王文彬，匡 華，徐麗廣，馬 偉，劉麗強(qiáng)，胥傳來(lái)

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122）

MALDI-TOF-MS鑒定3種水稻細(xì)菌的方法

王文彬，匡 華，徐麗廣，馬 偉，劉麗強(qiáng)，胥傳來(lái)*

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122）

用哥倫比亞培養(yǎng)基培養(yǎng)了水稻細(xì)菌性谷枯病菌（NCPPB 2391，NCPPB 3591）、水稻細(xì)菌性條斑病菌（NCPPB 1585）、水稻細(xì)菌性褐斑病菌（NCPPB 2844），菌落采用乙醇/甲酸處理法處理后用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）分析其蛋白質(zhì)指紋圖譜。除水稻細(xì)菌性條斑病菌無(wú)匹配結(jié)果外，其它2種細(xì)菌均有正確的鑒定結(jié)果。用Bruker公司標(biāo)準(zhǔn)方法建立了水稻細(xì)菌性條斑病菌蛋白質(zhì)指紋圖譜庫(kù)。采用水稻葉片作為空白樣品添加了上述3種植物病菌，回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3種植物病菌均可以用本方法檢測(cè)。該研究為應(yīng)用MALDI-TOF-MS方法檢測(cè)水稻細(xì)菌奠定了基礎(chǔ)。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜；水稻病菌；檢測(cè)

水稻是全球僅次于小麥的第二大糧食作物，也是中國(guó)最重要的糧食作物之一，水稻產(chǎn)量直接關(guān)系著中國(guó)的糧食安全。真菌、病毒或細(xì)菌引起的水稻病害輕者引起水稻減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致大片稻田顆粒無(wú)收［1］。水稻細(xì)菌性褐斑病是由丁香假單胞菌丁香致病變種（Pseudomonas syringae pv.syringae）引起的一種細(xì)菌性病害，病害在我國(guó)主要分布在東北水稻產(chǎn)區(qū)［2］。水稻細(xì)菌性條斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.Oryzicola）是引起水稻條斑病的水稻細(xì)菌，最先發(fā)現(xiàn)于廣東后來(lái)蔓延到湖南、江西、浙江、江蘇等南方稻區(qū)［3］。水稻細(xì)菌性谷枯病菌（Burkholderia glumae）是一種可引起苗期水稻秧苗腐爛、穗期水稻谷?？菟赖乃炯?xì)菌，主要分布于日本、越南，2007年已列入我國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄［4］。

目前水稻細(xì)菌性褐斑病還沒(méi)有國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法，檢測(cè)方法也未見(jiàn)報(bào)道。水稻細(xì)菌性條斑病菌和水稻細(xì)菌性谷枯病菌目前均有國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法，主要根據(jù)病株形態(tài)學(xué)特征，并采用分離培養(yǎng)、PCR（polymerase chain reaction）方 法 和 ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）方法結(jié)合生理生化以及菌株致病性進(jìn)行鑒定。廖曉蘭等建立了快速檢測(cè)水稻細(xì)菌性條斑病菌的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，該方法可以區(qū)分水稻白葉枯菌與水稻細(xì)菌性條斑病菌［5］。馮雯杰，張華分別建立了可以區(qū)分水稻白葉枯菌與水稻細(xì)菌性條斑病菌的水稻細(xì)菌性條斑病菌的常規(guī)PCR方法，成本相對(duì)較低，適合在種子檢疫站進(jìn)行推廣［6-7］。羅金燕等分別用常規(guī)PCR和免疫PCR檢測(cè)水稻細(xì)菌性谷枯病菌，發(fā)現(xiàn)兩種方法均可以特異性檢測(cè)水稻細(xì)菌性谷枯病菌，但免疫PCR可以檢測(cè)103cfu/ mL的菌懸液，靈敏度比常規(guī)PCR高兩個(gè)數(shù)量級(jí)［8］。莫瑾等設(shè)計(jì)了兩對(duì)水稻細(xì)菌性谷枯病菌的特異性引物，建立了雙重PCR檢測(cè)方法，提高了PCR檢測(cè)的特異性，準(zhǔn)確性和檢測(cè)靈敏度［9］。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrixassisted laser desorption ionization-time of flight massspectrometry，MALDI-TOF-MS）技術(shù)是一種軟電離新型生物質(zhì)譜，開(kāi)始被用來(lái)鑒定蛋白和多肽的相對(duì)分子質(zhì)量以及鑒定未知蛋白，后來(lái)在檢測(cè)疾病標(biāo)志物、微生物分類、臨床微生物診斷等方面都得到成功的應(yīng)用［10-12］。目前MALDI-TOF-MS已被廣泛報(bào)道用于檢測(cè)鑒定病原微生物，具有快速、重復(fù)性好的特點(diǎn)。作者報(bào)道了一種用MALDI-TOF-MS檢測(cè)水稻細(xì)菌性谷枯病菌、水稻細(xì)菌性條斑病菌、水稻細(xì)菌性條斑病菌的方法，為應(yīng)用MALDI-TOF-MS檢測(cè)其它水稻病菌奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株標(biāo)準(zhǔn)菌株：水稻細(xì)菌性谷枯病菌（Burkholderia glumae，NCPPB 2391），水稻細(xì)菌性谷枯病菌（Burkholderia glumae，NCPPB 3591），水稻細(xì)菌性條斑病菌 （Xanthomonas oryzae pv.Oryzicola，NCPPB 1585），丁香假單胞菌丁香致病變種（Pseudomonas syringae pv.syringae，NCPPB2844），均購(gòu)于英國(guó)NCPPB中心。

1.1.2培養(yǎng)基哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司。

1.1.3試劑無(wú)水乙醇：色譜純，購(gòu)自百靈威科技有限公司；甲酸（formic acid，F(xiàn)A）、乙腈（acetonitrile，ACN）：均為色譜純，購(gòu)于Sigma公司；基質(zhì) α-氰-4-羥基肉桂酸（α-Cyano-4-hydroxy-cinnamic acid，CHCA），校 準(zhǔn) 蛋 白 干 粉（proteincalibration standard）：購(gòu)自德國(guó)布魯克公司。水稻葉片、玉米葉片由湖南檢驗(yàn)檢疫局提供，白菜購(gòu)于本地超市。

1.1.4實(shí)驗(yàn)儀器基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（ultrafleXtreme MALDI-TOF），德國(guó)布魯克公司。生物安全柜，Thermo scientific。

1.2方法

1.2.1植物病菌的培養(yǎng)條件-80℃凍存的菌液在哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，28℃培養(yǎng)2～3 d，傳代2～3次。

1.2.2樣品處理與鑒定參考陳秀金的方法進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測(cè)。

1.2.3建立細(xì)菌MALDI-TOF指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)按照布魯克公司標(biāo)準(zhǔn)方法建立。

1.2.4樣品添加回收水稻葉片用適量滅菌的蒸餾水沖洗3次，再用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇浸泡3min，隨后用適量滅菌的蒸餾水浸泡洗滌，重復(fù)3次。取適量葉片于一次性平皿中，用一次性接種針將植物病菌接種到平皿中的葉片上。樣品處理按照GB/T 28078—2011—水稻白葉枯病菌、水稻細(xì)菌性條斑病菌檢疫鑒定方法中未顯癥的可疑組織的方法進(jìn)行。劃線后的平板按照1.2.1的方法培養(yǎng)，平板上可疑菌落采集后采用1.2.2的方法進(jìn)行處理和鑒定。

2　結(jié)果與討論

2.1植物病菌培養(yǎng)條件

哥倫比亞培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，目前用于培養(yǎng)植物病菌的報(bào)道比較少。本研究中的幾種植物病菌均采用哥倫比亞培養(yǎng)基培養(yǎng)效果不錯(cuò)，2～3 d可以長(zhǎng)出米粒大小的菌落。培養(yǎng)溫度，水稻細(xì)菌性谷枯病菌最適生長(zhǎng)溫度是30～35℃。水稻細(xì)菌性條斑病菌最適生長(zhǎng)溫度是28～30℃。丁香假單胞菌丁香致病變種，又稱水稻細(xì)菌性褐斑病，最適生長(zhǎng)溫度是25～30℃。因此，作者采用了28℃培養(yǎng)，在該溫度下3種植物病菌均可較好的生長(zhǎng)。

2.2植物病菌蛋白質(zhì)指紋圖譜的建立

用TFA法對(duì)培養(yǎng)的4株植物病菌進(jìn)行樣品處理并用MALDI-TOF-MS分析，其蛋白質(zhì)指紋圖譜如圖1～3所示。檢索Bio-Typer數(shù)據(jù)庫(kù)后4株菌的鑒定結(jié)果如表1所示。檢索Bio-Typer數(shù)據(jù)庫(kù)后，水稻細(xì)菌性谷枯病菌NCPPB 2391、水稻細(xì)菌性谷枯病菌NCPPB 3591和水稻細(xì)菌性褐斑病菌NCPPB 2844均有正確的匹配結(jié)果。鑒定結(jié)果如表1所示。水稻細(xì)菌性條斑病菌NCPPB 1585在數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有匹配結(jié)果，檢索后發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有該菌的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)。因此，按照布魯克公司標(biāo)準(zhǔn)方法建立了水稻細(xì)菌性條斑病菌NCPPB 1585的數(shù)據(jù)庫(kù)。

可信度得分在2.300到3.000之間的結(jié)果可鑒定到種；可信度得分在2.000到2.299之間的結(jié)果確定鑒定到屬，很可能是鑒定到種；得分在1.700到1.999之間的結(jié)果很可能可鑒定到屬。水稻細(xì)菌性谷枯病菌NCPPB 2391可信度得分低于水稻細(xì)菌性谷枯病菌NCPPB 3591但均有正確的匹配結(jié)果。Bio-Typer數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有水稻細(xì)菌性條斑病菌，因此作者采用布魯克公司的標(biāo)準(zhǔn)方法建立了水稻細(xì)菌性條斑病菌的數(shù)據(jù)。水稻細(xì)菌性褐斑病菌NCPPB 2844又稱丁香假單胞菌丁香致病變種鑒定結(jié)果為丁香假單胞菌，雖然沒(méi)有鑒定到丁香致病變種，但在種的水平上是正確的。

2.3樣品添加回收

圖1　水稻細(xì)菌性谷枯病菌NCPPB 2391（上），NCPPB 3591（下）的蛋白質(zhì)指紋圖譜Fig.1　Protein mass spectrometric profiles of Burkholderia glumae NCPPB 2391（up）and Burkholderia glumae NCPPB 3591（down）

為研究基質(zhì)影響和探索基于蛋白質(zhì)指紋圖譜的水稻病菌檢測(cè)方法，選擇用水稻葉片進(jìn)行了樣品添加實(shí)驗(yàn)。表2是各樣品的鑒定結(jié)果，由表可知4株植物病菌的添加樣品均可用該方法正確鑒定。

圖2　水稻細(xì)菌性條斑病菌NCPPB 1585的蛋白質(zhì)指紋圖譜Fig.2　Protein mass spectrometric profile of Xanthomonas oryzae pv.Oryzicola NCPPB 1585

圖3　丁香假單胞菌丁香致病變種NCPPB2844的蛋白質(zhì)指紋圖譜Fig.3　Protein mass spectrometric profile of Pseudomonas syringae pv.syringae NCPPB2844

表1　純培養(yǎng)菌株的M ALDI-TOF-MS指紋圖譜在Bio-Typer數(shù)據(jù)庫(kù)中的匹配結(jié)果Table 1　Matching results of pure cultures by MALDI-TOF-MS in Bio-Typer

表2　添加樣品中分離株的M ALDI-TOF-MS指紋圖譜在Bio-Typer數(shù)據(jù)庫(kù)中的匹配結(jié)果Table 2　M atching results of isolated colonies from spiked sam ples by MALDI-TOF-MS in Bio-Typer

3　結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)MALDI-TOF-MS技術(shù)已經(jīng)越來(lái)越多地用來(lái)檢測(cè)病原微生物，然而主要集中在沙門氏菌、單增李斯特菌等常見(jiàn)的食源性致病菌或者臨床上重要的致病菌，而應(yīng)用于檢測(cè)水稻細(xì)菌的報(bào)道還比較少見(jiàn)。目前檢測(cè)水稻細(xì)菌性條斑病菌、水稻細(xì)菌性谷枯病菌主要采用PCR擴(kuò)增細(xì)菌特異性片段進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度高、特異性好，但也存在著對(duì)操作人員技術(shù)要求高的特點(diǎn)。MALDI-TOF-MS檢測(cè)方法基于細(xì)菌全細(xì)胞蛋白質(zhì)的指紋圖譜，具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，因此相信隨著研究的深入，MALDI-TOF-MS將成為檢測(cè)水稻實(shí)際樣品中病原菌的有力工具。

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Identification of Three Rice Pathogens by MALDI-TOF-MS

WANGWenbin，KUANG Hua，XU Liguang，MAWei，LIU Liqiang，XU Chuanlai*
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

A fter Burkholderia glumae（NCPPB 2391，NCPPB 3591），Xanthomonas oryzae pv. Oryzicola（NCPPB 1585）and Pseudomonas syringae pv.Syringae（NCPPB2844）were cultured by Columbia agarmedium and bacterial colonies were treated w ith an ethanol-form ic acid extraction procedure，the protein fingerprints were obtained and analyzed by MALDI-TOF-MS.Three plant pathogenswere accurately identified except that Pseudomonas syringae pv.Syringae did notexist in the Bio-Typer.W ith the standard method from Bruker，we established the protein fingerprint of Pseudomonassyringae pv.syringae in Bio-Typer.For the rice leaf spiked w ith these rice pathogens，they could be detected using thismethod.This study shed lighton the detection of rice pathogensby MALDI-TOF-MS.

MALDI-TOF-MS，rice pathogen，detection

S435.11

A

1673—1689（2016）04—0370—05

2014-07-02

國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAC01B07）。

王文彬（1990—），男，河南南陽(yáng)人，食品科學(xué)博士研究生，主要從事食品安全檢測(cè)研究。E-mail：wenbin66@yeah.net

胥傳來(lái)（1965—），男，江蘇鹽城人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事食品安全檢測(cè)研究。E-mail：xcl@jiangnan.edu.cn