趙雪平,鄭海武,雷蕾,李婷,張美枝*,李正英
1(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 職業(yè)技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古 包頭,014109) 2(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),內(nèi)蒙古 呼和浩特,010018)
我國是世界葡萄酒消費(fèi)增長速度最快的國家,人均葡萄酒消費(fèi)量居世界前列[1],已逐漸成為葡萄酒生產(chǎn)和消費(fèi)大國[2]。葡萄酒的釀造關(guān)鍵在于葡萄原料、工藝及發(fā)酵菌株。我國具有多個(gè)優(yōu)良的釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)及成熟的發(fā)酵釀造工藝,但目前葡萄酒釀造多采用進(jìn)口菌株,提高了釀造成本,降低了本土葡萄酒特色。我國的釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)具有多樣性,葡萄種植歷史同樣比較悠久,為野生酵母篩選提供了寶貴的自然菌種庫,挖掘本土特色釀酒酵母具有一定的研究意義。
酵母菌種對葡萄酒的品質(zhì)影響很大,優(yōu)良的酵母菌不僅能夠保證發(fā)酵的正常完成還能夠改善葡萄酒的品質(zhì)[3]。葡萄酒的品質(zhì)受到酸甜度的影響同時(shí)也受到酒精度、花色苷、單寧、總酚等影響。葡萄酒中的酸度一部分是由葡萄果實(shí)提供,一部分則由酵母發(fā)酵代謝產(chǎn)生。葡萄酒的酒精度是酵母發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生的,自身繁殖和代謝消耗葡萄糖產(chǎn)生酒精、甘油等物質(zhì)。酚類物質(zhì)在葡萄酒中扮演重要角色,酚類物質(zhì)會影響葡萄酒的澀味、苦味、香氣和顏色。所以準(zhǔn)確測定葡萄酒中的總酚對評判葡萄酒品質(zhì)有重要意義,同時(shí)可判斷不同釀酒酵母之間總酚的差異。葡萄中主要的酚類物質(zhì)為總花色苷、酚酸、單寧和黃酮類物質(zhì)四大類。葡萄酒中的酚類不僅僅來自葡萄本身,還來自發(fā)酵過程中釀酒酵母的分解和老化過程中橡木的提取物。酚類化合物對葡萄酒的顏色和風(fēng)味具有一定的影響。葡萄酒中單寧直接影響了葡萄酒的色澤,風(fēng)味和陳釀潛力。它也是干紅葡萄酒澀味的重要組成部分[4-5]。陳釀是葡萄酒中水解單寧的主要來源[6],因此研究葡萄酒中的單寧含量十分重要。紅葡萄酒顏色深度受花色苷影響很大,它是構(gòu)成干紅葡萄酒感官質(zhì)量的重要指標(biāo)之一,也是葡萄酒中抗氧化活性的主要物質(zhì)之一[7]。色澤直接影響人們對其品質(zhì)的評價(jià)及產(chǎn)品的選擇,挑選具有濃郁色調(diào)的葡萄酒便成為消費(fèi)者購買的重要依據(jù)。葡萄果實(shí)中的花色苷主要存在于葡萄酒的果皮中。研究表明[8-9],不同的釀酒酵母發(fā)酵干紅葡萄酒中的花色苷,雖然菌種不同存在顯著差異,但是各類花色苷在總花色苷的比例差別不大。但大多數(shù)新選酵母依然將其作為一個(gè)研究指標(biāo)。通過測定實(shí)驗(yàn)組已經(jīng)篩選的本土優(yōu)良釀酒酵母[10]的發(fā)酵品質(zhì)來判定酵母WJ1和Q12的釀酒可行性。
1.1.1 菌種來源
Q12酵母菌(分離自山東平度早霞玫瑰葡萄的果實(shí)中)、WJ1酵母菌(分離自內(nèi)蒙古烏海農(nóng)家的發(fā)酵醪液),由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院內(nèi)蒙古教育廳產(chǎn)學(xué)研科技創(chuàng)新平臺菌種庫提供;對照菌株為Excellence XR,法國諾蒙集團(tuán);CECA、CEC01,安琪酵母股份有限公司。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
偏重亞硫酸鉀、果膠酶,意大利帝伯仕;NaOH、福林-丹尼斯試液(0.5 g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液)、福林-酚試劑(2 mol/L標(biāo)準(zhǔn)溶液)、單寧酸、HCl、H2SO4、Na2CO3、葡萄糖、酚酞、 碘、KI、淀粉、硼酸鈉、CuSO4、次甲基藍(lán)(均為分析純),天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。
1.1.3 儀器與設(shè)備
TARTER3100精密pH計(jì),奧豪斯儀器有限公司;SA2202S-CW電子天平,德國賽多利斯集團(tuán);ZDJ-4A全自動電位滴定儀,上海雷磁儀器有限公司;H1全功能酶標(biāo)儀,美國伯騰儀器有限公司;100L控溫發(fā)酵罐,濟(jì)南中德發(fā)酵設(shè)備有限公司。
1.2.1 梅鹿輒干紅葡萄酒的發(fā)酵工藝流程及操作要點(diǎn)
梅鹿輒干紅葡萄酒的發(fā)酵工藝流程如下:
選用成熟度良好的梅鹿輒葡萄,去除每串上的生青果粒以及發(fā)霉腐爛的果粒,除埂破碎分別加入到15個(gè)100 L的發(fā)酵罐中,入罐量為80%,加入60 mg/L的偏重亞硫酸鉀,加入30 mg/L的果膠酶,冷浸漬1 d,對照組加入活化的商業(yè)酵母200 mg/L,實(shí)驗(yàn)組加入活化的本土酵母液1 mL/L,第1天采用開放式循環(huán)2次并壓帽,以后每天采用封閉循化2次并壓帽,直到發(fā)酵結(jié)束,發(fā)酵結(jié)束以發(fā)酵液比重不再發(fā)生變化為止。發(fā)酵結(jié)束放出自流汁,加入乳酸菌進(jìn)行蘋乳發(fā)酵,蘋乳發(fā)酵結(jié)束后,冷沉降1周排除酒泥,調(diào)硫放入酒窖陳釀10個(gè)月,罐瓶得到成品干紅。
1.2.2 土酵母對發(fā)酵梅鹿輒的動態(tài)影響研究
在發(fā)酵罐中依次加活化的酵母菌XR、CEC01、CECA、WJ1、Q12,并標(biāo)注為CK1、CK2、CK3、A、B,實(shí)驗(yàn)平行測定3次。發(fā)酵過程中每天定時(shí)進(jìn)行循環(huán)并在循結(jié)束測定每個(gè)發(fā)酵罐的總酸、還原糖、酒精度、丹寧、花色苷、總酚等指標(biāo),并在陳釀結(jié)束進(jìn)行感官品評。
1.3.1 總酸的測定
參照魏冬梅等[11]的方法,用自動電位滴法對發(fā)酵樣品進(jìn)行測定,以NaOH為滴定液,采用pH復(fù)合電極指示pH變化,根據(jù)等電點(diǎn)的突變判斷滴定終點(diǎn)。
1.3.2 還原糖的測定
參照莫允煥等[12]的實(shí)驗(yàn)方法,用電位滴定法測定還原糖含量。
1.3.3 酒精度值的測定
樣品酒精度值測定采用蒸餾法,取發(fā)酵樣品100 mL,蒸餾水100 mL置于500 mL圓底燒瓶中,進(jìn)行冷凝回流蒸餾,收集前100 mL蒸餾液,用酒精計(jì)和溫度計(jì)分別測定蒸餾液的溫度和酒精度,根據(jù)溫度和酒精度參照酒精對照表查出酒精度[13]。
1.3.4 單寧含量的測定
參照李愛華等[14]的試驗(yàn)方法取2 mL樣品放入2個(gè)100 mL容量瓶中蒸餾水定容至100 mL,然后取稀釋后樣品4 mL加入2 mL 蒸餾水和 12 mL 濃HCl。將配置好的樣品分別等量放入2只試管(A、B)并蓋塞密閉,用錫箔紙包嚴(yán)避光。試管A:常溫下放置 30 min;試管 B:沸水浴 30 min 后冷至室溫;然后2只試管分別加入1 mL無水乙醇, 酶標(biāo)儀550 nm出測定試管A及B的樣品波長,試管A的吸光值記為A1,試管B的吸光值記為B1??倖螌幒坑?jì)算如公式(1)所示:
總單寧含量/(g·L-1)=(B1-A1)×19.33
(1)
1.3.5 總酚及花色苷的測定
參照李愛華等[14]的試驗(yàn)方法,通過紫外吸收法測定花色苷的含量。福林酚法測定樣品中總酚含量[15]。
1.3.6 感官評價(jià)
參照GB 15037—2006葡萄酒感官要求進(jìn)行評價(jià)[16]發(fā)酵結(jié)束由2位國家二級果露酒品評師、4位國家三級果露酒品評師、1位資深釀酒師、5位果酒發(fā)酵研究生,1位發(fā)酵實(shí)驗(yàn)員組成品評團(tuán)進(jìn)行品評去除一個(gè)最高分和一個(gè)最低分,得到平均分,然后對菌種進(jìn)行評價(jià)。
1.3.7 數(shù)據(jù)處理
采用Excel 2007、Graphpad 6.01及SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及作圖。
本土釀酒酵母發(fā)酵梅鹿輒葡萄酒過程中總酸含量的動態(tài)變化如圖1所示。
圖1 本土釀酒酵母發(fā)酵梅鹿輒葡萄酒過程中總酸含量的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of total acid in the process of fermenting Merlot wine by native Saccharomyces cerevisiae
由圖1可知,在發(fā)酵過程中總酸變化均呈先上升后下降再上升的變化趨勢。本土酵母與商業(yè)對照酵母整體趨勢相同,酒精發(fā)酵啟動開始到發(fā)酵前6 d,由于葡萄果實(shí)壓榨后浸漬和發(fā)酵過程中糖含量的減少,琥珀酸、蘋果酸、乙酸含量逐漸增加[17]。發(fā)酵6 d左右總酸含量達(dá)到最大值。酒精發(fā)酵6~12 d,酸度有所下降,因?yàn)榇穗A段酒精發(fā)酵基本結(jié)束,12~15 d時(shí)總酸含量稍微上升,主要由于發(fā)酵結(jié)束后酒石酸氫鉀在葡萄酒中過飽和存在,葡萄酒的酸穩(wěn)定主要還是與酒石酸氫鉀、酒石酸鈣的沉淀有關(guān)[18]??偹豳|(zhì)量濃度一般為5~7.5 g/L[19],發(fā)酵前梅鹿輒葡萄果汁中總酸質(zhì)量濃度為4.56 g/L,發(fā)酵結(jié)束后本土釀酒酵母WJ1和Q12總酸均質(zhì)量濃度分別為6.10和5.98 g/L,商業(yè)釀酒酵母總酸均質(zhì)量濃度為5.93~6.00 g/L。本土釀酒酵母和商業(yè)釀酒酵母均滿足發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn),且差異性不顯著。
在葡萄酒發(fā)酵過程中,酵母利用葡萄果實(shí)中的糖轉(zhuǎn)化為酒精,并利用葡萄原料中糖來完成自身的生長和繁殖。因此,糖含量直接影響酵母菌的繁殖與轉(zhuǎn)化功能,最終會影響葡萄酒的質(zhì)量。梅鹿輒葡萄酒發(fā)酵過程中還原糖變化如圖2所示。
圖2 本土釀酒酵母發(fā)酵梅鹿輒葡萄酒過程中還原糖含量的動態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of reducing sugar in fermentation of merlot wine by native Saccharomyces cerevisiae
葡萄酒發(fā)酵過程中的糖含量與葡萄酒酒精度呈顯著負(fù)相關(guān)性[20],即還原糖含量越少,酒精度含量越高。梅鹿輒葡萄酒酒精度變化結(jié)果如圖3所示。
圖3 本土釀酒酵母發(fā)酵梅鹿輒葡萄酒過程中酒精度的動態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of alcohol in the process of fermenting Merlot wine by native Saccharomyces cerevisiae
由圖2和圖3可知,梅鹿輒葡萄果汁中還原糖質(zhì)量濃度為204.41 g/L,在發(fā)酵0~9 d時(shí),商業(yè)釀酒酵母和本土釀酒酵母發(fā)酵液中的還原糖含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長而降低,發(fā)酵液中的酒精度隨發(fā)酵時(shí)間延長而增加。在發(fā)酵至9 d時(shí),發(fā)酵液中的殘?zhí)呛枯^少為3.33~4.68 g/L,酒精度基本穩(wěn)定在11.5%vol~12%vol。發(fā)酵時(shí)間為9~15 d時(shí),發(fā)酵液中的還原糖趨于平緩,發(fā)酵液中的糖和酒精只有微量變化。經(jīng)過15 d酒精發(fā)酵后,3株商業(yè)釀酒酵母發(fā)酵液中的還原糖含量為3.28~3.49 g/L,酒精度12.0%vol~12.1%vol,本土釀酒酵母WJ1的酵液中還原糖含量為3.33 g/L,顯著低于對照菌CK1,但與對照菌CK2、CK3差異不顯著。本土釀酒酵母Q12發(fā)酵液中還原糖含量為3.57 g/L,高于對照菌CK2、CK3,但與對照菌種CK1差異不顯著,本土釀酒酵母WJ1和Q12酒精度分別為12.2%vol、12%vol,與對照商業(yè)菌株差異不顯著。
利用2株本土釀酒酵母和3株對照菌株進(jìn)行梅鹿輒葡萄酒發(fā)酵,發(fā)酵過程中單寧動態(tài)變化如圖4所示。
圖4 本土釀酒酵母發(fā)酵梅鹿輒葡萄酒過程中單寧含量的動態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes of tannin in the process of fermenting Merlot wine by native Saccharomyces cerevisiae
由圖4可知,單寧含量在發(fā)酵過程中含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長而增加,是由于果實(shí)單寧含量被浸出加速單寧釋放[21]。梅鹿輒果汁中單寧質(zhì)量濃度62.51 g/L。酒精發(fā)酵過程中,單寧含量迅速增加,酒精發(fā)酵結(jié)束時(shí),單寧含量達(dá)到最大,且本土釀酒酵母與商業(yè)菌株趨勢相似。發(fā)酵結(jié)束后,本土釀酒酵母WJ1和Q12單寧質(zhì)量濃度分別為175.14、169.24 mg/L。商業(yè)釀酒酵母單寧質(zhì)量濃度在159.25~194.67 mg/L,WJ1單寧含量顯著高于對照菌株CK1,顯著低于CK3,與CK2差異不顯著。Q12單寧含量高于CK1低于CK2、CK3,且差異顯著。酵母產(chǎn)生的乙醛可參與形成花青素-乙醛-黃烷-3-醇衍生物,酵母發(fā)酵可加速果皮細(xì)胞壁分解作用,有利于改善葡萄酒的苦味、澀味和酒的顏色[22]。
花色苷主要存在于植物的細(xì)胞液中,是由花色素和葡萄糖以糖苷鍵結(jié)合形成的糖苷,使莖、葉、花和果實(shí)具有不同的顏色,因此對紅葡萄顏色的影響較大。它也是葡萄酒中抗氧化活性的主要物質(zhì)之一。梅鹿輒葡萄酒發(fā)酵過程中花色苷含量變化規(guī)律如圖5所示。
圖5 本土釀酒酵母發(fā)酵梅鹿輒葡萄酒過程中花色苷含量的動態(tài)變化Fig.5 Dynamic changes of anthocyanins in the process of fermenting Merlot wine by native Saccharomyces cerevisiae
由圖5可知,在0~9 d,發(fā)酵液中花色苷含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長而增加。由于葡萄皮中的花色苷類物質(zhì)在發(fā)酵前期被大量浸出,花色苷大幅度增加[23]。在酒精發(fā)酵過程中,不同種類的酵母也影響葡萄酒的組成。例如,酵母釋放的甘露糖蛋白加速單寧與花青素反應(yīng)并增加了總花色苷含量。發(fā)酵第9天時(shí),花色苷含量均到達(dá)最大值。WJ1Q12發(fā)酵的梅鹿輒葡萄酒中花色苷最大值分別為175.54、182.35 mg/L。商業(yè)釀酒酵母發(fā)酵液中花色苷質(zhì)量濃度為174.34~184.36 mg/L,本土釀酒酵母的發(fā)酵液中花色苷含量介于商業(yè)釀酒酵母發(fā)酵液花色苷含量的范圍內(nèi),且差異不顯著。而酒精發(fā)酵基本結(jié)束后的9~15 d花色苷含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長而下降。因?yàn)榛ㄉ諡樘烊皇秤蒙?,穩(wěn)定性不高,容易被氧化和分解。發(fā)酵結(jié)束后,對照菌株發(fā)酵液中花色苷質(zhì)量濃度為134.35~156.30 mg/L,本土釀酒酵母WJ1、Q12發(fā)酵液中花色苷質(zhì)量濃度為148.29、128.25 mg/L,WJ1發(fā)酵液中的花色苷含量高于CK1發(fā)酵液中的花色苷質(zhì)量濃度,低于CK2、CK3中發(fā)酵液的含量,且差異顯著,而Q12菌株發(fā)酵液中花色苷含量均低于對照菌株且差異顯著。
本土釀酒酵母發(fā)酵梅鹿輒葡萄酒過程中總酚含量的動態(tài)變化如圖6所示。
圖6 本土釀酒酵母發(fā)酵梅鹿輒葡萄酒過程中總酚含量的動態(tài)變化Fig.6 Dynamic changes of total phenol in the process of fermentation of merlot wine by native Saccharomyces cerevisiae
由圖6可知,不同釀酒酵母發(fā)酵液中的總酚在發(fā)酵過程中均呈逐漸上升的趨勢。葡萄中大量的酚類物質(zhì)存在于果皮和果梗中。葡萄與葡萄酒中的總酚,是葡萄與葡萄酒中多酚類物質(zhì)的總量[24]。葡萄發(fā)酵的浸漬過程使大量的多酚類物質(zhì)進(jìn)入葡萄酒[25]。影響葡萄顏色的主要因素是酚類物質(zhì)中的花青素,單寧也是葡萄中多酚物質(zhì)的主要成分。由于花色苷和單寧在動態(tài)變化中呈逐漸上升的趨勢,總酚在發(fā)酵過程中也呈上升的趨勢。梅鹿輒果實(shí)中總酚質(zhì)量濃度916.64 mg/L。發(fā)酵結(jié)束后,本土釀酒酵母WJ1和Q12發(fā)酵液中的總酚質(zhì)量濃度分別為2 070.78、2 063.12 mg/L,WJ1和Q12總酚質(zhì)量濃度差異不顯著,但均高于商業(yè)酵母CK1,低于商業(yè)酵母CK2、CK3,且差異顯著。商業(yè)釀酒酵母發(fā)酵液中的總酚質(zhì)量濃度為2 001.76~2 274.00 mg/L,本土釀酒酵母總酚含量均在商業(yè)釀酒酵母總酚含量范圍內(nèi),具有較好的釀造學(xué)品質(zhì)特性。
感官評價(jià)結(jié)果如圖7所示。本土釀酒酵母WJ1發(fā)酵的梅鹿輒葡萄酒13位專業(yè)人員平均得分78分,色澤與典型梅鹿輒葡萄酒色澤相近,略透明,具典型果香、酒香但略微不足,酸澀感較重,口感不夠柔順,酒體結(jié)構(gòu)感一般;Q12平均得分為68分,顏色與典型梅鹿輒葡萄酒色澤不符,略失光澤,果香不足,回味較短,酒體寡淡,酒體欠平衡,粗糙;商業(yè)釀酒酵母中CK1經(jīng)13位專業(yè)人員評價(jià)后平均得分最高為89分,色澤呈現(xiàn)紫紅色,有光澤,有明顯的果香和花香,香氣醇香濃郁,結(jié)構(gòu)感強(qiáng),優(yōu)雅,余味持續(xù)時(shí)間長,典型性突出;CK2發(fā)酵的梅鹿輒葡萄酒5位專業(yè)人員平均得分86分,色澤與典型梅鹿輒葡萄酒色澤相符,沒有懸浮物,透明,酒體豐滿,較CK1釀酒酵母相比,香氣略微遜色,酸澀味適中,苦味微淡,典型性明顯;商業(yè)釀酒酵母CK3發(fā)酵的梅鹿輒葡萄酒平均分為73分,葡萄酒顏色較淺,渾濁,略失光,香氣寡淡,回味較短,酒體不協(xié)調(diào)。
圖7 本土釀酒酵母與商業(yè)釀酒酵母發(fā)酵干紅的感官評定對照Fig.7 Comparison of sensory evaluation of dry red fermented by local and commercial Saccharomyces cerevisiae注:圖中不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)
結(jié)合感官評價(jià)結(jié)果,梅鹿輒葡萄酒的色澤、香氣、口感和典型性都受到不同釀酒酵母的影響,本土釀酒酵母WJ1和Q12與對照菌株CK1、CK2、CK3發(fā)酵的梅鹿輒葡萄酒比較發(fā)現(xiàn),本土釀酒酵母WJ1發(fā)酵液具典型果香、酒香但略微不足,酸澀味略重,不柔和,酒體結(jié)構(gòu)一般,但澄清度、色澤、香氣優(yōu)于商業(yè)釀酒酵母CK2發(fā)酵液。本土釀酒酵母Q12發(fā)酵梅鹿輒葡萄酒的澄清度、香氣、滋味和典型性都不及商業(yè)釀酒酵母,色澤受釀酒酵母甘露糖蛋白對酚類物質(zhì)的影響,發(fā)酵香是酵母菌代謝的副產(chǎn)物,這與釀酒酵母的發(fā)酵能力有重要的關(guān)系,口感是香氣、酸、澀、苦等滋味的綜合評價(jià)結(jié)果[26-27]。綜上所述,本土釀酒酵母WJ1可作為商業(yè)酵母用于發(fā)酵梅鹿輒葡萄酒,而Q12有待于進(jìn)一步開發(fā)。
通過采用本土釀酒酵母與商業(yè)釀酒酵母發(fā)酵梅鹿輒干紅葡萄酒并測定發(fā)酵過程及終點(diǎn)的總酸、殘?zhí)恰⒕凭?、花色苷、單寧和總酚含量,及發(fā)酵結(jié)束感官評價(jià)。結(jié)果顯示,在梅鹿輒葡萄酒發(fā)酵過程中,本土釀酒酵母WJ1發(fā)酵液總酸和酒精度含量略高,但與商業(yè)酵母無太大差別;Q12發(fā)酵液中還原糖含量略高于商業(yè)釀酒酵母發(fā)酵液,花色苷含量略低,其他指標(biāo)與商業(yè)釀酒酵母發(fā)酵液無太大差別,本土釀酒酵母WJ1發(fā)酵液具典型果香、酒香但略微不足,酸澀味略重,不柔和,酒體結(jié)構(gòu)一般,但澄清度、色澤、香氣優(yōu)于商業(yè)釀酒酵母CECA發(fā)酵液。本土釀酒酵母Q12色澤與典型梅鹿輒葡萄酒色澤不符,略失光澤,果香不足,回味較短,酒體寡淡,酒體欠平衡,粗糙,澄清度、香氣、滋味和典型性都不及商業(yè)釀酒酵母。通過與商業(yè)菌株對比研究得到的2株本土酵母Q12、WJ1,經(jīng)過后期馴化有望為我國葡萄酒釀造提供新的本土菌種,同時(shí)為本土釀酒酵母多樣性研究提供理論依據(jù)。