馬奕樅 王雪峰

摘要：目的 ?分析microRNA-373（miR-373）及直接靶標基因TRPS1在喉癌組織中的表達水平及其臨床意義。方法 ?收集2018年1月～2019年12月錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科確診為喉癌并行手術治療的55例患者的喉癌組織及42例癌旁正常上皮組織。所有標本在取材前均未行任何抗腫瘤治療，采用SYBR Green qRT-PCR方法檢測患者癌組織及對應癌旁正常上皮組織中miR-373表達情況，采用免疫熒光法測量其靶標基因TRPS1在喉癌組織中的表達水平，并分析miR-373、TRPS1與臨床病理特征的關系。結果 ?miR-373及TRPS1在喉癌組織中的表達均高于癌旁正常上皮組織（P<0.05）;不同 TNM 分期和淋巴結轉移間 miR-373 相對表達量及TRPS1比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;但不同年齡、性別、吸煙、飲酒及分化程度間 miR-373 相對表達量及TRPS1比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結論 ?miR-373及TRPS1在喉癌組織中的表達升高，且與淋巴結轉移及腫瘤TNM分期有關。

關鍵詞：喉癌;miR-373;TRPS1

中圖分類號：R739.65 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.05.001

文章編號：1006-1959（2020）05-0001-04

Abstract：Objective ?To analyze the expression level and clinical significance of microRNA-373 （miR-373） and direct target gene TRPS1 in laryngeal cancer. Methods ?From January 2018 to December 2019， the laryngeal cancer tissues and 42 normal epithelium tissues adjacent to the cancer were collected from 55 patients diagnosed with laryngeal cancer and surgically treated in the first hospital of Jinzhou Medical University. All specimens were not subjected to any anti-tumor treatment before material extraction. SYBR Green qRT-PCR was used to detect miR-373 expression in cancer tissues and normal epithelial tissues adjacent to the cancer. Immunofluorescence was used to measure the target gene TRPS1 in laryngeal cancer. The expression level in the tissues， and the relationship between miR-373， TRPS1 and clinicopathological characteristics were analyzed. Results ?The expressions of miR-373 and TRPS1 in laryngeal cancer tissues were higher than those in normal epithelium adjacent to the cancer （P<0.05）;Comparison of miR-373 expression and TRPS1 in different TNM stages and lymph node metastasis were statistically significant（P<0.05）;but comparison of miR-373 expression and TRPS1 in different ages，sex， smoking， drinking and differentiation degree with no statistically significant （P>0.05）. Conclusion ?The expression of miR-373 and TRPS1 in laryngeal cancer tissues is increased， and it is related to lymph node metastasis and tumor TNM stage.

Key words：Laryngeal cancer;miR-373;TRPS1

喉癌（laryngeal cancer）是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，從病理學類型上來看，大多數(shù)的喉癌為鱗狀細胞癌[1]。近年來盡管喉癌的診斷和對應的手術治療及放射治療都有了顯著進步，但全球每年仍有超過8萬的喉癌患者死亡[2]。目前，喉癌治療方法以手術切除為主，聯(lián)合術前或術后化療、放療等綜合治療[3]。微小RNA（microRNA）是一類具有18～25個核苷酸長度的內源性微小非編碼RNA。miRNA可以通過與靶基因的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）配對來調節(jié)mRNA的水平和或抑制靶基因的翻譯[4]。通過大量數(shù)據(jù)分析，miRNA在多種人類癌癥中高表達，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及其轉移中起關鍵作用[5]。從功能上來說，miRNA參與細胞增殖、分化、凋亡和移行[6，7]。一些特定的miRNA被認為是喉癌的生物標記和治療靶點[8]。miRNA-373在乳腺癌、食管癌、胰腺癌、非小細胞肺癌、胃癌細胞等多種腫瘤中的遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用[9]。但目前關于miR-373在喉癌的表達情況及其與臨床特征的關系尚不清楚，而TRPS1作為miR-373的標靶基因[10]，其與喉癌的關系研究較少。因此，本研究采用SYBR Green qRT-PCR及免疫熒光檢測技術，檢測喉癌組織和對應癌旁組織miR-373及TRPS1的表達情況，分析miR-373及TRPS1表達與喉癌臨床病理特征的關系，為今后喉癌的臨床研究及早期診斷奠定基礎，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1組織標本來源 ?收集2018年1月～2019年12月錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科確診為喉癌并手術治療的55例患者的喉癌組織及42例癌旁正常上皮組織，研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。其中男性50例，女性5例，年齡47～81歲，平均年齡（65.01±8.10）歲;分化程度：高23例、中21例、低11例;TNM分期：T1期10例、T2期18例、T3期17例、T4期10例;類型：聲門型38例、聲門上型17例。所有標本在取材前均未行任何抗腫瘤治療。

1.2材料和儀器 ?核酸提取試劑盒（廈門艾德生物醫(yī)藥有限公司），特異性多克隆兔抗人TRPS1抗體（博奧森生物技術有限公司），山羊抗兔抗體（Abcam公司），奧林巴斯熒光共聚焦顯微鏡（Leica TCS sp5Ⅱ，德國Leica公司），實時熒光定量PCR儀（Quant Studio3，美國Thermo Fisher Scientific公司），還原第一鏈cDNA合成試劑盒（RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，美國Thermo Scientific公司），Power SYBR ? Green PCR Master Mix（美國Thermo Scientific公司）。

1.3實驗方法

1.3.1實時熒光定量PCR法檢測miR-373表達水平 ?采用Trizol提取喉癌細胞組織和正常癌旁組織中總RNA，向每孔細胞中加入1 ml Trizol 進行裂解，將裂解液轉移至干凈EP管中，采用氯仿/異丙醇處理后收集白色RNA沉淀;用預冷75%乙醇洗滌，4℃ 12000 r/min離心10 min后棄上清。自然晾干后用DEPC水溶解RNA，采用One Step Prime Script miRNA cDNA Synthesis Kit按照說明書合成cDNA。使用One Step SYBR Prime Script TM QPCR Kit遵循試劑盒說明書于美國ABI 7300 QPCR System儀上進行，反應條件如下：95℃變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)。以U6作為內參（U6上游引物為GTGCTCGCTTCGGCAG-CATA，下游引物為GGAACGCTTCACAATTTGC-GTGTC;miRNA-373上游引物為TACTCAAAAT-GGGGGCGCTT，下游引物為GGGACACCCCAA-AATCGAAG）。采用2-△△Ct表示miR-373的相對表達量。

1.3.2免疫組織熒光染色法石蠟切片免疫組織熒光染色 ?具體步驟如下：①切片常規(guī)脫蠟至水;②將切片放入檸檬酸鈉緩沖液中，微波爐低火加熱15 min，用PBS沖洗一次，5 min;③加入500 μl封閉液，37℃孵育20 min;④滴加稀釋的一抗工作液兔抗RRP15，37℃孵育 2 h，用PBS沖洗3次;⑤滴加500 μl第二抗體，37℃濕盒孵育1 h，用PBS沖洗3次;⑥滴加500 μl的DAPI，37℃濕盒孵育5 min，用PBS洗3次，封片。制備42例喉癌病人的癌組織及癌旁組織的石蠟切片，進行免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下以相同曝光時間進行圖像采集，之后用Image Pro Plus統(tǒng)計其熒光強度。

1.4統(tǒng)計學分析 ?采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗;以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 miR-373在喉癌組織及癌旁正常組織中的表達情況 ?喉癌組織中miR-373的表達量高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖1。

2.2 miR-373相對表達量與臨床病理特征的關系 ?不同TNM分期和淋巴結轉移間miR-373相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;但不同年齡、性別、吸煙、飲酒及分化程度間miR-373相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表1。

2.3 TRPS1在喉癌組織及癌旁正常組織中的表達情況 ?喉癌組織中TRPS1的熒光強度高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖2。

2.4平均熒光密度值與臨床病理特征的關系 ?不同TNM分期和淋巴結轉移間TRPS1平均熒光密度值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;但不同年齡、性別、吸煙、飲酒及分化程度間TRPS1平均熒光密度值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2。

3討論

大量研究顯示，miRNA與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移和凋亡密切相關[11]。miR-373在多種腫瘤中均出現(xiàn)異常表達，其不僅與患者的腫瘤細胞發(fā)展有關，還與臨床病理特征具有相關性。劉文稚的研究發(fā)現(xiàn)[12]，miR-373在食管癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，并且其表達與分化程度、腫瘤T分期及淋巴結轉移相關。Syring I等[13]研究顯示，miR-373在睪丸生殖細胞腫瘤以及乳腺癌中表達上調，且其水平與病理分期和臨床分期呈正相關。本研究通過實時定量PCR檢測分析，結果顯示喉癌組織中miR-373的表達量高于相應的癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示miR-373與喉癌的發(fā)生與發(fā)展有關。不同TNM分期和淋巴結轉移間miR-373相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;但不同年齡、性別、吸煙、飲酒及分化程度間miR-373相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），推斷miR-373可能對喉癌的增殖及轉移有一定調控作用，其可能為評估喉癌的早期診斷標志物。

TRPS1是一種新發(fā)現(xiàn)的GATA家族轉錄因子，研究證明其編碼產(chǎn)物在人類卵巢、前列腺、肺、乳腺、腎中廣泛表達，而且主要存在于細胞核中，參與了多種癌細胞周期調控，在癌癥發(fā)展中起到至關重要的作用[14]。TRPS1基因編碼的轉錄因子通過特異性結合GATA序列抑制多個GATA家族成員，從而調控下游基因的表達。在TRPS1的3ˊUTR區(qū)域存在miR-373的結合位點，由此可以確定此結合位點是miR-373靶向調控TRPS1的核心序列，證實了miR-373可以直接靶向結合到TRPS1的3ˊUTR的區(qū)域來調節(jié)TRPS1的表達。有研究發(fā)現(xiàn)[10]，TRPS1是miR-373的一個關鍵靶向基因，miR-373通過靶向調節(jié)TRPS1在乳腺癌中的表達，從而促進乳腺癌EMT和侵襲轉移，說明miR-373及其靶標基因TRPS1的表達與惡性腫瘤的生長和轉移存在相關性。本研究通過免疫熒光檢測技術進一步證實了miR-373的標靶基因TRPS1在喉癌組織中的熒光強度高于癌旁組織，不同TNM分期和淋巴結轉移間TRPS1平均熒光密度值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與miR-373在喉癌組織中的結果相似，證明了TRPS1在喉癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

綜上所述，喉癌中miR-373及其靶標基因TRPS1的表達量高于癌旁組織，且有淋巴結轉移及分化程度也對表達量有一定的影響，惡性程度越高其表達量亦越高，可以推測出miR-373分子及其調控的TRPS1基因影響著喉癌的發(fā)展，對喉癌的基因檢測及靶向治療有著一定的指導意義，但發(fā)揮作用的具體機制仍需今后進一步探索。

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收稿日期：2020-01-02;修回日期：2020-01-10

編輯/杜帆