(jìn)行對皰疹病毒的定量的Invader PLUS 法，使其用于多種細(xì)菌類型，稱為m-Invader PLUS（Modification of the invader PLUS）法（圖13）。反應(yīng)過程中，PCR 和核酸侵入反應(yīng)同時進(jìn)行，變性PCR 產(chǎn)物結(jié)合侵入初級探針和延伸引物形成侵入性復(fù)合物，釋放的5'-Flap（第一反應(yīng)的產(chǎn)物）促進(jìn)第二反應(yīng)中通用FRET 盒的裂解。隨后對唾液樣品進(jìn)行的6 種牙周炎相關(guān)細(xì)菌測定中，m-Invader PLUS 與實時PCR 具有良好的相關(guān)性。

圖12 核酸侵入反應(yīng)偶聯(lián) PCR 定量檢測 EGFR 突變的原理圖［47］

圖13 m-Invader PLUS 測定的兩個反應(yīng)的示意圖［48］

分枝桿菌是一大類細(xì)菌菌種，其中的一些細(xì)菌會引起人類疾病，如結(jié)核分枝桿菌導(dǎo)致人類罹患結(jié)核病，麻風(fēng)分枝桿菌會引起麻風(fēng)病等［49］。在臨床檢測中，急需一種快速、準(zhǔn)確的分枝桿菌感染診斷方法。Ichimura 等［50］將BACTEC MGIT 960 系統(tǒng)與入侵檢測方法的結(jié)合來對分枝桿菌進(jìn)行檢測。其中使用BACTEC MGIT 960 系統(tǒng)可以極大的縮短分枝桿菌檢測時間，使用核酸侵入反應(yīng)不僅具有極高的準(zhǔn)確性和特異性，還需要事先進(jìn)行目標(biāo)擴增就可以直接在基因組DNA 上進(jìn)行檢測。隨后他們對122 株陽性液體培養(yǎng)物進(jìn)行檢測，檢出率達(dá)到95.1%，說明該方法快速、簡便、準(zhǔn)確，是分枝桿菌感染診斷的有效方法。

2.8 FEN1酶介導(dǎo)的其他生物傳感器

流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）是一種靈敏、定量的測量顆粒或細(xì)胞熒光或光散射的方法，它在配體結(jié)合和酶動力學(xué)、藥物篩選、可溶性試劑診斷和檢測、DNA 序列檢測或分析等領(lǐng)域都有所應(yīng)用［51］。因此可以運用此種方法測定FEN1 酶的核酸內(nèi)切酶活性（圖14）。在鏈霉親和素包覆的微球上固定熒光標(biāo)記的DNA 底物，用FEN-I 測定DNA 的裂解，然后通過快速的動力學(xué)儀器和計算機建模可以確定這種相互作用的基本速率常數(shù)。此方法提供了一種連續(xù)測量底物解離的新方式［52］。

鏈置換反應(yīng)是指某些DNA 聚合酶在延伸新鏈的過程中如果遇到下游DNA 鏈，可以繼續(xù)延伸反應(yīng)并同時將下游雙鏈剝離而產(chǎn)生游離的單鏈［53］。2015年，Zou 等［54］提出了一種新的策略，將入侵反應(yīng)與鏈置換信號擴增耦合（Invasive reaction assisted strand-displacement signal amplification，IRASA），進(jìn)行目標(biāo)DNA 檢測。首先用兩個序列特異性探針進(jìn)行侵入反應(yīng)擴增目標(biāo)DNA，然后用鏈置換反應(yīng)擴增目標(biāo)DNA，用此種方法可以檢測低至0.2 pmol/L 的目標(biāo)DNA。并且由于二次放大對任何目標(biāo)都是通用的，因此該方法有效的降低的檢測成本，并且該方法可以區(qū)分目標(biāo)DNA 之間的單個堿基差異。

FEN1 酶所介導(dǎo)的生物傳感器除了在動物DNA基因分型上被使用，在植物基因分型上也有所利用。跨國種子公司正轉(zhuǎn)向新的DNA 標(biāo)記技術(shù)，以加快植物育種和作物改良的速度。為此，Zec 等［55］開發(fā)了一種可編程的、基于微流體的玉米基因組DNA 基因分型裝置（圖15）。微流控平臺的一個獨特功能是納米樣本處理器，它允許設(shè)備僅使用兩個輸入端連續(xù)加載數(shù)量不受限制的唯一DNA 樣本，克服了當(dāng)前由于設(shè)備占用空間小而對樣本輸入數(shù)量的限制。并且所需樣本量小，可以在50 nL 的液滴中完成基因分型，大大降低了每次反應(yīng)的試劑消耗。Helen 等進(jìn)行了240 次入侵反應(yīng)（針對10 個SNP 標(biāo)記檢測8個DNA 樣本），在單滴實驗中對植物DNA 樣本進(jìn)行SNP 調(diào)用的準(zhǔn)確率超過93%。

圖14 流式細(xì)胞術(shù)檢測FEN1 核酸內(nèi)切酶活性［52］

圖15 核酸侵入反應(yīng)偶聯(lián)微流體分型植物基因原理圖［55］

2.9 納米材料結(jié)合檢測

FEN1 酶與納米材料的結(jié)合多是通過納米金探針的方式。核酸納米金探針是將寡核苷酸片段修飾在納米金表面而形成的納米顆粒，表面的寡核苷酸片段可與待測靶核酸進(jìn)行特異性雜交，使納米金顆粒發(fā)生聚集，從而導(dǎo)致納米粒子光散射性質(zhì)發(fā)生改變，造成肉眼可見的顏色變化［56］。

將切口核酸內(nèi)切酶輔助擴增與基于納米顆粒的傳感器結(jié)合用于DNA 檢測（Novel nicking endonuclease-assisted nanoparticle amplification，NEANA）［57］。但在該方法中，切口核酸內(nèi)切酶（Nicking endonuclease，NEase）只識別雙鏈DNA 的特定核苷酸序列，因此，NEANA 無法檢測到?jīng)]有識別序列的目標(biāo)。為了提高NEANA 檢測各種序列的真實生物樣本的可行性，Zou 等［58］提出了通過將核酸侵入反應(yīng)與NEANA 偶聯(lián)進(jìn)行比色DNA 檢測（Invasive reaction with NEANA，IR-NEANA）。靶DNA 可通過核酸侵入反應(yīng)產(chǎn)生許多的Flap 片段，然后將Flap 片段與5'磷酸化的寡核苷酸連接以產(chǎn)生NEANA 的模板，隨后進(jìn)行NEANA 反應(yīng)（圖16）。因為侵入性反應(yīng)僅依賴于通過上游探針和下游探針與靶DNA 的特異性結(jié)合形成的重疊結(jié)構(gòu)，與常規(guī)NEANA 不同，任何DNA 序列都可以通過IR-NEANA 檢測。

圖16 核酸侵入反應(yīng)偶聯(lián)納米金探針可視化檢測法原理［58］

除了使用PCR 進(jìn)行擴增外，近年來發(fā)展起來并不斷完善的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）也是一種高靈敏DNA 擴增技術(shù)。其反應(yīng)過程始終維持在恒定的溫度下，通過添加不同活性的酶和引物來達(dá)到快速擴增核酸的目的［59］。為能對LAMP 擴增子進(jìn)行即時檢測（Point-of-care test，POST），Lu 等［60］提 出LAMP 基因分型結(jié)合核酸侵入，再通過金納米粒子的顯色實現(xiàn)可視化檢測（圖17）。由于侵入性反應(yīng)是高特異性的，因此可以準(zhǔn)確區(qū)分復(fù)雜LAMP 擴增子中的一個堿基差異，并且進(jìn)行核酸擴增過程是在恒定溫度下進(jìn)行的，只需要一個簡單的溫度控制器，操作更為簡便。陳銀等［61］也利用此種方法快速檢測腦膜炎奈瑟菌。

圖17 LAMP 基因分型結(jié)合核酸侵入反應(yīng)和雜交誘導(dǎo) AuNP 聚集的原理圖［60］

核酸侵入反應(yīng)與納米材料的結(jié)合在對蛋白的檢測中也表現(xiàn)出巨大潛力。Song 等［62］開發(fā)了一種核酸侵入反應(yīng)結(jié)合AuNPs 輔助酶聯(lián)免疫吸附實驗（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測方法（圖18），將該方法命名為iaELISA（Invader assisted ELISA）。該方法可以用于疾病生物標(biāo)志物檢測。首先對DNA 片段修飾了針對靶向抗原的抗體，然后結(jié)合AuNPs 進(jìn)行核酸侵入反應(yīng)，最后通過金納米粒子的顯色實現(xiàn)可視化檢測。并且該方法在對HBV 檢測中體現(xiàn)了較好的特異性。

流感病毒主要通過其在全世界引起急性呼吸道疾病的能力對人類健康構(gòu)成持續(xù)威脅。并且流感病毒的不斷變異和高速的傳播，是發(fā)病率和死亡率的最常見原因之一［63］。目前，多采用實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）對流感病毒感染分子進(jìn)行檢測［64］。相比較而言，LAMP 法更適合用于資源有限的區(qū)域或用于現(xiàn)場使用。Ge 等［65］開發(fā)了一種多重逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增結(jié)合使用納米顆粒作為傳感器的級聯(lián)核酸侵入反應(yīng)（Multiplex reverse transcription LAMP with cascade invasive reaction using nanoparticles，mRT-LAMP-CIRN）的新方法（ 圖19），用于同時擴增3 種亞型流感病毒（甲型流感/ H1N1pdm09，A/H3 和乙型流感），可適用于現(xiàn)場使用和低設(shè)備設(shè)置實驗室使用。

圖18 iaELISA 反應(yīng)原理圖［62］

2.10 FEN1酶體內(nèi)成像和治療

盡管FEN 通常被認(rèn)為是腫瘤抑制基因，但是癌癥的發(fā)生及癌基因復(fù)制過程中FEN1 高表達(dá)，并且許多研究表明FEN1 酶在癌細(xì)胞生長和增殖擴散中起到一定作用［66］。FEN1 在前列腺癌［67］、胰腺癌［68］、胃癌［69］、肺癌［70］及神經(jīng)母細(xì)胞瘤［71］等腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，因此FEN1 酶可以作為某些癌細(xì)胞的潛在生物標(biāo)記物。

正因為FEN1 酶與癌癥聯(lián)系的密切性，實驗可以利用合成致死方式來利用FEN1 合成抗癌藥。合成致死（圖20），簡單地說就是指在兩個非致死基因中，若僅其中的一個基因發(fā)生了變異，細(xì)胞仍會存活，若兩個基因同時發(fā)生變異，則將引起細(xì)胞死亡，這兩個基因則構(gòu)成合成致死搭檔（partner）。如果發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中某個基因失活或者用藥物抑制某個基因，與之構(gòu)成合成致死搭檔的另外的一個基因就有可能成為潛在的靶基因，那么對這個靶基因進(jìn)行抑制就能夠特異性的殺死癌細(xì)胞，并且不會影響正常細(xì)胞的存活（圖21）［72］。

圖19 級聯(lián)核酸侵入反應(yīng)和AuNP 信號檢測原理的示意圖［65］

圖20 合成致死原理［72］

圖21 合成致死方法在抗腫瘤藥物研究中可能的應(yīng)用［72］

而FEN1 酶可以和近20 種蛋白發(fā)生交互作用進(jìn)行體內(nèi)調(diào)控，因此認(rèn)為FEN1 可能與DNA 損傷修復(fù)過程中的多個基因形成合成致死搭檔，通過抑制FEN1 酶的表達(dá)就可以達(dá)到合成致死目的。近年來發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠在蛋白表達(dá)水平上下調(diào)FEN1 的表達(dá)，這可能是姜黃素抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的機制之一［73］。中藥鐵筷子中分離的一種強心苷類成分HTF-1 能劑量依賴性地下調(diào)FEN1 的表達(dá)，這也是此化合物能夠抑制癌細(xì)胞的原因之一［74］。通過基于機器學(xué)習(xí)的虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)一種名為JFD00950 萘類化合物具有FEN1 催化抑制活性［75］。N-羥基脲類化合物也可作為FEN1 的抑制劑。［76］

3 總結(jié)和展望

綜上，F(xiàn)EN1 酶所介導(dǎo)的生物傳感器已經(jīng)應(yīng)用于各個檢測領(lǐng)域，主要優(yōu)勢FEN1 酶對結(jié)構(gòu)的特異性識別，提高了檢測的靈敏度。其次，F(xiàn)EN1 酶的活度范圍廣，在較大的溫度區(qū)間內(nèi)均具有活性，并且FEN1 酶可以與多種信號輸出方式相結(jié)合（熒光法、微電流法等）以及新興的納米材料技術(shù)相結(jié)合，體現(xiàn)了其良好的兼容性。同時，F(xiàn)EN1 酶可以將不同種類的靶物質(zhì)轉(zhuǎn)換為核酸信號，并進(jìn)行FEN1 酶介導(dǎo)的信號放大，體現(xiàn)了其檢測的廣泛性。

目前，F(xiàn)EN1 酶所介導(dǎo)的生物傳感器主要用于DNA、RNA、病毒和細(xì)菌檢測等方面，但在實際應(yīng)用中多用于對疾病生物標(biāo)志物的檢測。未來對FEN1酶研究的發(fā)展趨勢可能為：（1）體內(nèi)作用研究：FEN1 酶在體內(nèi)不僅具有核酸酶活性，還與多種蛋白發(fā)生交互作用，可通過對FEN1 酶的進(jìn)一步研究更深入的了解人類的身體密碼。（2）生物傳感器的進(jìn)一步開發(fā)：生物傳感器的最終目的是進(jìn)行實際應(yīng)用，爭取用最短的時間最低的成本實現(xiàn)利益的最大化，而FEN1 酶作為一種結(jié)構(gòu)特異性核酸酶，所使用的范圍大，活度范圍廣，并且價格低廉，體現(xiàn)了其巨大的使用優(yōu)勢。（3）納米材料的多樣化搭載：納米材料因為其獨特的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)使得檢測的靈敏度大幅提高，并且檢測時間大大縮短，目前FEN1 酶與納米材料的研究多集中在與納米金粒子的結(jié)合上，未來在水凝膠、磁珠上可以有更廣泛的應(yīng)用。（4）抗腫瘤藥物的研發(fā)：FEN1 酶在多種腫瘤中的高表達(dá)體現(xiàn)了其在抗腫瘤藥物研發(fā)中的潛力，可以通過利用合成致死原理合成特異性的抗腫瘤 藥物。