丁葵英，許文娟，郭禮強，田國寧， 宮小明

（濰坊出入境檢驗檢疫局，山東 濰坊 261041）

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蔥屬蔬菜中的噻蟲嗪、多菌靈等5種農(nóng)藥的殘留量

丁葵英，許文娟，郭禮強，田國寧， 宮小明

（濰坊出入境檢驗檢疫局，山東 濰坊 261041）

建立了蔥屬蔬菜（洋蔥、大蔥和韭菜）中噻蟲嗪、噻蟲胺、吡蟲啉、多菌靈和蟲酰肼5種藥物殘留量的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法 （LC-MS/MS）檢測方法。樣品用正己烷飽和的乙腈提取，用QuEChERS方法凈化，在正離子模式（ESI+）下，經(jīng)分時段多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式測定目標化合物，外標法定量。結(jié)果表明：5種農(nóng)藥在10～200μg/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系較好（r2＞0.99）；在5、10、50μg/kg 3個添加水平下，平均回收率在77.3%～104.1%之間；5種農(nóng)藥的定量限（LOQ）均滿足國際限量要求。該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好、定量準確，可用于蔥屬蔬菜中上述5種農(nóng)藥殘留的日常檢測。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；蔥屬蔬菜；農(nóng)藥殘留

吡蟲啉（imidacloprid）和噻蟲嗪及其代謝物噻蟲胺為第二代煙堿類廣譜殺蟲劑，具有良好的胃毒、觸殺活性、強內(nèi)吸傳導(dǎo)性和滲透性，對多種蔬菜中的害蟲有效［1］；多菌靈（carbendazim）是一種苯并咪唑類殺菌劑，在防治病蟲害方面具有高效、低毒、廣譜、內(nèi)吸性等特點，但其殘效期長［2］；蟲酰肼（tebufenozide）是美國羅姆-哈斯公司在抑制食肼基礎(chǔ)上開發(fā)的昆蟲生長調(diào)節(jié)劑［3］。5種農(nóng)藥作為殺菌、殺蟲劑和昆蟲生長調(diào)節(jié)劑在蔥屬蔬菜上應(yīng)用十分廣泛，但由于其殘留對人體存在危害，我國及主要貿(mào)易國家和地區(qū)已經(jīng)制定了其在蔬菜中的最高殘留限量標準［4］。因此，為了保障蔥屬產(chǎn)品安全和出口經(jīng)濟的發(fā)展，建立這5種農(nóng)藥殘留的高效、準確的分析方法具有重要意義。

目前，關(guān)于蔬菜中多菌靈、蟲酰肼、吡蟲啉和噻蟲嗪及代謝物噻蟲胺殘留量的單樣檢測方法較多的是高效液相色譜法［6-7］，雖然高效液相色譜法在分析農(nóng)獸藥殘留中具有較好的效果［8］，但隨著農(nóng)藥殘留限量要求越來越低，高效液相色譜法在靈敏度、定量限等多方面越來越不能滿足要求。同時，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法在農(nóng)殘檢測中的應(yīng)用越來越普遍，蔬菜中上述5種農(nóng)藥殘留的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法也分別有報道［9-12］，但未見采用此種方法同時測定該5種化合物的報道。蔥屬蔬菜（青蔥、大蔥、洋蔥等）是一類較為特殊的蔬菜，含有大量不易除去的雜質(zhì)，干擾農(nóng)藥殘留測定結(jié)果。液-質(zhì)聯(lián)用作為確證檢測方法，其準確度和靈敏度較高，能很好的去除基質(zhì)干擾。因此，作者采用QuEChERS方法進行樣品凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定性和定量分析。該方法操作簡單、靈敏度高、定量限低，能滿足國內(nèi)外對這5種農(nóng)藥的限量要求，可有效保障蔥屬蔬菜及其制品的安全，促進對外經(jīng)濟貿(mào)易的發(fā)展。

1　材料與方法

1.1試劑和儀器

乙腈（色譜純）：美國Fisher公司產(chǎn)品；正己烷（色譜純）：德國Mer產(chǎn)品）；甲酸（色譜純）：美國Tedia產(chǎn)品；氨水（分析純）：天津科密歐產(chǎn)品；無水硫酸鎂 （分析純）：天津市光復(fù)精細化工研究所產(chǎn)品，用前在500℃馬弗爐內(nèi)烘5 h，200℃時取出冷卻備用）；中性氧化鋁：上海五四化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，石墨炭黑粉、C18和氨丙基粉均購于Agela technologies inc公司。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（Agilent 6430），配有電噴霧離子源：美國Agilent公司產(chǎn)品；冷凍離心機5810R：德國Eppendof公司產(chǎn)品。

1.2實驗方法

1.2.1標準溶液的配制標準儲備液 （100 mg/L）：準確稱取10 mg（精確至0.01 mg）噻蟲嗪、噻蟲胺、吡蟲啉、多菌靈和蟲酰肼固體標準品，分別置于10 mL小燒杯中，用乙腈溶解后轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，定容至刻度線，存儲期6個月。

中間工作液：取上述各標準儲備液1mL于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，存儲期3個月，使用時用乙腈逐級稀釋成所需濃度的工作液。

1.2.2樣品前處理樣品先經(jīng)撕片（洋蔥）或者切段（大蔥、青蔥和韭菜）后混合均勻，再取出部分有代表性的樣品，縮分不少于500 g試樣，裝入清潔容器內(nèi)，加封后標明標記。準確稱取30.00 g（精確到0.01 g）樣品，微波消解（中火，70 s）后轉(zhuǎn)移至100 mL塑料離心管中，加入6 g無水硫酸鎂，然后加入15 mL正己烷飽和的乙腈，于均質(zhì)機上高速均質(zhì)2min，離心，取上清液3mL于盛有混合粉末（50 mg石墨炭黑粉、200 mg C18和150 mg PSA粉）的10 mL玻璃試管中，渦旋混合2 min，靜止分層后取上清液2 mL于另一干凈玻璃試管中，氮氣吹干后，用1 mL 20∶80的乙腈：水溶解，用1 mL注射器吸取上述溶液過0.22μm的針頭過濾器于進樣小瓶中待上機測定。

1.3LC-MS/MS條件

1.3.1LC條件色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18 （100mm×2.1mm，3.5μm）；柱溫：40℃，進樣量5 μL；流動相A：0.1%甲酸水；流動相B：乙腈；梯度洗脫程序：0.0～3.0 min，35.0%～75.0%B；3.0～6.0 min，75%B；6.1～10min，35%B。流速為0.3mL/min，運行時間10min。

1.3.2MS/MS條件離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子（ESI＋）模式掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式掃描；毛細管電壓：4 000 v；干燥器流速：10 L/min；溫度300℃。

2　結(jié)果與討論

2.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化

實驗采用1.0 mg/L的5種化合物的混合標準溶液在正離子模式下進行母離子全掃描，選擇豐度最大的離子作為母離子，確定其分子離子，5種化合物的母離子掃描如圖1所示。

由圖1可知：5種物質(zhì)進入一級質(zhì)譜后，產(chǎn)生帶電荷的離子，質(zhì)譜圖上m/z呈現(xiàn)：192.0，249.8，255.9，292.1，353.0，根據(jù)其相對分子質(zhì)量，確定多菌靈、噻蟲胺、吡蟲啉、噻蟲嗪、和蟲酰肼母離子分別為：192.0，249.8，255.9，292.1，353.0，并通過優(yōu)化毛細管出口電壓，使母離子強度最大。在優(yōu)化所得各分子離子毛細管出口電壓條件下，分別以這些離子作為母離子，對其進行全掃描，帶電荷的母離子進入二級質(zhì)譜后，發(fā)生斷裂或重排等反應(yīng)產(chǎn)生不同的碎片離子，選擇豐度較大、干擾較少的兩個碎片離子作為定性和定量離子，其中豐度較高的作為定量離子，優(yōu)化各碎片離子的碰撞電壓，使每種化合物的碎片離子強度達到最大，最終確定的各化合物的參數(shù)見表1。

圖1　5種化合物的母離子掃描圖Fig.1　Productor scan spectra of 5 compounds

2.2色譜條件的優(yōu)化

流動相采用乙腈和體積分數(shù)0.1%的甲酸水，在流動相中加入甲酸，可以為目標化合物提供必需的質(zhì)子來源，提高離子化效率。用梯度洗脫，不但能提高各化合物的分離度和出峰時間，同時能對儀器進行充分的沖洗，減少儀器干擾，延長其使用壽命。采用表1所示的梯度洗脫，可將5種目標化合物很好的分離，目標化合物混合標準溶液（10.0μg/L）的總離子流圖（TIC）和提取離子色譜圖見圖2。

2.3前處理條件的優(yōu)化

提取溶劑不僅影響目標化合物的測定結(jié)果，同時對于減少樣品雜質(zhì)對儀器的污染也很重要。蟲酰肼、噻蟲嗪、噻蟲胺和吡蟲啉是極性較高的農(nóng)藥，極易溶于甲醇和乙腈；多菌靈不溶于水，所以不考慮使用含水試劑。作者在陰性大蔥樣品上添加10、20 μg/kg的混合標準溶液，對比了乙腈和正己烷飽和的乙腈作為提取溶劑的提取效果，結(jié)果表明正己烷飽和的乙腈對各化合物的提取效率遠高于乙腈，其中噻蟲胺和蟲酰肼兩種農(nóng)藥，提取效率提高了20%左右，多菌靈、噻蟲嗪和吡蟲啉提高10%。所以，作者選擇正己烷飽和的乙腈作為提取試劑，由于提取試劑中加入正己烷降低了基質(zhì)提取液中的水含量，降低了后續(xù)除水的壓力，從而提高了目標化合物的提取效率［13］。

圖2　5種農(nóng)藥混合標準溶液的總離子流圖Fig.2　Total ion current chromatogram of the m ixedstandard of five pesticides

作者采用了正己烷飽和的乙腈去除提取液中的脂類非極性雜質(zhì)，由于蔥屬蔬菜基質(zhì)較復(fù)雜，提取液中還含有其它共萃取雜質(zhì)干擾檢測，并對儀器產(chǎn)生一定的污染，因此需要進一步凈化處理。在微波消解后，加入6 g無水MgSO4除去基質(zhì)中的水分，降低上機前的壓力，提取后采用改進的QuEChERS方法凈化，該凈化方法中石墨炭黑粉能很好的去除蔬菜中的色素；C18能去除樣品中的油脂、膽固醇、維生素和其他非極性干擾物；PSA具有較強的離子交換能力，能從樣品中吸附極性物質(zhì)，去除樣品中有機酸、色素、金屬離子和酚類，起到凈化的作用，尤其是對于蔥、蒜等物質(zhì)必須通過此步驟先除去部分強極性雜質(zhì)，同時，根據(jù)粉末對目標化合物的吸附，最終確定的凈化粉為：50 mg石墨炭黑粉、200 mg C18和150mg PSA粉。

2.4基質(zhì)效應(yīng)、線性關(guān)系、檢出限和定量限

大氣壓噴霧電離離子源質(zhì)譜分析基質(zhì)效應(yīng)較為明顯，從而影響樣品檢測的準確性和重現(xiàn)性，采用對比基質(zhì)標準曲線與純?nèi)軇藴是€斜率的比值來考察基質(zhì)效應(yīng)的影響。

配制濃度范圍為10～200μg/L的系列基質(zhì)標準工作溶液和純?nèi)軇藴嗜芤哼M行同時測定，其質(zhì)量濃度為10、20、40、80、120、200μg/L，分別繪制標準曲線，通過計算基質(zhì)校準曲線斜率與純?nèi)軇藴是€斜率的比值來考察方法的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：多菌靈的斜率比值為0.56；噻蟲嗪的斜率比值為0.89；噻蟲胺的斜率比值為0.98；吡蟲啉的斜率比值為0.93；蟲酰肼的斜率比值為0.62。上述數(shù)據(jù)表明：吡蟲啉、噻蟲嗪和噻蟲胺3種化合物基質(zhì)效應(yīng)相對較弱，而多菌靈和蟲酰肼的基質(zhì)效應(yīng)較強，這可能與分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。實驗中雖嘗試改善樣品處理方法來減少基質(zhì)效應(yīng)，但基質(zhì)效應(yīng)都不能完全消除，因此采用陰性基質(zhì)標準溶液進行定量分析。

5種待測物在陰性洋蔥基質(zhì)中的標準曲線，在10～200μg/L范圍內(nèi)線性較好，線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量限見表2，以信噪比 （S/N）＞10確定定量限（LOQ），結(jié)果表明：多菌靈和蟲酰肼響應(yīng)值較高，其定量限（LOQ）較低，分別為0.5、1.0μg/kg；吡蟲啉、噻蟲胺和噻蟲嗪的響應(yīng)值相對較低，定量限分別為5.0、5.0、2.5μg/kg。結(jié)果見表1。

表1　5種目標化合物的基質(zhì)標準曲線、相關(guān)系數(shù)和定量限Table 1　Linear equations，correlation coefficients and LOQs of the five pesticides

2.5方法的回收率、精密度和重復(fù)性

綜合考慮各農(nóng)藥的定量限，在陰性洋蔥樣品中添加5、10、50μg/kg 3個水平的工作液進行回收率和精密度實驗，重復(fù)測定6次，采用基質(zhì)標準計算回收率和相對標準偏差，如表2所示。結(jié)果表明，5種農(nóng)藥在3個添加水平下，其平均回收率均在77.3%～104.1%之間，相對標準偏差小于10%，說明該方法具有較好的準確性和重復(fù)性。

表2　3個添加水平下5種農(nóng)藥的平均回收率和相對標準偏差（RSD）Table 2　Recoveries and RSDs of the five pesticides in three spiked levels　%

2.6實際樣品檢測

按相同的樣品處理方法對企業(yè)報檢的一批洋蔥樣品共24個，進行了提取、凈化，在相同的色譜條件下進行5種藥物殘留量的檢測。結(jié)果，檢出噻蟲嗪陽性樣品一個，其含量為110μg/kg，其他樣品中5種藥物殘留均未檢出。

3　結(jié)語

研究了基質(zhì)較為復(fù)雜的蔥屬蔬菜中的噻蟲嗪、噻蟲胺、吡蟲啉、蟲酰肼和多菌靈的殘留量檢測方法，對樣品進行了提取、凈化，優(yōu)化了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測條件，實現(xiàn)了5種農(nóng)藥同時檢測，方法回收率在77.3%～104.1%之間，相對標準偏差小于10%，靈敏度和準確性較高，定量限較低，滿足出口蔥屬蔬菜中5種農(nóng)藥的限量要求，適合蔥屬蔬菜中多種農(nóng)藥殘留的定性和定量分析。

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Determ ination of 5 Pesticide Residues in A llium Vegetables by Liquid Chromatography-Tandem M ass Spectrometry

DING Kuiying，XUWenjuan，GUO Liqiang，TIAN Guoning，GONG Xiaoming
（Weifang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Weifang 261041，China）

Amethod using liquid chromatography tandem massspectrometric（LC-MS/MS）for the analysis of thiamethoxam，carbendazim，clothianidin，im idacloprid and tebufenozid in allium vegetables was established.The target compounds were extracted by acetonitrile saturated w ith hexane and then purified w ith the QuEChERSmethod.Five different pesticideswere quantified by external standardmethod w ith determ ination in themode of electrospray positive ionization（ESI+）andmultiple reactionmonitoring（MRM）.The calibration curves of five pesticides displayed good linearityw ithin the concentration of 10 to 200μg/L and the squared correlation coefficients（r2）were larger than 0.99.The average recoveries ranged from 77.3%to 104.1%at three spiked levels of 5，10，50μg/kg.The lim its of quantitation（LOQs）for all samples met the international lim ited standard.Thismethod is sensitive and accurate w ith good reproducibility，which is suitable for the routineassay of the studied pesticide residues in allium vegetables.

liquid chromatography-tandem massspectrometric，allium vegetables，pesticide residues

S 482

A

1673—1689（2016）04—0424—05

2014-12-03

山東出入境檢驗檢疫局基金項目（SK201284，SK201420）。

丁葵英（1982—），女，山東荷澤人，理學(xué)碩士，工程師，主要從事農(nóng)獸藥殘留檢測。E-mail：dky818@163.com