張維嬌 金學(xué)榮 徐雅晴 李江華 堵國(guó)成 康振

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122）

枯草芽孢桿菌與真核系統(tǒng)相比具有生長(zhǎng)快，發(fā)酵周期短且易于培養(yǎng)等優(yōu)勢(shì)；與其他原核系統(tǒng)相比具有較強(qiáng)的分泌表達(dá)能力［1-2］，能有效避免細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的積累和不溶性包涵體的形成，其遺傳背景清晰，被認(rèn)為是下一代超高效分泌的細(xì)胞工廠［3］并具有開(kāi)發(fā)成底盤(pán)細(xì)胞的潛力［4］。

利用傳統(tǒng)的代謝工程手段可以實(shí)現(xiàn)一定時(shí)間內(nèi)目的產(chǎn)物的積累，但是由于局部途徑的過(guò)表達(dá)，往往會(huì)造成細(xì)胞代謝流的失衡［5］。如何平衡細(xì)胞的生長(zhǎng)與產(chǎn)物的高效合成是代謝工程的一個(gè)重要問(wèn)題［6］。微生物代謝流的分配在生長(zhǎng)過(guò)程中并非一成不變，而是隨著胞內(nèi)代謝物水平及環(huán)境的變化而發(fā)生動(dòng)態(tài)調(diào)整。動(dòng)態(tài)調(diào)控手段能在保證目的產(chǎn)物高效合成的情況下，同時(shí)平衡細(xì)胞的生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)量和高底物轉(zhuǎn)化率的統(tǒng)一。

本文主要從轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平上綜述了近幾年來(lái)枯草芽孢桿菌動(dòng)態(tài)表達(dá)調(diào)控工具的開(kāi)發(fā)，并就其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了介紹，最后對(duì)這些調(diào)控工具在產(chǎn)物合成中的應(yīng)用做了簡(jiǎn)要概述。

1 轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控

目的基因表達(dá)的第一步就是轉(zhuǎn)錄，在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控是最直接和最方便的?；虻霓D(zhuǎn)錄過(guò)程通常與外界物質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、胞內(nèi)代謝物以及群體環(huán)境等相關(guān)［7］，通過(guò)控制這些影響因子可以實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。

1.1 基于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的調(diào)控

與組成型啟動(dòng)子相比，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子具有可以人為控制基因轉(zhuǎn)錄的開(kāi)啟或者關(guān)閉等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，從而有效地應(yīng)用于基因的調(diào)控表達(dá)。近幾年來(lái)，多種類(lèi)型的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子被開(kāi)發(fā)，應(yīng)用于代謝調(diào)控中。常見(jiàn)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子有Pgrac（IPTG 誘導(dǎo)）、PspaS（枯草菌素誘導(dǎo)）、PxylA（木糖誘導(dǎo)）、Pglv（麥芽糖誘導(dǎo)）和PsacB（蔗糖誘導(dǎo)），這些啟動(dòng)子已被普遍用于產(chǎn)物的代謝調(diào)控［8］。Jiao 等［9］將啟動(dòng)子PgroE和PsacB融合構(gòu)建了蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pg1，同時(shí)將PgroE與lacO融合構(gòu)建了IPTG 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pg2，并進(jìn)一步通過(guò)在-35 與-10 區(qū)域進(jìn)行突變獲得啟動(dòng)子Pg3，最終使表面活性素高達(dá)9.74 g/L。為實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因的表達(dá)調(diào)控，Zhou 等［10］將來(lái)源于巨大芽孢桿菌的PxylA木糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子和來(lái)源于大腸的IPTG誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pgrac組合生產(chǎn)紫穗槐二烯，成功實(shí)現(xiàn)了在枯草芽孢桿菌中的調(diào)控。最近，Toymentseva等［11］開(kāi)發(fā)了基于lial啟動(dòng)子的LIKE 系統(tǒng)，其相似于乳酸菌NICE 系統(tǒng)［12］和枯草芽孢桿菌SURE 系統(tǒng)［13］，其能?chē)?yán)格調(diào)控基因表達(dá)，在非誘導(dǎo)條件下緊密關(guān)閉啟動(dòng)子。

考慮到誘導(dǎo)劑的補(bǔ)充和發(fā)酵過(guò)程的簡(jiǎn)化性，環(huán)境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子也逐漸被開(kāi)發(fā)。Welsch 等［14］通過(guò)將des啟動(dòng)子與冷休克蛋白cspB基因的下游表達(dá)框或5'-UTR 莖環(huán)結(jié)構(gòu)融合構(gòu)建成冷誘導(dǎo)啟動(dòng)子，在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，只需要通過(guò)溫度的控制即可以實(shí)現(xiàn)對(duì)木聚糖酶表達(dá)的調(diào)控。Li 等［15］從枯草芽孢桿菌中分離和鑒定了兩個(gè)溫度敏感型啟動(dòng)子，構(gòu)建了有效的溫度誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)。此外，還有一些環(huán)境依賴(lài)型的啟動(dòng)子，Yang 等［16］選擇了枯草芽孢桿菌114 個(gè)內(nèi)源啟動(dòng)子，以綠色熒光蛋白（GFP）為報(bào)告基因，分別對(duì)不同的溫度和pH 條件下啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行了表征，通過(guò)將不同表達(dá)時(shí)期的啟動(dòng)子組合可以實(shí)現(xiàn)脂酶、角蛋白酶和堿性果膠酶的差異性表達(dá)。

1.2 基于核糖開(kāi)關(guān)介導(dǎo)的表達(dá)調(diào)控

2002 年核糖開(kāi)關(guān)（Riboswitch）在細(xì)菌中被發(fā) 現(xiàn)，Riboswitch 是mRNA上的一段5'非翻譯區(qū)（5'UTR），包括核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）、操縱基因等元件，大多數(shù)核糖開(kāi)關(guān)由適體和表達(dá)平臺(tái)兩個(gè)部分組成。適體是其RNA 元件最保守的部分，可以與特定的小分子代謝物結(jié)合誘發(fā)mRNA 變構(gòu)，表達(dá)平臺(tái)作為遺傳控制元件將適體中的折疊變化轉(zhuǎn)化為基因表達(dá)的變化。

Riboswitch 主要有4 種調(diào)控形式，分別為轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的抑制和激活調(diào)控，如圖1 所示。在轉(zhuǎn)錄水平，若適體未結(jié)合配體之前處于打開(kāi)狀態(tài)，與配體結(jié)合后會(huì)使表達(dá)平臺(tái)形成不依賴(lài)ρ 因子（poly U）或依賴(lài)ρ 因子（rho）的終止結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為關(guān)閉狀態(tài)，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止，如枯草芽孢桿菌的S-腺苷甲硫氨酸（SAM）riboswitch［17］、賴(lài)氨酸（lysC）riboswitch［18］和yitJ riboswitch［19］都屬于這類(lèi)調(diào)控方式。然而與之調(diào)控機(jī)制相反的腺嘌呤（pbuE）riboswitch［20］，當(dāng)在胞內(nèi)存在高濃度的腺嘌呤時(shí)，腺嘌呤的結(jié)合可穩(wěn)定核糖開(kāi)關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域充當(dāng)抗終止元件，從而導(dǎo)致下游基因的表達(dá)上調(diào)。大多數(shù)核糖開(kāi)關(guān)可分為適體和表達(dá)平臺(tái)兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，而甘氨酸核糖開(kāi)關(guān)［21］存在兩個(gè)類(lèi)似適體的配體結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域以一個(gè)短的保守序列連接，與配體結(jié)合后激活基因的表達(dá)，這種獨(dú)特結(jié)構(gòu)需確保過(guò)量的甘氨酸提供檸檬酸循環(huán)中的碳通量，當(dāng)甘氨酸濃度減小時(shí)，核糖開(kāi)關(guān)會(huì)快速關(guān)閉并保持足夠量的氨基酸用于蛋白質(zhì)合成［22］。除此之外，翻譯水平的riboswitch 將在下文進(jìn)行介紹。

1.3 基于群體感應(yīng)的表達(dá)調(diào)控

群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）是細(xì)菌細(xì)胞間通訊的一種形式［23］，多存在革蘭氏陰性菌中，主要是通過(guò)響應(yīng)細(xì)胞密度進(jìn)行基因的表達(dá)調(diào)控，該過(guò)程的調(diào)控途徑是復(fù)雜的，需要多個(gè)酶和轉(zhuǎn)錄因子的共同作用。依賴(lài)于細(xì)胞密度調(diào)控的電路主要由誘導(dǎo)分子和受體蛋白兩部分組成，誘導(dǎo)分子與受體結(jié)合激活靶基因，靶基因在細(xì)菌中發(fā)揮必要的功能，QS 系統(tǒng)可以動(dòng)態(tài)平衡目標(biāo)產(chǎn)物的有效合成與細(xì)胞生長(zhǎng)之間的關(guān)系。

圖1 核糖開(kāi)關(guān)調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)理

革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均存在QS 系統(tǒng)，革蘭氏陰性菌的QS 系統(tǒng)已經(jīng)得到了很好的開(kāi)發(fā)［24］，目前在枯草芽孢桿菌中存在的QS 主要有ComPComA系統(tǒng)［25］和Phr-Rap系統(tǒng)［26］，Phr60-Rap60-Spo0A 系統(tǒng)是枯草芽孢桿菌中研究較多的群體感應(yīng)系統(tǒng)，Spo0A 是孢子形成的主要調(diào)節(jié)劑，必須磷酸化才能發(fā)揮活性。此外，隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)，細(xì)胞密度的增加會(huì)促使Phr60 增加［27］，并通過(guò)Opp 轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入細(xì)胞，而Phr60 抑制Rap60 的活性，Rap60 通過(guò)調(diào)節(jié)磷酸化基來(lái)負(fù)調(diào)控Spo0A 的活性，從而激活Spo0A 調(diào)控基因的表達(dá)。其QS 調(diào)控途徑如圖2 所示，Cui 等［28］利用Phr60-Rap60-Spo0A 系統(tǒng)構(gòu)建了雙功能表達(dá)的分子開(kāi)關(guān)，通過(guò)增加前體磷酸烯醇丙酮酸（PEP）和庚二烯二磷酸（HDP）的供應(yīng)，以改善甲基萘醌-7（MK-7）的合成。Spo0A 抑制pyk和uppS 的表達(dá)導(dǎo)致從PEP 到TCA 途徑代謝通量受到限制，IPP 的消耗減少，在后期階段因?yàn)楸岬纳桑?xì)胞生長(zhǎng)迅速下降，其最終MK-7 的產(chǎn)量增加，Spo0A 上調(diào)ispH 和hepS/T 的表達(dá)，將碳通量推向MK-7 合成途徑，動(dòng)態(tài)平衡有毒物質(zhì)HMBPP 和DMAPP 對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。Boguslawski 等［29］確定了Rap 蛋白調(diào)節(jié)ComA 活性的新機(jī)制，提出了Rap60 結(jié)合ComA 并抑制其活性，而不會(huì)干擾ComA與DNA 的結(jié)合的新研究。Wolf 等［30］分析了ComA激活基因的轉(zhuǎn)錄機(jī)制，通過(guò)對(duì)比rapA，rapC，srfAA和lutP 等啟動(dòng)子序列發(fā)現(xiàn)ComA 除了結(jié)合反向重復(fù)序列（Inverted repeat，IR），還會(huì)結(jié)合直接重復(fù)序列（Direct repeat，DR），并以熒光為報(bào)告基因驗(yàn)證了DR 是ComA 與啟動(dòng)子結(jié)合的功能序列，同時(shí)利用凝膠電泳表明ComA 是通過(guò)與α 亞基相互作用而促進(jìn)RNAP 募集到啟動(dòng)子的過(guò)程。但ComP-ComA 系統(tǒng)還未見(jiàn)在代謝調(diào)控中的應(yīng)用。

圖2 QS 調(diào)控系統(tǒng)原理圖

2 轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控

轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控是在mRNA水平上進(jìn)行的調(diào)控，主要有小RNA（small ribonucleic acids，sRNAs）、 Riboswitch 和CRISPR 系統(tǒng)。

2.1 基于sRNAs介導(dǎo)的表達(dá)調(diào)控

sRNAs 是重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，在枯草芽孢桿菌中目前預(yù)測(cè)和鑒定的sRNAs 一共有108 個(gè)［31］，sRNAs 通過(guò)與mRNA 堿基互補(bǔ)配對(duì)可改變mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)并激活或抑制翻譯，從調(diào)節(jié)方式上可分為順式作用（trans-encoded）和反式作用（cis- encoded）。FsrA 是枯草芽孢桿菌發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)transencoded RNAs，其參與鐵代謝相關(guān)的靶標(biāo)mRNA，同時(shí)需要伴侶蛋白FbpA、FbpB 和FbpC［32］的參與。SR1 是枯草芽孢桿菌第一個(gè)雙功能的sRNAs，一方面可以與靶標(biāo)ahrC 的mRNA 堿基配對(duì)抑制翻譯，還參與精氨酸的分解代謝［33］；另一方面也可以充當(dāng)編碼肽SR1P 的mRNA。SR1P 與糖酵解酶GapA 形成GapA/SR1P 復(fù)合物并與RNase J1 相互作用，從而促進(jìn)RNase J1 目標(biāo)的降解［34］。

Cis-encoded RNAs 一般存在毒素-抗毒素（Toxin-Antitoxin）系統(tǒng)中，毒素基因編碼一個(gè)有毒性蛋白，抗毒素基因轉(zhuǎn)錄的sRNAs 與毒素基因形成sRNAsmRNA 配對(duì)復(fù)合物，從而抑制翻譯和影響mRNA 的穩(wěn)定性。Yang 等［35］以GFP 為報(bào)告基因，通過(guò)對(duì)TypeI毒素-抗毒素bsrG/sr4進(jìn)行優(yōu)化，構(gòu)建了MSDOS（Modulation via the sRNA-dependent operation system）轉(zhuǎn)錄后調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)，其調(diào)控機(jī)理如圖3 所示，將MS-DOS 系統(tǒng)應(yīng)用于透明質(zhì)酸（HA）合成過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)通過(guò)下調(diào)參與磷酸戊糖徑途、糖酵解途徑和細(xì)胞壁多糖合成的9 種基因，其抑制zwf、pfkA和galE基因表現(xiàn)了對(duì)HA 合成明顯的積極影響，基因pfkA的下調(diào)使得HA 的最高產(chǎn)量達(dá)1.52 g/L，是原始菌株的1.6 倍。編碼6-磷酸果糖激酶的pfkA基因是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，pfkA失活會(huì)引起嚴(yán)重的生長(zhǎng)缺陷［36］。應(yīng)用MS-DOS，可以在任何指定的時(shí)間點(diǎn)通過(guò)添加IPTG 抑制pfkA 基因，以協(xié)調(diào)細(xì)胞生長(zhǎng)和HA 的合成，此處MS-DOS 僅通過(guò)引入單個(gè)RNAsr4即可實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因的同時(shí)精確抑制，這與其他報(bào)道的干擾系統(tǒng)完全不同。為進(jìn)一步促進(jìn)枯草芽孢桿菌的應(yīng)用，Yang 等［37］構(gòu)建了新型、穩(wěn)定的枯草芽孢桿菌食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)（Type Ⅱ毒素-抗毒素系統(tǒng)ydcD/ydcE），該系統(tǒng)在不添加抗生素的條件下，菌株傳代100 后質(zhì)粒仍然穩(wěn)定存在，利用該系統(tǒng)將透明質(zhì)酸合酶構(gòu)建于HA 合成途徑中，同對(duì)照相比，獲得了更大的生物量（OD600）和更高的HA產(chǎn)量0.6 g/L，與由抗生素維持的常用表達(dá)系統(tǒng)相比，該新型表達(dá)系統(tǒng)消除了代謝負(fù)擔(dān)并促進(jìn)了細(xì)胞生長(zhǎng)。類(lèi)似的txpA/ratA和bsrE/sr5毒素-抗毒素系統(tǒng)也通過(guò)影響mRNA 降解的機(jī)制達(dá)到調(diào)控基因的目的［38］。

2.2 基于Riboswitch表達(dá)調(diào)控

Riboswitch 一方面是通過(guò)對(duì)RBS 序列遮蔽和暴露進(jìn)行調(diào)控，枯草芽孢桿菌yjdF riboswitch［39］處于關(guān)閉狀態(tài)，與RBS 區(qū)域配對(duì)遮蔽RBS 序列，導(dǎo)致翻譯被抑制；其與配體結(jié)合后表達(dá)平臺(tái)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，RBS 區(qū)域被暴露出來(lái)進(jìn)而激活下游基因的表達(dá)。許多細(xì)菌的mRNA 翻譯起始取決于同核糖體結(jié)合的RBS 與起始密碼子的距離［40］，Suess 等［41］創(chuàng)建了一種新型的茶堿核糖開(kāi)關(guān)，通過(guò)在距離RBS不同位置處插入莖環(huán)結(jié)構(gòu)，該元件可干擾核糖體結(jié)合并能將其位置可逆地移動(dòng)1 nt，配體茶堿結(jié)合后誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，并調(diào)整合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。

圖3 bsrG/sr4 毒素-抗毒素系統(tǒng)原理圖

Riboswitch 還可以通過(guò)對(duì)mRNA 的穩(wěn)定性進(jìn)行基因的表達(dá)調(diào)控，通常與胞內(nèi)代謝物的濃度相關(guān)?？莶菅挎邨U菌glmS核酶riboswitch［42］，如圖4 所示，其與代謝物6-磷酸氨基葡萄糖（GlcN6P）發(fā)生響應(yīng)，當(dāng)細(xì)胞中過(guò)量積累GlcN6P 時(shí)glmS核酶將被激活，在5'位點(diǎn)附近發(fā)生自催化特異性裂解，從而導(dǎo)致glmSmRNA 不穩(wěn)定和表達(dá)量降低。Klein 等［43］證實(shí)了在glmS核酶第40 位發(fā)現(xiàn)了重要的鳥(niǎo)嘌呤（G）位點(diǎn)，將其突變?yōu)橄汆堰剩ˋ）后消除了glmS核酶的催化作用。Winkler 等［44］進(jìn)一步對(duì)glmS核酶進(jìn)行了一系列突變，其中將裂解位點(diǎn)AG 突變?yōu)镃C 的M9 突變體顯示了20 倍以上的β-半乳糖苷酶活性，表明glmS核酶活性被抑制。根據(jù)這一原理，Niu 等［45］設(shè)計(jì)了GlcN6P 響應(yīng)性glmS核酶開(kāi)關(guān)，動(dòng)態(tài)控制GlcN6P 供應(yīng)和消耗所涉及的pgi、pfkA和glmM基因的表達(dá)，使得GlcNAc 的產(chǎn)量可達(dá)16.26 g/L，形成了GlcNAc 合成途徑、肽聚糖合成途徑（PSP）、糖酵解途徑（EMP）和磷酸戊糖途徑（HMP）之間的代謝平衡，細(xì)胞內(nèi)GlcN6P 濃度的水平影響代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性調(diào)節(jié)，其可以形成反饋路徑，動(dòng)態(tài)的平衡細(xì)胞生長(zhǎng)和GlcNAc 的合成，減少了副產(chǎn)物乙偶姻的產(chǎn)生。這一glmS核糖開(kāi)關(guān)的調(diào)控機(jī)制在釀酒酵母和大腸桿菌中也普遍進(jìn)行了研究。

圖4 glms mRNA 的失穩(wěn)機(jī)制

2.3 基于CRISPR系統(tǒng)的表達(dá)調(diào)控

CRISPR 系統(tǒng)由核酸內(nèi)切酶Cas9 和sgRNA（single-guide RNA）兩部分組成，這個(gè)sgRNA 可以幫助Cas9 定位到目標(biāo)序列，從而對(duì) DNA 序列進(jìn)行定點(diǎn)切割，PAM 基序（Proto-spacer adjacent motifs）有利于識(shí)別目的序列的位點(diǎn)，位于切割序列的下游。CRISPR系統(tǒng)調(diào)控可分 為CRISPRi（CRISPR inhibition）和CRISPRa（CRISPR activator）［46］，如圖5 所示，Cas9 的D10A 和H840A 位點(diǎn)突變形成失活的dCas9（deactivated Cas9），該突變體缺乏核酸內(nèi)切酶活性，保留了結(jié)合DNA 的活性［47］，將dCas9定位到靶序列會(huì)阻礙基因的轉(zhuǎn)錄，而與激活因子結(jié)合后可以募集RNA 聚合酶（RNA polymerase，RNAP），促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。

Wang 等［48］為了提高枯草芽孢桿菌中表面活性素的產(chǎn)生，使用CRISPRi 技術(shù)分別抑制了氨基酸生物合成分支代謝途徑上的20 個(gè)基因，由于細(xì)胞會(huì)將能量從生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)，因此高生產(chǎn)率可能會(huì)降低細(xì)胞生長(zhǎng)，然而，其中對(duì)單基因yrpC、racE的抑制表現(xiàn)了更高的細(xì)胞生物量和較高的表面活性素產(chǎn)量，因?yàn)槠渚哂懈叩牡孜锢盟俾?。在枯草芽孢桿菌中，由Pxyl啟動(dòng)子介導(dǎo)的dCas9 表達(dá)比其他啟動(dòng)子具有更高的抑制效率［49］，Wu 等［50］開(kāi)發(fā)了一種基于木糖誘導(dǎo)的枯草芽孢桿菌CRISPRi 系統(tǒng)，當(dāng)抑制PSP 中的glmM時(shí)，較高的碳通量被導(dǎo)向EMP，對(duì)EMP 中pfkA基因抑制可以緩解碳溢出，基因zwf表達(dá)被抑制，其利用葡萄糖量減少而木糖增多，說(shuō)明zwf的缺失抑制了葡萄糖流入HMP，導(dǎo)致大量碳通量導(dǎo)向EMP，同時(shí)對(duì)PSP、EMP 和HMP 這三個(gè)途徑進(jìn)行抑制，可以減少葡萄糖分解代謝并促進(jìn)木糖的利用，使GlcNAc 產(chǎn)量提高了13.2%。Westbrook等［51］通過(guò)CRISPRi 減少pfkA和zwf的表達(dá)從而減少中間代謝碳的流失，可以將碳通量分別從EMP 和HMP 途徑重新定向到細(xì)胞壁的生物合成，并通過(guò)適當(dāng)調(diào)節(jié)pfkA和zwf的抑制強(qiáng)度可以顯著提高HA的產(chǎn)生，而不會(huì)影響HA 的分子量，同時(shí)對(duì)細(xì)胞生理的影響較小。研究發(fā)現(xiàn)RNAP 的ω 亞基與啟動(dòng)子上游區(qū)域的dCas9 融合可以實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)錄激活（CRISPRa）［52］，最近，Lu 等［53］首次在枯草芽孢桿菌中應(yīng)用CRISPRa 系統(tǒng)，dCas9-α/ω 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控高度依賴(lài)靶位，因此可以通過(guò)設(shè)計(jì)特定的sgRNA來(lái)同時(shí)激活和抑制不同基因的表達(dá)，結(jié)合dCas9-ω介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄和新型啟動(dòng)子工程O(píng)APS（Oligonucleotide annealing based promoter shuffling），枯草芽孢桿菌中淀粉酶的產(chǎn)量增加了260 倍。

圖5 CRISPRi 和CRISPRa 調(diào)控機(jī)理

3 總結(jié)與展望

枯草芽孢桿菌的動(dòng)態(tài)調(diào)控工具可以有效的平衡代謝產(chǎn)物的合成和細(xì)胞的自身生長(zhǎng)，從而維持代謝網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定，避免了細(xì)胞受損、中間代謝物積累以及產(chǎn)量低等問(wèn)題。枯草芽孢桿菌中的動(dòng)態(tài)調(diào)控可以通過(guò)誘導(dǎo)物的添加、QS 系統(tǒng)的響應(yīng)影響基因的轉(zhuǎn)錄，也可以利用sRNAs、Riboswitch 和CRISPR 調(diào)控基因的翻譯水平。

然而目前枯草芽孢桿菌的動(dòng)態(tài)調(diào)控工具仍然缺乏，且天然的sRNAs、QS 系統(tǒng)、Riboswitch 代謝因子響應(yīng)范圍較窄、調(diào)控元件數(shù)量不多、調(diào)控機(jī)理不清晰，而基于對(duì)細(xì)胞代謝全局調(diào)控需求的增加，開(kāi)發(fā)更多的調(diào)控工具去維持枯草芽孢桿菌的動(dòng)態(tài)平衡是有必要的。一方面可以進(jìn)一步鑒定枯草芽孢桿菌自身代謝物響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子、Riboswitch、sRNAs 等有關(guān)遺傳調(diào)控元件，挖掘更多的枯草芽孢桿菌自身調(diào)控機(jī)制，明確產(chǎn)物合成的磷酸戊糖徑途、糖酵解途徑、碳通量流向等代謝網(wǎng)絡(luò)信息，從而賦予枯草芽孢桿菌更好的動(dòng)態(tài)調(diào)控能力；另一方面基于不斷發(fā)展的系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)技術(shù)，可以定向設(shè)計(jì)目標(biāo)啟動(dòng)子、分析特定的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、改造sRNAs 的功能結(jié)構(gòu)等組合控制基因表達(dá)。加之高通量技術(shù)的應(yīng)用，更多潛在的調(diào)控元件將會(huì)被更加高效地篩選出來(lái)，大量遺傳調(diào)控元件被開(kāi)發(fā)，大大加快了微生物細(xì)胞工廠的構(gòu)建。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，枯草芽孢桿菌底盤(pán)細(xì)胞的潛力逐漸被呈現(xiàn)出來(lái)，其底盤(pán)細(xì)胞是通過(guò)基因組最小化、碳分解代謝物阻遏去除、細(xì)胞膜工程和蛋白質(zhì)分泌途徑工程獲得的，將動(dòng)態(tài)調(diào)控工具與人工底盤(pán)細(xì)胞結(jié)合應(yīng)用可以更加針對(duì)性的對(duì)目標(biāo)途徑進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)控及機(jī)制解析。