陳啟旺，孫郁文，魏 珂，張 浩，李躍紅

骨膜具有較強(qiáng)的成骨能力，在骨折愈合修復(fù)方面扮演著重要角色，被認(rèn)為是促進(jìn)骨移植材料在移植區(qū)域發(fā)揮修復(fù)作用的始動(dòng)因素。國(guó)內(nèi)外有較多關(guān)于臨床上骨膜移植治愈骨缺損、骨不愈合的報(bào)道，然而骨膜移植存在供體不足、供區(qū)結(jié)構(gòu)功能損害及免疫排斥反應(yīng)等問(wèn)題。近年來(lái)，組織工程技術(shù)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。有學(xué)者采用脫細(xì)胞技術(shù)制備了去細(xì)胞骨膜[1]，并證實(shí)這種生物材料體內(nèi)相容性較好。本研究探索基于豬骨膜去細(xì)胞支架的制備及檢測(cè)，觀察骨膜去細(xì)胞支架與細(xì)胞共培養(yǎng)的情況，旨在為建立載藥微球—復(fù)合支架及支架性能的研究及聯(lián)合體內(nèi)移植奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要儀器 高壓滅菌鍋(STIK)；恒溫水浴鍋(易晨?jī)x器)；臺(tái)式恒溫震蕩儀(蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；超純水制備系統(tǒng)(Millipore)；電子天平(Sartorius)；光學(xué)顯微鏡(鳳凰光學(xué)儀器有限公司)；熒光顯微鏡(OLYMPUS)；掃描電子顯微鏡(ZEISS)；紫外分光光度計(jì)(Shimadzu)；酶標(biāo)儀(Molecular Devices)； Heraeus Labofuge 400R低溫超高速離心機(jī)(Heraeus)；Eppendorf Centrifuge 5810R型低溫冷凍離心機(jī)、移液槍(Eppendorf)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 Triton-X 100、十二烷基硫酸鈉(SDS)、青/鏈霉素、苯甲基黃酰氟(PMSF)、DNA酶、RNA酶、Tris-HCl(pH=8.0)、哺乳動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒、MTT、胎牛血清(FBS)、胰酶細(xì)胞消化液(上海碧云天生物有限公司)；羥脯氨酸試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich)；過(guò)氧乙酸(山東瑞泰奇洗滌消毒科技有限公司)；其他均為常規(guī)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 HFLS滑膜成纖維細(xì)胞(蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司)在37 ℃、 5% CO2的CM1-1培養(yǎng)液(由90% DMEM-H+10% FBS 配制而成)條件下貼壁生長(zhǎng)。細(xì)胞中間凸起，兩端細(xì)長(zhǎng)。

1.1.4實(shí)驗(yàn)材料 豬骨膜取自新鮮帶肉豬扇骨，購(gòu)于聯(lián)華超市，生產(chǎn)企業(yè)為浙江華騰食品有限公司，屠宰企業(yè)為桐鄉(xiāng)市崇福食品有限公司屠宰加工廠。

1.2 骨膜去細(xì)胞支架的制備

1.2.1豬扇骨骨膜的剝離 取新鮮的帶肉豬扇骨，使用潔凈的鈍性牙科刀剔除豬扇骨的筋膜及結(jié)締等組織。使用無(wú)菌手術(shù)刀及鑷子仔細(xì)緩慢剝離骨膜組織，盡量保持骨膜組織的完整，分離過(guò)程中不斷用棉簽沾取適量PBS溶液濕潤(rùn)剝離區(qū)域。將剝離下的骨膜組織放入含有PBS溶液的培養(yǎng)皿中，用PBS溶液多次沖洗剝離下的骨膜組織，以去除骨膜上殘留的雜質(zhì)。

1.2.2骨膜去細(xì)胞支架的制備 將清洗后的骨膜組織置入PBS溶液，放入-80 ℃冰箱內(nèi)物理凍融24～48 h，促進(jìn)組織疏松降解。取出骨膜組織于室溫下解凍；用無(wú)菌PBS溶液反復(fù)清洗3次，每次3～5 min。再將骨膜組織浸泡在2% Triton-X 100和濃度為3.5×10-5mol/L PMSF脫細(xì)胞高滲透溶液中，置37 ℃ 恒溫箱以100 r/min震蕩12 h。倒掉脫細(xì)胞高滲透溶液，PBS溶液反復(fù)清洗后加入1% SDS溶液，置37 ℃恒溫箱震蕩2 h。再將骨膜組織浸泡在混合消化酶液(含0.05 U/L DNA酶和0.1 g/L RNA酶)中水浴6 h(37 ℃)，以進(jìn)一步消化細(xì)胞外基質(zhì)中殘留的核酸成分。用PBS溶液清洗骨膜組織并置于0.1%過(guò)氧乙酸溶液中浸泡消毒。再將該骨膜標(biāo)本浸泡在含0.1 U/L雙抗的PBS溶液中預(yù)防細(xì)菌污染。4 ℃保存，備用。

1.3 骨膜去細(xì)胞支架的鑒定

1.3.1掃描電鏡觀察 正常骨膜和經(jīng)去細(xì)胞處理的骨膜支架用3%的戊二醛固定24 h，用PBS溶液浸泡10 min，重復(fù)3次。經(jīng)乙醇梯度脫水，機(jī)械干燥后，送至浙江大學(xué)光電學(xué)院大型儀器有償服務(wù)平臺(tái)，真空鍍金后掃描觀察。

1.3.2DNA定性分析 HE染色：正常骨膜和去細(xì)胞骨膜經(jīng)4%多聚甲醛固定后，送樣至浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察攝片。DNA提取法：① 根據(jù)哺乳動(dòng)物DNA提取試劑盒說(shuō)明書，選取3組正常骨膜和6組去細(xì)胞骨膜進(jìn)行DNA提取實(shí)驗(yàn)。② 在液氮環(huán)境下研磨骨膜組織至粉末狀。③ 用電子天平稱取骨膜粉末，加入裂解液，渦旋混勻，50 ℃水浴過(guò)夜。④ 加入Tris水飽和酚，待溶液分層，丟棄下層酚相及中間相，重復(fù)操作1次。⑤ 加入氯仿分層后吸取上清液，加入醋酸銨和無(wú)水乙醇，上下輕柔顛倒混勻，觀察是否出現(xiàn)DNA絮狀沉淀。

1.3.3膠原定性和定量檢測(cè) 膠原定性檢測(cè)(Masson染色)：正常骨膜和去細(xì)胞骨膜由4%多聚甲醛溶液固定，送樣至浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行Masson染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察攝片。膠原定量檢測(cè)(羥脯氨酸測(cè)量法)： ① 根據(jù)羥脯氨酸試劑盒說(shuō)明書，用電子天平稱取正常骨膜組織和去細(xì)胞骨膜組織。② 加入裂解液，于95 ℃水浴鍋中分解。③ 加入指示劑和pH調(diào)整液。④ 稀釋水解液，加入活性炭，3 500 r/min離心15 min，過(guò)程重復(fù)3次。⑤ 吸取上清液檢測(cè)吸光度，計(jì)算羥脯氨酸的含量，求出正常骨膜以及去細(xì)胞骨膜組織中膠原的含量。

1.4 滑膜成纖維細(xì)胞與骨膜去細(xì)胞支架共培養(yǎng)

1.4.1HFLS滑膜成纖維細(xì)胞的培養(yǎng) 選擇含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)原代HFLS滑膜成纖維細(xì)胞，隔2 d進(jìn)行細(xì)胞換液，待HFLS滑膜成纖維細(xì)胞貼壁，細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%～90%后傳代。細(xì)胞和骨膜去細(xì)胞支架共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中使用第3代傳代細(xì)胞。

1.4.2細(xì)胞和支架共培養(yǎng)觀察 常規(guī)操作培養(yǎng)細(xì)胞，待第3代HFLS滑膜成纖維細(xì)胞長(zhǎng)滿后加入胰蛋白酶消化，用DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS)制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為5×104～10×104/ml。取3塊96孔細(xì)胞板，每塊96孔板均設(shè)立4組，即無(wú)菌PBS空白對(duì)照組(無(wú)細(xì)胞，無(wú)培養(yǎng)基，加MTT和DMSO)、培養(yǎng)基對(duì)照組(無(wú)細(xì)胞，加培養(yǎng)基，加MTT和DMSO)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組(細(xì)胞，培養(yǎng)基，MTT和DMSO)以及細(xì)胞和骨膜去細(xì)胞支架共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組(細(xì)胞，骨膜去細(xì)胞支架，培養(yǎng)基，MTT和DMSO)，每組5個(gè)復(fù)孔。96孔板邊緣孔用無(wú)菌PBS填充。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組、細(xì)胞和骨膜去細(xì)胞支架共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組每孔加入100 μl細(xì)胞懸液，每滴加3個(gè)孔，就重新吹打離心管中的細(xì)胞懸液，確保每孔接種的細(xì)胞密度相同。將這3塊96孔板分別置于5% CO237 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h和48 h。

1.4.3MTT檢測(cè) 采用培養(yǎng)至第3代的HFLS滑膜成纖維細(xì)胞和骨膜去細(xì)胞支架共培養(yǎng)以檢測(cè)骨膜去細(xì)胞支架的生物相容性。加入MTT檢測(cè)前吸除DMEM完全培養(yǎng)基，加入不含血清的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，避免血清對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。檢測(cè)時(shí)每孔加入20 μl 5 g/L MTT溶液，再將96孔板放回5% CO237 ℃恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h。 4 h后終止培養(yǎng)，取出96孔板，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，酶標(biāo)儀低速震蕩，使結(jié)晶充分溶解。OD490 nm處檢測(cè)各孔的吸光度。檢測(cè)細(xì)胞活性的時(shí)間點(diǎn)分別設(shè)定為24 h和48 h。由于MTT會(huì)和活細(xì)胞反應(yīng)生成藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，則吸光度值越高，表明活細(xì)胞數(shù)量越多。

2 結(jié)果

2.1 骨膜去細(xì)胞支架鑒定評(píng)價(jià)

2.1.1掃描電鏡觀察 見圖1。豬骨膜組織經(jīng)去細(xì)胞處理后，組織表面的連續(xù)性并未中斷，并存在大小不等的孔隙。電鏡結(jié)果表明，去細(xì)胞操作對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)成分以及骨膜結(jié)構(gòu)的完整性無(wú)明顯破壞效應(yīng)。

圖1 去細(xì)胞骨膜掃描電鏡觀察 ×1 000 組織表面的連續(xù)性未中斷(箭頭所示)，存在大小不等的孔隙(圓圈所示)

2.1.2HE染色和DNA抽提檢測(cè) 正常骨膜組織具有雙層結(jié)構(gòu)(疏松的形成層和致密的纖維層)，細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)以及胞質(zhì)的核酸經(jīng)HE染色后表現(xiàn)為藍(lán)紫色(見圖2A)。骨膜去細(xì)胞支架中未見明顯藍(lán)紫色的成分(見圖2B)，表明DNA成分去除干凈。利用DNA提取試劑盒抽提正常骨膜和骨膜去細(xì)胞支架的DNA，輕柔顛倒EP管后，可觀察到正常骨膜組織中產(chǎn)生DNA絮狀沉淀。而骨膜去細(xì)胞支架組織澄清，未見明顯沉淀現(xiàn)象。說(shuō)明經(jīng)去細(xì)胞操作后，骨膜支架中無(wú)殘留DNA成分，細(xì)胞去除徹底。

2.1.3膠原含量的定性(Masson染色)與定量(羥脯氨酸試劑)檢測(cè) 正常骨膜組織大量膠原纖維排列緊密(見圖3A)，骨膜去細(xì)胞支架膠原纖維交錯(cuò)連接，纖維的連續(xù)性良好，分布排列與處理前正常骨膜組織相似(見圖3B)。提示去細(xì)胞操作并沒(méi)有破壞細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原成分。進(jìn)一步檢測(cè)正常骨膜組織以及骨膜去細(xì)胞支架組織的羥脯氨酸含量。正常骨膜組織膠原含量為(5.55～7.85)×10-3/g，骨膜去細(xì)胞支架組織膠原含量為(6.26～9.86)×10-3/g。兩者膠原含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 兩種骨膜HE染色結(jié)果比較 ×20 A.正常骨膜組織；B.骨膜去細(xì)胞支架組織 圖3 兩種骨膜Masson染色結(jié)果比較 ×20 A.正常骨膜組織；B.骨膜去細(xì)胞支架組織

2.2 骨膜和細(xì)胞共培養(yǎng)結(jié)果利用培養(yǎng)基對(duì)照組吸光度數(shù)值調(diào)零，計(jì)算得到各吸光度值如下：24 h細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組吸光度值為0.735～1.832(1.284±0.549)，細(xì)胞和骨膜去細(xì)胞支架共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組吸光度值為1.106～1.839(1.473±0.366)；兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。48 h細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組吸光度值為1.417～1.598(1.508±0.090)，細(xì)胞和骨膜去細(xì)胞支架共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組吸光度值為1.043～1.668(1.356±0.313)；兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組、細(xì)胞和骨膜去細(xì)胞支架共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組24 h與48 h組內(nèi)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

骨膜去細(xì)胞支架在制備過(guò)程中去除細(xì)胞的同時(shí)要能夠保證支架的完整性，由于制備過(guò)程復(fù)雜、參數(shù)眾多，不同學(xué)者采用不同的骨膜供體，探究了不同的優(yōu)化方法[2-3]。本實(shí)驗(yàn)中，我們采用豬扇骨處骨膜，獲得骨膜去細(xì)胞支架。在制備方法上，增加了Triton-X 100孵育時(shí)間(24 h)，減少了SDS孵育時(shí)間(2 h)，并且適度調(diào)整了RNA/DNA酶的濃度與裂解時(shí)間。本研究通過(guò)掃描電鏡觀察、HE染色、Masson染色、DNA和膠原含量測(cè)定等一系列實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，獲得的骨膜去細(xì)胞支架保持了連續(xù)的細(xì)胞外基質(zhì)且達(dá)到去除DNA但保留膠原蛋白的要求。

本研究骨膜去細(xì)胞支架與成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)證明了其具有良好的生物相容性，24 h細(xì)胞和骨膜去細(xì)胞支架共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組吸光度高于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組，說(shuō)明骨膜本身沒(méi)有毒性，對(duì)共培養(yǎng)的細(xì)胞沒(méi)有殺傷作用。48 h 吸光度兩實(shí)驗(yàn)組之間沒(méi)有差別，進(jìn)一步說(shuō)明骨膜本身沒(méi)有毒性。從單個(gè)組來(lái)看，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組48 h吸光度比24 h略高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。細(xì)胞和骨膜去細(xì)胞支架共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組48 h吸光度略低于24 h，但同樣差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說(shuō)明制備的骨膜暫不適于細(xì)胞的快速生長(zhǎng)繁殖，制備條件仍需要進(jìn)一步完善。

具有良好生物相容性的骨膜去細(xì)胞支架的成功制備可以作為組織工程的支架材料，為種子細(xì)胞黏附、增殖、長(zhǎng)入和分化提供良好的三維空間支持[4]，也可為復(fù)合生長(zhǎng)因子發(fā)揮生物效應(yīng)提供平臺(tái)。