葛靜，何燕南

天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300112

卵巢癌作為臨床婦產(chǎn)科較為常見的疾病之一，其發(fā)病原因與遺傳、內(nèi)分泌因素等存在密切相關(guān)性。疼痛、月經(jīng)不調(diào)以及消瘦等是卵巢癌的主要臨床表現(xiàn)，部分患者還會(huì)伴有腹部包塊以及腹腔積液等病癥[1，2]。該病若不及時(shí)進(jìn)行治療，可擴(kuò)散到子宮等重要器官，嚴(yán)重者可危及卵巢癌患者生命。近年來，隨著社會(huì)生活習(xí)慣的改變，卵巢癌的發(fā)病率及其病死率呈現(xiàn)逐年遞增趨勢[3]。因此，積極尋求一種有效治療卵巢癌的方式尤為重要。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為卵巢癌屬“癥瘕”、“積聚”等范疇，病因多為自身正氣虛羸，加之外感風(fēng)寒，內(nèi)傷食滯，進(jìn)而導(dǎo)致水谷不化、痰濁內(nèi)生、濕熱蘊(yùn)結(jié)、脈絡(luò)瘀阻，遷延日久，漸成癥瘕，故以養(yǎng)血散寒、溫陽化瘀、散結(jié)抑瘤為治療原則[4，5]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有整體性、系統(tǒng)性特點(diǎn)，與中藥辨證論治具有較高的契合度[6，7]。中藥生姜具有解表散寒、開痰以及抗腫瘤之功效?；诖耍狙芯繑M通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對生姜的有效活性成分及其靶基因進(jìn)行預(yù)測，為臨床進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 篩選生姜主要活性成分及靶基因 通過網(wǎng)頁(TSMP)對生姜的活性成分及其靶基因進(jìn)行篩選。篩選生姜活性成分選用兩個(gè)指標(biāo)，即口服生物利用度(OB)以及類藥性(DL)，其中生姜活性成分篩選標(biāo)準(zhǔn)為：OB>30% 且DL>0.18；之后對篩選出的主要活性成分通過TSMP進(jìn)行相關(guān)靶基因預(yù)測。

1.2 預(yù)測作用于卵巢癌潛在的靶點(diǎn)基因 借助genecard 數(shù)據(jù)庫預(yù)測可能作用于卵巢癌的靶基因，與此同時(shí)通過TCGA數(shù)據(jù)庫中篩選出卵巢癌具有高表達(dá)的基因，進(jìn)而獲得所有已知與卵巢癌相關(guān)的基因靶點(diǎn)。

1.3 繪制韋恩圖 為明確卵巢癌相關(guān)靶基因與中藥生姜潛在靶基因之間的相互作用，將TSMP所預(yù)測靶基因、genecard 數(shù)據(jù)庫預(yù)測的可能作用于卵巢癌的靶基因以及TCGA數(shù)據(jù)庫中篩選出卵巢癌中具有高表達(dá)的基因進(jìn)行交集，并使用R軟件包limma繪制韋恩圖。

1.4 構(gòu)建生姜-卵巢癌靶基因網(wǎng)絡(luò) 將預(yù)測到的生姜作用于卵巢癌的主要活性成分，以及篩選出卵巢癌中具有高表達(dá)的交集靶基因和卵巢癌進(jìn)行構(gòu)建，即形成生姜成分-交集靶基因-卵巢癌調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.5 驗(yàn)證預(yù)測基因及對目標(biāo)靶基因進(jìn)行生存分析 應(yīng)用GEO的數(shù)據(jù)集對其目標(biāo)靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。首先下載卵巢癌的數(shù)據(jù)集GSE26712(185個(gè)卵巢癌組織、10個(gè)癌旁組織)，然后做盒型圖，最后將其結(jié)果與正常組織進(jìn)行對比分析。目標(biāo)靶基因表達(dá)驗(yàn)證之后，利用KM在線數(shù)據(jù)庫評估目標(biāo)靶點(diǎn)基因?qū)β殉舶┑挠绊憽?/p>

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以個(gè)數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生姜活性成分及靶基因 本研究通過TSMP數(shù)據(jù)庫總共篩選出中藥生姜的5種活性成分，分別為Dihydrocapsaicin、6-methylgingediacetate2、Poriferast-5-en-3beta-ol、Beta-sitosterol、Stigmasterol。對上述5中活性成分分別通過TSMP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，得出2個(gè)主要活性成分具有靶點(diǎn)基因：即MOL000358(Beta-sitosterol)和MOL000449(Stigmasterol)，總共篩選出166個(gè)靶點(diǎn)基因。生姜活性成分篩選情況如表1。

2.2 卵巢癌潛在靶基因 通過genecard 數(shù)據(jù)共預(yù)測篩選出可能作用卵巢癌的靶基因，總共為6 892個(gè)；之后利用TCGA數(shù)據(jù)庫中篩選出卵巢癌中具有高表達(dá)的靶基因，總共為200個(gè)。

表1 生姜活性成分的篩選情況

2.3 生姜成分-卵巢癌靶點(diǎn)基因韋恩圖 將生姜成分靶點(diǎn)基因、TCGA卵巢癌差異基因以及Gene cards卵巢癌靶點(diǎn)基因應(yīng)用R軟件包limma繪制韋恩圖，總共獲得交集靶點(diǎn)基因4個(gè)， 即CLDN3、CLDN4、FOLR、MSLN。如圖1。

圖1 生姜成分-卵巢癌靶點(diǎn)基因韋恩圖

2.4 生姜成分-卵巢癌目標(biāo)靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò) 將上述篩選出生姜2個(gè)活性成分和交集靶基因以及卵巢癌靶點(diǎn)基因進(jìn)行共同構(gòu)建：得出生姜成分-交集靶基因-卵巢癌基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。如圖2。

圖2 生姜成分-卵巢癌靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.5 目標(biāo)靶點(diǎn)基因驗(yàn)證結(jié)果 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建后，對所預(yù)測的靶點(diǎn)基因應(yīng)用GEO的數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗(yàn)證(是否在卵巢癌中高表達(dá))。下載卵巢癌的數(shù)據(jù)集GSE26712(185個(gè)卵巢癌組織、10個(gè)癌旁組織)并做盒型圖，其結(jié)果顯示與正常組織相比，網(wǎng)絡(luò)中的靶點(diǎn)基因(CLDN3、CLDN4、FOLR、MSLN)在卵巢癌組織表達(dá)顯著增高，且組間對比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。如圖3。

圖3 目標(biāo)靶點(diǎn)基因的驗(yàn)證

2.6 目標(biāo)靶點(diǎn)基因的生存預(yù)后結(jié)果 目標(biāo)靶點(diǎn)基因驗(yàn)證后，對所驗(yàn)證的靶點(diǎn)基因應(yīng)用KM在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行評估(是否能影響卵巢癌患者的生存預(yù)后)。其結(jié)果顯示網(wǎng)絡(luò)中的目標(biāo)靶點(diǎn)基因(CLDN3、CLDN4、FOLR、MSLN)均可影響卵巢癌患者的生存預(yù)后(P<0.05)。如圖4。

3 討論

卵巢癌早期診斷困難，且易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，若不及時(shí)進(jìn)行治療，不僅影響患者的生活質(zhì)量，嚴(yán)重者甚至危及患者生命[8,9]。中醫(yī)學(xué)上卵巢癌的臨床表現(xiàn)見于 “癥瘕”、“石瘕”等病證之中，其發(fā)病機(jī)理主要為血虛寒凝、痰濕瘀結(jié)，與厥陰肝寒存在密切聯(lián)系。肝經(jīng)循行之處是卵巢癌的發(fā)生部位，以肝為先天，經(jīng)、帶、胎、產(chǎn)數(shù)傷于血，加之素體陽虛，寒濕內(nèi)生，濕聚為痰，痰阻氣機(jī)，日久寒凝濕滯，痰瘀痹阻胞脈，結(jié)聚卵巢，進(jìn)而發(fā)病[10～12]。目前，化療常常作為臨床治療卵巢癌的首選治療方式。盡管隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展以及化療的逐步規(guī)范，其不良反應(yīng)呈現(xiàn)逐漸降低趨勢，但卵巢癌總體生存率并無明顯提高。因此，研究新的卵巢癌靶向治療藥物十分必要[13]。

圖4 目標(biāo)靶點(diǎn)基因的生存預(yù)后結(jié)果

中藥材生姜可藥食兩用，具有發(fā)汗解表、溫中止嘔、溫肺止咳、解藥毒的作用[14]。生姜味辛、微溫，經(jīng)五臟除風(fēng)邪寒熱，止咳吐，去痰下氣。生姜的辛辣主要體現(xiàn)在姜辣素，姜辣素主要包括姜酚以及姜烯酚等成分，其中姜酚類是其主要活性成分[15,16]。有報(bào)道顯示，姜酚類化合物的主要生物活性具有抗腫瘤以及抗氧化、抗炎等功效[17]。雖然對生姜的各主要活性成分的藥理學(xué)作用已基本明確，但是治療卵巢癌的確切靶點(diǎn)卻少有報(bào)道。

為了研究生姜治療卵巢癌的作用靶點(diǎn)，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法[18]，通過TSMP數(shù)據(jù)庫研究篩選生姜的有效活性成分及其相關(guān)靶點(diǎn)基因，同時(shí)構(gòu)建生姜活性成分-目標(biāo)靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)；并借助其主要活性成分-潛在靶點(diǎn)基因之間的互作網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而分析探究生姜治療卵巢癌的作用機(jī)制。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法我們發(fā)現(xiàn)，生姜中總共有5種活性成分，即Dihydrocapsaicin、6-methylgingediacetate2、Poriferast-5-en-3beta-ol、Beta-sitosterol、Stigmasterol，最終得出2種主要活性成分即Beta-sitosterol、Stigmasterol具有靶點(diǎn)基因，這可能是其抗卵巢癌的物質(zhì)基礎(chǔ)。與Beta-sitosterol、Stigmasterol密切相關(guān)的潛在靶點(diǎn)基因總共為166個(gè)，通過genecard 數(shù)據(jù)庫總共篩選出可能作用卵巢癌的靶基因6 892個(gè)，并利用TCGA數(shù)據(jù)庫中篩選出卵巢癌中具有高表達(dá)的靶基因200個(gè)。為明確卵巢癌相關(guān)靶基因與中藥生姜潛在靶基因之間的相互作用，我們將TSMP預(yù)測的靶基因、genecard 數(shù)據(jù)庫預(yù)測的可能作用于卵巢癌的靶基因以及TCGA數(shù)據(jù)庫中篩選出的卵巢癌中具有高表達(dá)的基因采取R軟件包limma繪制韋恩圖，得出其交集基靶因；之后通過對調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分析，我們發(fā)現(xiàn)CLDN3、CLDN4、FOLR、MSLN可能是生姜抗卵巢癌中較為核心的干預(yù)靶點(diǎn)基因。網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建后，我們對所預(yù)測的靶點(diǎn)基因應(yīng)用GEO的數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗(yàn)證，其結(jié)果顯示與正常組織相比，網(wǎng)絡(luò)中的靶點(diǎn)基因(CLDN3、CLDN4、FOLR、MSLN)在卵巢癌組織表達(dá)顯著增高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在目標(biāo)靶點(diǎn)基因的驗(yàn)證后，我們對所驗(yàn)證的靶點(diǎn)基因應(yīng)用KM在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行評估，其結(jié)果顯示網(wǎng)絡(luò)中的目標(biāo)靶點(diǎn)基因(CLDN3、CLDN4、FOLR、MSLN)均可影響卵巢癌患者的生存預(yù)后。這進(jìn)一步印證了之前的分析結(jié)果，生姜可干預(yù)多個(gè)與卵巢癌密切相關(guān)的基因靶點(diǎn)的表達(dá)。