莘長明 喬高鋒 張運(yùn)曾 金鋒

目前，肺癌的發(fā)病率和致死率在很多地區(qū)位居惡性腫瘤的首位[1]，80%以上的肺癌患者在臨床診斷時已經(jīng)發(fā)生了局部或遠(yuǎn)處的轉(zhuǎn)移，肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制研究是目前肺癌研究的熱點問題[2]。近年來，腺癌在肺原發(fā)惡性腫瘤中的占比明顯增高，約占肺癌病例的一半以上，成為最常見的組織學(xué)類型之一[3]。

有研究[4]表明， Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2( Runt-related transcription factor 2，Runx2)在乳腺癌等上皮性腫瘤中的表達(dá)水平較高，而肺腺癌組織中Runx2蛋白的表達(dá)及其意義尚不完全清楚。本研究通過檢測肺腺癌組織、癌旁組織及正常肺組織中Runx2蛋白的表達(dá)情況，分析該蛋白表達(dá)與肺腺癌分化程度及轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等臨床參數(shù)的相關(guān)性，旨在為肺腺癌的治療提供新的途徑。

對象與方法

一、 研究對象

選取山東省胸科醫(yī)院胸外科2016年12月—2017年6月接受手術(shù)治療的49例肺腺癌患者的臨床資料及病理標(biāo)本(包括肺腺癌組織、癌旁組織及正常肺組織)。其中男性23例，女性26例，男女比例為1∶1.13；年齡35～71歲，中位年齡51歲；吸煙16例，不吸煙33例；原位腺癌或微浸潤腺癌15例，浸潤腺癌34例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例；隨訪至2019年12月，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移8例，無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移41例。

二、 Runx2蛋白表達(dá)檢測

1. 主要試劑：Runx2抗體(Abeam，USA)，鼠兔通用二抗(中杉金橋)，DAB顯色試劑盒(中杉金橋)，0.01 mmol/L PBS緩沖液(中杉金橋)，0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液(pH值為6.0)(中杉金橋)，3%過氧化氫溶液(中杉金橋)，中性樹膠(中杉金橋)，蘇木精(中杉金橋)，TRIzol裂解液(Invitrogen，美國)，PVDF膜(Pall，0.22 um)等。

2. 免疫組織化學(xué)法：將病理切片置于60 ℃烤箱內(nèi)2 h；常規(guī)二甲苯脫蠟20 min后更換新鮮二甲苯溶液繼續(xù)浸泡20 min，然后分別用梯度乙醇(95%、85%、70%)浸泡，每次5 min，蒸餾水沖洗；切片放置于0.01 mmol/L(pH值為6.0)枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液中，高壓鍋121 ℃抗原修復(fù)2 min，室溫下自然冷卻，PBS緩沖液沖洗3遍；滴入3%過氧化氫溶液去除內(nèi)源性過氧化物酶，室溫放置20 min，PBS緩沖液沖洗3遍，各5 min；滴加抗Runx2抗體(1∶200)，室溫下靜置30 min，4 ℃冰箱孵育12 h；從冰箱取出，自然恢復(fù)至室溫，PBS緩沖液沖洗3遍，每次5 min；滴加通用型二抗，室溫下置1 h；去除載玻片多余液體后，滴加新鮮配置的DAB液體，避光下控制染色時間(1～2 min)，放入蒸餾水中停止反應(yīng)；蘇木精復(fù)染2 min，蒸餾水洗脫，脫水透明，封片。

染色的判定：Runx2蛋白表達(dá)的陽性顆粒位于肺腺癌細(xì)胞的細(xì)胞核中。按染色強(qiáng)度：無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，深棕色為3分；陽性染色的范圍定義：1分，<25%的肺腺癌細(xì)胞陽性表達(dá)；2分，25%～50%的肺腺癌細(xì)胞陽性染色；3分，51%～75%的肺腺癌細(xì)胞陽性表達(dá)；4分，>75%的肺腺癌細(xì)胞出現(xiàn)陽性表達(dá)。將上述2項評分相乘得到免疫評分即染色系數(shù)。在本研究中，將Runx2蛋白的染色系數(shù)≥8定義為高表達(dá)(陽性表達(dá))，≤7為蛋白陰性/低表達(dá)。

3. Western blotting方法：取肺腺癌組織、癌旁組織、正常肺組織各49例，每例約50 mg，加入100 μL細(xì)胞裂解液，充分混勻后冰浴30 min，離心，收集上清液，沸水浴10 min；制備SDS-PAGE凝膠，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；棄封閉液，加入1：300的Runx2及β-actin一抗4 ℃過夜；PBS洗滌3次，每次5 min；以封閉液稀釋二抗，室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，每次5 min；配置發(fā)光液；曝光。拍照記錄并進(jìn)行圖像分析，測定組織中Runx2蛋白的相對表達(dá)量。

三、 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。率的比較采用χ2檢驗，以P<0.05表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 Runx2蛋白在肺腺癌組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果顯示：在49例肺腺癌組織中，Runx2蛋白在21例肺腺癌組織中呈現(xiàn)陰性/低表達(dá)，在28例肺腺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，陽性表達(dá)信號主要位于腫瘤細(xì)胞的胞核(圖1)；癌旁組織中僅有4例為高表達(dá)；正常肺組織中Runx2蛋白表達(dá)均為陰性/低表達(dá)。肺腺癌組織、癌旁組織、正常肺組織Runx2蛋白陽性表達(dá)率分別為57.1%、8.2%、0，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，詳見表1。Western blotting檢測結(jié)果證實Runx2蛋白在肺腺癌組織中的高表達(dá)情況(圖2)。

二、 Runx2蛋白表達(dá)與肺腺癌臨床參數(shù)的關(guān)系

Runx2蛋白在原位腺癌或微浸潤腺癌、浸潤性腺癌中的陽性表達(dá)率分別為13.3%(2/15)、76.5%(26/34)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的陽性表達(dá)率分別為86.7%(13/15)、44.1%(15/34)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.006)；在34例浸潤性腺癌中，高、中、低分化的陽性表達(dá)率分別為45.5%、77.8%、100%)，差異同樣具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.006)。在隨訪期內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者的Runx2蛋白陽性表達(dá)率為100%，明顯高于無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者的48.8%(P=0.007)。Runx2蛋白的表達(dá)與性別、年齡、吸煙史、腫瘤直徑無明顯關(guān)系(P>0.05，表2)

圖1 Runx2在肺腺癌組織中高表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色SP法×400)

圖2 Western blotting檢測Runx2蛋白表達(dá)注：1.肺腺癌組織；2.癌旁組織；3.正常肺組織

表1Runx2蛋白在肺腺癌組織、癌旁組織、正常肺組織中的表達(dá)情況(n,N=49)

項目正常組織癌旁組織肺腺癌組織χ2值P值Runx2表達(dá)35.79<0.001 高表達(dá)0428 陰性/低表達(dá)494521

表2 Runx2蛋白表達(dá)與肺腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n)

討 論

眾多研究[5-9]證明，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，而Runx2是惡性腫瘤發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要調(diào)控機(jī)制[9]，參與腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移過程，這也成為近年來腫瘤轉(zhuǎn)移研究的熱點方向。Runx2可以調(diào)節(jié)骨基質(zhì)和黏附蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)及血管內(nèi)皮生長因子等與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)蛋白的表達(dá)[10-12]。研究[13-14]發(fā)現(xiàn)，Runx2在骨腫瘤、前列腺癌、乳腺癌等實體腫瘤中存在明顯的表達(dá)上調(diào)，并且在調(diào)節(jié)這些腫瘤的骨轉(zhuǎn)移微環(huán)境過程中起著關(guān)鍵作用，Runx2的表達(dá)與上述惡性腫瘤的預(yù)后呈明顯的負(fù)相關(guān)。但目前國內(nèi)外較少有關(guān)于Runx2與肺腺癌關(guān)系的相關(guān)研究。

本研究采用免疫組織化學(xué)及Western blotting方法檢測了肺腺癌、癌旁組織和正常肺組織中Runx2蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，Runx2蛋白在肺腺癌組織中存在高表達(dá)的現(xiàn)象；進(jìn)一步通過分析臨床資料證實：浸潤性生長、分化程度低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、隨訪期內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的病理標(biāo)本中Runx2蛋白的陽性表達(dá)率明顯升高，這些指標(biāo)都是公認(rèn)的惡性腫瘤預(yù)后差的重要因素，提示Runx2蛋白的高表達(dá)與肺腺癌的不良預(yù)后密切相關(guān)。這與Li等[15]的研究結(jié)果一致，該研究對121例非小細(xì)胞肺癌患者肺癌病理標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，Runx2蛋白的表達(dá)與肺癌的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后均密切相關(guān)；但其研究也表明，腫瘤直徑>3 cm組織中Runx2蛋白的表達(dá)率要明顯高于腫瘤直徑≤3 cm者；本研究未能證實Runx2蛋白的表達(dá)與腫瘤直徑的相關(guān)性；國內(nèi)學(xué)者高鵬等[16]的研究也證明Runx2蛋白表達(dá)與腫瘤大小無關(guān)。關(guān)于Runx2蛋白在肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制研究，近幾年也逐漸有文獻(xiàn)涉及。Tandon等[17]發(fā)現(xiàn)，Runx2可通過抑制MMP的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移特性。Herreo等[18]證實，Runx2可上調(diào)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。耿文文等[19]研究表明，沉默Runx2基因的表達(dá)可以阻止肺癌細(xì)胞系上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，從而延緩癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

綜上所述，Runx2可通過調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移；Runx2蛋白的高表達(dá)與肺腺癌的低分化、高侵襲轉(zhuǎn)移特性及復(fù)發(fā)關(guān)系密切；Runx2蛋白可能成為檢測肺腺癌分化及判斷預(yù)后的標(biāo)志物；抑制Runx2蛋白的表達(dá)或沉默Runx2基因或許可以對預(yù)防肺腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移起到重要作用。