曹燕亭 劉延峰 李江華 劉龍 堵國成

（1. 江南大學 糖化學與生物技術教育部重點實驗室 生物工程學院，無錫 214122；2. 江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室 生物工程學院，無錫 214122）

近年來，合成生物學飛速發(fā)展，設計與構建微生物細胞工廠生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品成為化學品綠色生物制造的重要手段［1-4］。目前，研究人員已開發(fā)出許多合成生物學工具和策略來提高微生物細胞工廠生產(chǎn)的產(chǎn)量、轉化率和生產(chǎn)強度，如酶活性和表達水平的優(yōu)化、競爭途徑的阻斷、中心代謝改造和基于合成遺傳回路的動態(tài)調(diào)控等［4-6］。隨著生物合成的轉化率逐步接近理論的最大值，進一步提升生物合成效率變得更加困難，因此亟需開發(fā)新的工具和方法［7］。

隨著顯微鏡和流式細胞術等單細胞檢測技術的發(fā)展和應用，研究發(fā)現(xiàn)同基因型的純培養(yǎng)微生物中單細胞間的生長和代謝表現(xiàn)出異質(zhì)性，且存在不同的細胞亞群，即非生產(chǎn)、低產(chǎn)或高產(chǎn)細胞亞群同時存在［8-13］。高產(chǎn)細胞亞群由于引入的異源途徑會與細胞內(nèi)源過程競爭底物、核糖體、聚合酶等資源，其中間產(chǎn)物、終產(chǎn)物、基因表達的蛋白等也可能對細胞有毒性而形成生產(chǎn)負擔，從而表現(xiàn)出降低的生長適應能力［14-17］。與此相反，低產(chǎn)細胞亞群和非生產(chǎn)亞群消耗營養(yǎng)物質(zhì)卻不能高效合成目標產(chǎn)物，它們可能將更多的營養(yǎng)物質(zhì)用于細胞生長，因而比高效合成目標產(chǎn)物的高產(chǎn)細胞亞群更加具有生長優(yōu)勢。在長時間或者大規(guī)模發(fā)酵過程中，更加具有生長優(yōu)勢的低產(chǎn)細胞亞群和非生產(chǎn)亞群會逐漸取代高產(chǎn)細胞亞群，從而降低產(chǎn)物合成的綜合效率［18-19］。因此，細胞亞群調(diào)控有望成為提升生物合成效率的新途徑。

目前已發(fā)表綜述主要針對細胞亞群產(chǎn)生的機制、細胞亞群對生物合成的潛在影響、以及基于生物傳感器的細胞生長與產(chǎn)物合成偶聯(lián)的細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)的介紹和展望［7，20-23］，缺少關于細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)適用范圍受限和低產(chǎn)細胞亞群逃逸的討論和解決方法的提出。綜上，本文歸納總結了細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)設計和構建的常用方法，重點討論了目前細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)存在的問題及其解決策略。

1 細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)設計和構建的常用方法

隨著合成生物學的發(fā)展，研究人員已經(jīng)利用合成遺傳回路開發(fā)了細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)，這些系統(tǒng)結合“獎勵-懲罰”規(guī)則，利用正向響應產(chǎn)物濃度的生物傳感器調(diào)控抗生素抗性基因、氨基酸合成途徑關鍵基因和必需基因表達，將產(chǎn)物合成與細胞生長關聯(lián)起來，賦予高產(chǎn)細胞亞群生長優(yōu)勢，提高純培養(yǎng)物中高產(chǎn)細胞亞群所占的比例，從而改善了大腸桿菌中游離脂肪酸、酪氨酸和甲羥戊酸的合成［24-25］（圖1）。

Xiao 等［24］結合流式細胞儀分析了大腸桿菌中游離脂肪酸合成的異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)在同基因型的生產(chǎn)游離脂肪酸的大腸桿菌群體中只有15%的細胞能高效合成游離脂肪酸，且這個亞群的游離脂肪酸總產(chǎn)量超過了整個群體總產(chǎn)量的50%?；谝陨戏治?，研究者們開發(fā)了一個利用基于轉錄調(diào)控因子的生物傳感器的群體質(zhì)量控制系統(tǒng)（PopQC）調(diào)控細胞亞群，并將游離脂肪酸的產(chǎn)量提高了3 倍。群體質(zhì)量控制系統(tǒng)包括一個基于轉錄調(diào)控因子FadR 的生物傳感器，該生物傳感器可以正向響應游離脂肪酸濃度：在低產(chǎn)細胞或者非生產(chǎn)細胞內(nèi)，F(xiàn)adR 可以結合在啟動子PAR上，抑制tetA基因表達；而在高產(chǎn)細胞內(nèi)，高濃度目標產(chǎn)物的存在可以解除FadR 對啟動子PAR的阻遏，下游tetA基因連續(xù)表達。群體質(zhì)量控制系統(tǒng)通過這種方式偶聯(lián)合成和細胞生長，從而賦予高產(chǎn)細胞亞群生長優(yōu)勢，提升生物合成效率。同樣的策略應用于酪氨酸合成，致使酪氨酸產(chǎn)量提高了 2.6 倍［24］。

圖1 細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)設計與構建的常用方法

由于抗生素的使用會提高生產(chǎn)成本，增加抗生素污染的機會等，因此一種可避免抗生素使用的細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)被開發(fā)［24］。該系統(tǒng)將生產(chǎn)菌株基因組上的leuABCD基因拷貝敲除后，在質(zhì)粒上用基于FadR 的生物傳感器調(diào)控亮氨酸合成途徑基因（leuABCD）的表達，導致低產(chǎn)細胞因亮氨酸合成不足而生長受到抑制，高產(chǎn)細胞因為可以合成更多的亮氨酸而更加具有生長優(yōu)勢。應用該細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)后，游離脂肪酸產(chǎn)量提升了5 倍。雖然該細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)能提升生物合成效率，且避免抗生素的使用，但是該系統(tǒng)在有效工作前需要進行適當?shù)母脑煲允咕瓿蔀榱涟彼崛毕菪?，且培養(yǎng)基中亮氨酸的存在也會導致亞群調(diào)控系統(tǒng)失效。

2018 年，Rugbjerga 等［25］利用胞內(nèi)必需過程，開發(fā)了更加具有優(yōu)勢的細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)。該系統(tǒng)利用生物傳感器調(diào)控必需基因表達，避免了抗生素的使用，又解決了培養(yǎng)基和宿主受限的問題。在工業(yè)發(fā)酵后期，改造的細胞工廠合成能力常常降低或者完全喪失，一個重要原因是非生產(chǎn)細胞亞群存在［24，26-27］。因此，該系統(tǒng)利用正向響應甲羥戊酸的生物傳感器調(diào)控必需基因的表達，從而來懲罰發(fā)酵過程中的非生產(chǎn)亞群。因為控制細胞生長可能會給細胞帶來一些適應成本［28-29］，這可能會降低生物合成效率，所以該系統(tǒng)在選擇必需過程時避開了轉錄、翻譯和葡萄糖代謝等必需過程，并替換了調(diào)控必需基因的啟動子和核糖體結合位點（RBS），以優(yōu)化細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)。最終，改造的細胞工廠可以維持高產(chǎn)甲羥戊酸狀態(tài)直至細胞傳代95 次，而沒有進行亞群調(diào)控的菌株在傳代50 次以后甲羥戊酸合成能力逐步喪失。

2 目前已開發(fā)的細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)存在的 問題

目前已開發(fā)的細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)都是基于響應目標產(chǎn)物的生物傳感器構建的，因此只能應用于有特異性響應目標產(chǎn)物的生物傳感器存在的生物合成途徑。隨著合成生物學和生物信息學的發(fā)展，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多能夠響應不同種類的小分子代謝物的蛋白質(zhì)或者RNA 元件（如轉錄調(diào)控因子、核酸適配體等），響應的小分子代謝物涵蓋氨基酸、糖磷酸酯、脂類和糖類等，且在此基礎之上，已成功開發(fā)了許多不同的生物傳感器［30-33］，但是在實際應用中，仍然存在缺少天然響應或者特異性響應目標代謝產(chǎn)物的生物傳感器的問題［34-35］，這嚴重限制了細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)的可擴展性。除此之外，目前的細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)都是利用生物傳感器直接感知目標產(chǎn)物濃度的變化，利用合成遺傳回路富集高產(chǎn)細胞亞群，應用于不同目標產(chǎn)物的生物合成時需要構建不同的生物傳感器，增加了細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)應用的復 雜性。

自發(fā)突變和負擔是限制很多改造的細胞工廠應用的主要因素［17］。目前已開發(fā)的細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)利用基于正向響應產(chǎn)物的轉錄調(diào)控因子的生物傳感器控制細胞生長，這可能會給細胞帶來一些生長負擔，增加細胞的適應成本［28-29］，從而降低生物合成效率。在基于生物傳感器調(diào)控抗生素抗性基因和必需基因表達的細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)中，研究者們采用抗生素濃度和添加時間優(yōu)化、調(diào)控必需基因表達的啟動子和RBS 替換優(yōu)化細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)。優(yōu)化后的細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)可以使低產(chǎn)或者非生產(chǎn)細胞亞群的生長受到抑制，而高產(chǎn)或者生產(chǎn)細胞亞群能維持與野生型細胞幾乎一致的生長［24-25］，一方面減少了因off 狀態(tài)的泄露導致的低產(chǎn)或者非生產(chǎn)細胞亞群逃逸；另一方面避免引入細胞亞群調(diào)控形成負擔而降低生物合成效率。但是上述研究未充分考慮到可遺傳突變對細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)的影響。由于同源重組、非同源重組、轉座元件、質(zhì)粒不穩(wěn)定和胞內(nèi)外環(huán)境壓力等因素存在，不論是經(jīng)過改造的工程菌還是未經(jīng)改造的野生型菌株都以10-2-10-10/bp/代的突變速率經(jīng)歷著持續(xù)進化［17］。而在細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)中，生物傳感器部分轉錄調(diào)控因子因自身突變或轉錄調(diào)控因子的結合位點突變而不能結合到其調(diào)控的啟動子上，或者調(diào)控轉錄調(diào)控因子表達的啟動子因突變而不能有效轉錄（圖2）等均可能引起細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)中調(diào)控生長的基因持續(xù)表達，造成非生產(chǎn)細胞亞群或者低產(chǎn)細胞亞群逃逸。逃逸的低產(chǎn)細胞亞群在發(fā)酵過程中逐步取代因高產(chǎn)失去一定生長優(yōu)勢的高產(chǎn)細胞亞群，從而使細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)失效。因此，細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)很有可能因可遺傳突變引起低產(chǎn)或者非生產(chǎn)細胞亞群逃逸而失效。

圖2 可遺傳突變引起細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)失效

3 目前已開發(fā)的細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)存在問題的解決策略

目前已開發(fā)的細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)依賴于生物傳感器，其使用受到可用的生物傳感器限制，因此擴展生物傳感器的特異性可以擴展細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)到更多的生物合成途徑。結合化學信息學分析、基于轉錄組的生物信息學分析等，目前已成功鑒定響應多種人們高度感興趣的目標代謝產(chǎn)物的蛋白質(zhì)元件，如內(nèi)酰胺［36］、苯丙氨酸［37］和正丁醇［38］等，以及它們調(diào)控的啟動子，且在此基礎上開發(fā)了不同的生物傳感器。除了基于蛋白質(zhì)元件之外的生物傳感器，目前也有一些基于RNA 元件的生物傳感器，這類傳感器因不需要翻譯成蛋白質(zhì)，給細胞造成的負擔小而備受關注。經(jīng)典的SELEX［30］、最近開發(fā)的RNA Capture-SELEX［39］、結合下一代測序技術的染色質(zhì)免疫沉淀法（ChIP-Seq）以及一種原核生物和真核生物均適用的基因組范圍內(nèi)鑒定天然RNA 適配體的方法（PARCEL）［40］等都可用于篩選鑒定新的響應目標代謝產(chǎn)物的RNA 元件，進一步擴展生物傳感器的特異性。在實際應用中，天然響應目標產(chǎn)物的RNA 或者蛋白質(zhì)元件不一定存在。因此，改造已存在的生物傳感器的特異性不失為一種有效方法。目前已有綜述討論了如何利用隨機突變、結構域組裝、計算機輔助設計等技術改變已存在的生物傳感器的特異性，擴展其應用范圍［34，41］，所以這里將不再贅述。除了開發(fā)響應小分子代謝物的生物傳感器，目前已有感知胞內(nèi)負擔［42-43］或者代謝通量變化［44］等而非特定目標代謝物的生物傳感器，基于此設計合理的遺傳回路，也許可以富集低負擔或者低耗細胞亞群，從而提升產(chǎn)物合成的綜合效率；且這類合成遺傳回路在應用于不同目標產(chǎn)物的生物合成時，可能不需要構建不同的生物傳感器，從而簡化細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)的擴展應用。但基于這類傳感器的細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)的效果還需要實驗驗證。

在細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)中，由于自發(fā)突變存在，細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)很有可能因可遺傳突變引起低產(chǎn)或者非生產(chǎn)細胞亞群逃逸而失效。目前已有綜述總結了通用的降低宿主自發(fā)突變率，增加改造的細胞工廠的遺傳穩(wěn)定性的策略，如敲除用于轉座的插入序列、敲除或者替換低保真性的DNA 聚合酶編碼基因和敲除與同源重組相關的基因，避免使用短的重復序列和高度相似的序列等［17］。因此，本文重點關注如何重構和優(yōu)化細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)減少低產(chǎn)細胞亞群逃逸。可能有效減少低產(chǎn)細胞亞群逃逸的策略包括增加響應靶信號的蛋白質(zhì)或者RNA 元件的拷貝數(shù)［45］、串聯(lián)增加這些響應元件的結合位點數(shù)和構建單輸入多輸出遺傳回路［46］等。當增加生物傳感器部分能響應靶信號元件的拷貝數(shù)或者這些響應元件的結合位點數(shù)時，其中一個拷貝或者一個結合位點突變后還有其它的可發(fā)揮作用；用生物傳感器以單順反子形式調(diào)控兩個或者多個不同的控制生長的基因的表達，形成單輸入多輸出遺傳回路，這時只有調(diào)控生長的基因前的啟動子都發(fā)生突變，低產(chǎn)細胞亞群或者非生產(chǎn)細胞亞群才會逃逸。

4 總結與展望

單細胞檢測技術的發(fā)展幫助揭示了細胞亞群的存在，低產(chǎn)細胞亞群和非生產(chǎn)細胞亞群會降低產(chǎn)物合成的綜合效率。細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)結合“獎勵-懲罰”規(guī)則，利用正向響應產(chǎn)物濃度的生物傳感器將產(chǎn)物合成與細胞生長關聯(lián)起來，賦予高產(chǎn)細胞亞群生長優(yōu)勢，有效提升了生物合成效率。

基于響應不同目標代謝物的新型生物傳感器構建的細胞亞群調(diào)控應用范圍拓展，基于感知胞內(nèi)負擔或者代謝通量變化等富集低負擔或者低耗細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)設計與構建將會成為細胞亞群調(diào)控的新趨勢。另外，降低宿主的可遺傳突變率、重構和優(yōu)化亞群調(diào)控系統(tǒng)以減少低產(chǎn)細胞亞群或者非生產(chǎn)細胞亞群逃逸，有利于細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)高效提升生物合成效率。綜上，作為細胞代謝調(diào)控新工具的細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)將受到越來越多的關注，設計構建更優(yōu)的細胞亞群調(diào)控系統(tǒng)將成為新的發(fā)展趨勢。