□ 賈南南 李建平 范美霞 菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院

1 引言

隨著社會(huì)的發(fā)展，人們的生活水平不斷提高，對(duì)肉制品的要求也越來(lái)越高。但是，肉制品市場(chǎng)存在肉類摻假、以次充好等欺騙消費(fèi)者的行為，不法商販為了追求自身利益以“掛羊頭賣(mài)狗肉”的方式用劣質(zhì)肉冒充高質(zhì)量的肉制品。利用常規(guī)的檢測(cè)方法只能從感官及形態(tài)上鑒別肉類，無(wú)法從溯源層面解決肉類摻假的問(wèn)題，例如對(duì)于腌制加工的熟牛肉，消費(fèi)者就很難通過(guò)肉眼辨別其是否為牛肉。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，以DNA為基礎(chǔ)的PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物源性成分的檢測(cè)[1-4]，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）溯源是以DNA遺傳物質(zhì)為基礎(chǔ)鑒別肉及肉制品。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在體外特異性擴(kuò)增DNA序列的技術(shù)，其基本過(guò)程為3個(gè)階段的多次循環(huán)—模板雙鏈DNA的變性、引物與模板DNA的退火、在DNA聚合酶引導(dǎo)下的鏈延伸反應(yīng)，且每一次循環(huán)后的擴(kuò)增產(chǎn)物均可作為下一輪循環(huán)的模板。就理論而言，擴(kuò)增產(chǎn)物量呈指數(shù)形式上升，即經(jīng)過(guò)n個(gè)循環(huán)后，產(chǎn)物量增加到2n倍。此方法在動(dòng)物源性成分檢測(cè)、肉類摻假鑒別等應(yīng)用上已有多個(gè)報(bào)道[7，8]。本研究針對(duì)菏澤市市場(chǎng)上銷(xiāo)售的肉及肉制品進(jìn)行抽樣檢測(cè)，利用實(shí)時(shí)熒光PCR方法鑒別牛、豬、馬源性成分，以期發(fā)現(xiàn)是否存在摻假的情況，旨在為肉制品摻假檢測(cè)提供一定的參考依據(jù)。

2 材料和方法

2.1 材料

12份市售熟牛肉。

2.2 儀器

絞肉機(jī)，小熊電器股份有限公司；金屬浴，杭州奧盛儀器有限公司；Rotor Gene Q 熒光定量PCR儀，德國(guó)凱杰。

表1 實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)結(jié)果

2.3 試劑

無(wú)水乙醇，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；DNA提取試劑盒，天根生物公司；豬源性檢測(cè)試劑盒、牛源性檢測(cè)試劑盒，Takara公司；馬引物及探針（SN/T3730.5-2013）、PCR體系預(yù)混液2xTaqMan Fast qPCR Master Mix（Probe qPCR），上海生工合成。

2.4 樣品處理

取適量樣品放入燒杯中，用溫水沖洗并擠干水分，往復(fù)數(shù)次，用干凈的絞肉機(jī)粉碎，備用。

2.5 樣品總DNA提取

按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.6 DNA純度與濃度

打開(kāi)核酸蛋白檢測(cè)儀，吸取 DNA溶解液2μL加入加樣口，分別測(cè)定260nm與280nm吸光度，測(cè)定DNA提取液的濃度和純度。

圖1 牛源性成分檢測(cè)

圖2 馬成分檢測(cè)

圖3 豬源性成分檢測(cè)

2.7 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

2.7.1 牛源性實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)

以提取的各個(gè)DNA樣品為模板，按牛源性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2.7.2 豬源性實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)

以提取的各個(gè)DNA樣品為模板，按豬源性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2.7.3 馬成分檢測(cè)

以提取的各個(gè)DNA樣品為模板，作陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照。

反應(yīng)體系：2xTaqMan Fast qPCR Master Mix 1 0 μ L 、 1 0 μ M F o r w a r d P r i m e 0.4 μ L 、 1 0 μ M Reverse Primer 0.4μL、10μM probe 0.4μL、DNF Buffer 2μL、模板 DNA 1μL、dH2O 5.8μL。

反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃3min，變性94℃5s，退火延伸60℃30s（收集熒光信號(hào)），40個(gè)循環(huán)。

3 結(jié)果與分析

3.1 DNA模板質(zhì)量

所有樣品DNA提取液OD260/OD280值為1.6～1.7，濃度為50～100ng/μL，模板DNA在純度及濃度上都能夠滿足進(jìn)行PCR檢測(cè)的要求。

3.2 實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)結(jié)果

分別配制牛、豬源性熒光PCR反應(yīng)體系和馬成分熒光PCR反應(yīng)體系，Ct值如表1所示。當(dāng)樣品的Ct值不為0且小于35，并有典型的擴(kuò)增曲線時(shí)，則判定樣品檢出該動(dòng)物源性成分；反之則為未檢出該動(dòng)物源性成分。

4 討論

動(dòng)物源性食品大多為動(dòng)物組織，其結(jié)構(gòu)緊密，富含蛋白質(zhì)、脂肪等大分子物質(zhì)，而熟肉制品在制作過(guò)程添加了入味調(diào)料等，這些物質(zhì)會(huì)在DNA提取過(guò)程中產(chǎn)生共沉淀，倘若提取不當(dāng)將會(huì)影響后續(xù)PCR檢測(cè)。因此，在提取DNA的過(guò)程中，去除雜質(zhì)，得到高DNA純度尤為重要。本方法在前處理時(shí)用溫水多次洗滌，去除入味的香料和鹽等成分，DNA提取采用試劑盒介質(zhì)吸附法（硅基質(zhì)），DNA純度高，雜質(zhì)等抑制物少，是PCR成功的保證。檢測(cè)結(jié)果顯示，所抽取的市售12批樣本中均檢出牛源性成分，2批既檢出牛源性成分又檢出馬成分，說(shuō)明樣本可能存在馬肉摻假為牛肉的問(wèn)題。