朱秀靈，葉精勤，盛伊健，孔雯瑾，陳廷然，傅錫鵬，戴清源

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖，241000)

植物多酚是植物次級(jí)代謝產(chǎn)物的主要成分也是膳食中主要的抗氧化劑[1]，在胃腸消化過(guò)程中，由于食物基質(zhì)、pH、溫度、吸收抑制劑、吸收促進(jìn)劑、酶、宿主及其他相關(guān)因素的影響，其物理化學(xué)性質(zhì)、穩(wěn)定性和抗氧化活性均可發(fā)生變化[1]。由于體外消化模型不僅價(jià)格便宜、操作簡(jiǎn)單、條件可控、采樣容易、結(jié)果可重復(fù)、不存在道德限制[2]，而且對(duì)生物利用度的評(píng)價(jià)結(jié)果與人體或動(dòng)物模型相吻合[1]，因此，體外消化模型已被廣泛用于預(yù)測(cè)酚類化合物在胃腸消化過(guò)程中的穩(wěn)定性、抗氧化活性及其生物利用度[3-8]。

蘋果是我國(guó)也是世界上種植最廣泛、消費(fèi)量最大的水果之一[1, 9]，通常以鮮果或其加工品如蘋果干、蘋果醬、蘋果汁及蘋果酒等形式在市場(chǎng)上供應(yīng)。蘋果富含膳食纖維和酚類化合物，大量食用，可降低患慢性疾病(如肺癌、哮喘和心血管疾病)的風(fēng)險(xiǎn)[1, 9-11]。蘋果中含量最高的酚類化合物是槲皮素(以糖基化形式存在)、兒茶素和表兒茶素，它們是澀味和苦味的重要成分[9]。此外，蘋果還含有以酯化形式存在的咖啡酸、奎寧酸(綠原酸)和對(duì)香豆酸。蘋果皮富含二氫查耳酮類物質(zhì)如葉綠素及其葡萄糖苷形式存在的根皮苷[9]。由于蘋果品種不同、多酚類物質(zhì)存在部位、提取方法及檢測(cè)手段的不同，蘋果多酚類物質(zhì)的主要酚類成分及其含量也不盡相同，在機(jī)體消化過(guò)程中，再加上食品基質(zhì)的影響，更加難于確定給定劑量的蘋果原料在體外消化過(guò)程中多酚類物質(zhì)的變化情況及其與抗氧化活性之間的相關(guān)性。

為此，本研究首先提取蘋果中的多酚類物質(zhì)，以富集多酚成分的提取物為研究對(duì)象，通過(guò)體外消化模型，探討多酚提取物在不同消化階段主要酚類物質(zhì)及其抗氧化活性的變化情況和相關(guān)性。研究結(jié)果為多酚類物質(zhì)的生物利用度及生物活性評(píng)價(jià)提供了參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮紅富士蘋果，購(gòu)于當(dāng)?shù)卮鬂?rùn)發(fā)超市；胃蛋白酶、膽汁提取物、福林酚試劑，BR級(jí)，購(gòu)于上海瑞永生物科技有限公司；胰蛋白酶，BR級(jí)，購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；原花青素、兒茶素、表兒茶素、綠原酸、咖啡酸、槲皮素、根皮素等標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)，梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2,2′-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid ammonium salt，ABTS)、2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪(2,4,6-Tri (2-pyridyl)-s-triazien，TPTZ)、奎諾二甲基丙烯酸酯(6-hydroxy- 2, 5, 7, 8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid，Trolox)，2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽 (2,2′-Azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride，AAPH)、熒光素，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

L3S型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；JK-400CDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器，合肥市金尼克機(jī)械制造有限公司；ZFD-A5140型鼓風(fēng)干燥箱，上海智城分析儀器制造有限公司；TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；FD8-3型冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Sim International Group公司；Prominence LC-20A型高效液相色譜儀，日本島津；SI-114型電子天平，美國(guó)DENVER INSTRUMENT公司；M5型酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蘋果原料處理

將一定量的新鮮蘋果經(jīng)清洗、干燥后切成條狀，于沸水中熱燙2～3 min，撈出瀝干，平鋪于干燥箱托盤上，于85 ℃熱風(fēng)干燥至恒重，粉碎，過(guò)100目篩，即得到蘋果粉。稱取20 g蘋果粉于500 mL錐形瓶中，按料液比1∶20(g∶mL)加入體積分?jǐn)?shù)50%乙醇，進(jìn)行超聲提取(超聲功率400 W、超聲溫度控制在50 ℃以下，超聲時(shí)間30 min)[12]，抽濾，收集濾液，將濾液經(jīng)真空濃縮、凍干，即得到蘋果多酚提取物，-20 ℃存放備用。

1.3.2 體外消化

蘋果多酚提取物體外消化，參照文獻(xiàn)[1]、[8]、[13-16]報(bào)道方法，并修改如下：

(1)模擬胃消化 準(zhǔn)確稱量40 mg胃蛋白酶，用0.1 mol/L HCl溶液定容到10 mL，配制成4 mg/mL胃蛋白酶溶液。稱取90 mg NaCl用蒸餾水溶解并定容到10 mL，即得到9 mg/mL NaCl溶液。稱量蘋果多酚提取物2.5 g，加蒸餾水溶解并定容到10 mL。取3 mL多酚溶液，加入6 mL 9 mg/mL NaCl溶液和6 mL 4 mg/mL胃蛋白酶溶液，用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2.0，取2.00 mL作為胃消化0 h樣品。其余溶液置于37 ℃恒溫振蕩箱中培養(yǎng)1 h，取2.00 mL溶液作為胃消化1 h樣品，剩余部分的胃消化液采用1 mol/L NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.0，用于腸消化。

(2)模擬腸消化 準(zhǔn)確稱量20 mg胰蛋白酶和120 mg膽酸鹽，用0.1 mol/L NaHCO3溶液分別定容至10 mL，得到2 mg/mL胰液和12 mg/mL膽汁。將胰液和膽汁溶液按體積比1∶1混合均勻，制得胰液-膽汁混合液。用移液管分別移取5份每份2.00 mL胃消化1 h的樣液(預(yù)先調(diào)節(jié)pH至7.0)至5個(gè)10.0 mL具塞試管中，分別加入4.0 mL胰液-膽汁混合液，并采用0.1 mol/L NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.0，置于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在0、1.0、2.0、3.0和4.0 h各取出1管，作為腸消化0、1.0、2.0、3.0和4.0 h的樣品，為了確保酚類化合物的穩(wěn)定及抑制胰蛋白酶活性，采用6 mol/L HCl調(diào)節(jié)樣品pH至2.0。

以不含多酚提取物的溶液作為空白對(duì)照，按照多酚提取物體外消化的方法進(jìn)行操作，按時(shí)取樣。將不同消化階段的消化液分別離心(4 500 r/min，10 min)，棄沉淀，上清液于-20 ℃存放備用。

1.3.3 總酚含量測(cè)定

總酚含量(total phenolic content，TPC)的測(cè)定采用福林酚法，參照文獻(xiàn)[1]、[17-18]并修改如下：以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，以溶解多酚提取物的溶劑或者經(jīng)過(guò)胃消化或腸消化的空白溶液溶解沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，配成質(zhì)量濃度為0～100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別量取1.0 mL不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液置于不同的試管中，再分別加入5.0 mL 10%福林酚試劑，搖勻反應(yīng)6 min，然后加入4.0 mL 7.5% Na2CO3溶液，用相應(yīng)的溶劑定容，搖勻，避光常溫靜置60 min，于766 nm處測(cè)定吸光度。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用同樣的方法，分別測(cè)定不同消化階段樣品溶液的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中總酚含量，結(jié)果以每克多酚提取物(以干基計(jì))所含的沒(méi)食子酸(GAE)的毫克數(shù)表示。

1.3.4 HPLC檢測(cè)主要酚類物質(zhì)

量取消化前后的樣品溶液各1 mL，4 500 r/min離心10 min，棄沉淀，上清液加入3倍體積的甲醇，手動(dòng)攪拌5 min，離心(4 500 r/min，10 min)，棄沉淀，將上清液過(guò)0.22 μm濾膜，采用日本島津Prominence LC-20A高效液相色譜儀檢測(cè)上清液中多酚成分。色譜條件：Omsi Sype C18柱(250 mm× 4.6 mm，5 μm)，保護(hù)柱(ChrmSEP 1 cm×3 mm)。流動(dòng)相A相為0.1%磷酸、B相為體積分?jǐn)?shù)100%甲醇。梯度洗脫為5%B(0 min)，25%B(0～5 min)，34%B(5～14 min)，37%B(14～25 min)，40%B(25～30 min)，49%B(30～34 min)，50%B(34～35 min)，51%B(35～58 min)，55%B(58～60 min)，80%B(60～62 min)，保持在80%B(62～65 min)，降至5%B(65～67 min)，維持在5%B(67～72 min)。流量為0.8 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。以綠原酸、表兒茶素、兒茶素、咖啡酸、原花青素、根皮素、槲皮素為標(biāo)準(zhǔn)品，混標(biāo)進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到各標(biāo)準(zhǔn)品的線性方程，根據(jù)線性方程，計(jì)算得出不同消化階段消化液中的主要酚類物質(zhì)含量，結(jié)果以每毫升消化液所含的對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的毫克數(shù)表示。

1.3.5 抗氧化活性

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力

參照文獻(xiàn)[19]并修改如下：準(zhǔn)確稱取2.4 mg DPPH，用無(wú)水乙醇溶解并定容至50 mL，得到濃度為48 mg/L DPPH貯備液，-20 ℃避光保存。向測(cè)試管1中加入2.00 mL 48 mg/L DPPH溶液和1.00 mL待測(cè)樣品，搖勻，避光反應(yīng)30 min，用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定517 nm處的吸光度(即為待測(cè)樣品的吸光度AS)。向測(cè)試管2中加入2.00 mL DPPH溶液和1.00 mL無(wú)水乙醇，搖勻，避光反應(yīng)30 min，測(cè)定517 nm處的吸光度(即為初始溶液的吸光度A0)。向待測(cè)樣品管中加入待測(cè)樣品1.0 mL和2.00 mL無(wú)水乙醇，搖勻，避光反應(yīng)30 min，測(cè)定517 nm處的吸光度值(即為參比溶液的吸光度Ar)。樣品對(duì)DPPH自由基清除率(IDPPH，%)按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：IDPPH，DPPH自由基清除率，%；A0，初始溶液的吸光度；Ar，參比溶液的吸光度；As，待測(cè)溶液的吸光度。

1.3.5.2 ABTS自由基清除能力

參照文獻(xiàn)[20-22]方法，稱取96.0 mg ABTS，用去離子水溶解并定容至25 mL，配制成7 mmol/L ABTS溶液；稱取16.6 mg過(guò)硫酸鉀，用去離子水溶解并定容至25 mL，配制成2.45 mmol/L溶液；按體積比2∶1將ABTS溶液和過(guò)硫酸鉀溶液混合，黑暗中靜置12～16 h，以形成穩(wěn)定的ABTS自由基陽(yáng)離子(ABTS+·)，此溶液即為ABTS+·儲(chǔ)備液。使用前用去離子水將ABTS+·儲(chǔ)備液稀釋使其在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度值為(0.700 ± 0.02)。然后量取2.9 mL ABTS+·稀釋液與0.1 mL胃腸消化不同時(shí)間樣液混合，于黑暗處30 ℃反應(yīng)10 min，在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。以去離子水為空白對(duì)照。則樣品對(duì)ABTS自由基清除率(IABTS，%)按公式(2)計(jì)算：

(2)

式中：IABTS，ABTS自由基清除率，%；AB，空白對(duì)照溶液的吸光度；AS，待測(cè)樣品溶液的吸光度。

1.3.5.3 鐵離子還原能力(ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP)

參照文獻(xiàn)[23-24]方法，首先配制溶液：乙酸鈉緩沖溶液(300 mmol/L，pH 3.6)的配制：稱取1.55 g三水合乙酸鈉，用適量去離子水溶解并轉(zhuǎn)移到500 mL容量瓶中，加入8 mL乙酸，然后再補(bǔ)加去離子水至刻度，混勻；10 mmol/L TPTZ溶液：稱取156 mg TPTZ，用40 mmol/L HCl溶解并定容至50 mL，混勻；20 mmol/L FeCl3·6H2O溶液的配制：稱取270 mg FeCl3·6H2O，加入去離子水溶解并定容至50 mL，混勻；FRAP試劑的配制：將乙酸鈉緩沖溶液、TPTZ溶液和FeCl3·6H2O溶液，按照體積比10∶1∶1混勻配制而成。然后，將2 850 μL FRAP試劑(預(yù)熱至37 ℃)和150 μL胃腸消化不同時(shí)間樣液混合，室溫暗處反應(yīng)30 min，于593 nm處測(cè)定吸光度。以去離子水作為空白對(duì)照，以Trolox為參照，結(jié)果以每毫克多酚提取物(以干基計(jì))所對(duì)應(yīng)的Trolox當(dāng)量表示(μmol Trolox/mg)。

1.3.5.4 氧自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)

將胃腸消化不同時(shí)間樣品溶液(各1 mL)，離心(4 500 r/min，10 min)，棄沉淀，上清液冷凍干燥，然后參照文獻(xiàn)[25]方法測(cè)定氧自由基吸收能力。方法如下：采用75 mmol/L pH 7.4 磷酸鹽緩沖溶液溶解熒光素并配制成120 μmol/L熒光素儲(chǔ)備液，在4 ℃存放，使用前再稀釋100倍。將凍干樣品分別采用75 mmol/L pH 7.4 磷酸鹽緩沖溶液溶解并配制成6 mg/mL溶液，各取20 μL樣品溶液和120 μL 1.2 μmol/L 熒光素加入到黑色96孔酶標(biāo)板中，混合均勻，于37 ℃保溫15 min。然后每孔內(nèi)快速加入60 μL 12 mmol/L AAPH溶液，酶標(biāo)儀讀取每孔的熒光值，每隔1 min讀數(shù)1次，測(cè)定80 min。整個(gè)測(cè)試過(guò)程中酶標(biāo)儀溫度控制在37 ℃，激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別設(shè)定為485 nm和530 nm。以75 mmol/L pH 7.4 磷酸鹽緩沖溶液作為空白對(duì)照，以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品。按公式(3)計(jì)算待測(cè)樣品熒光強(qiáng)度曲線下方的面積(AUCSample)及空白對(duì)照熒光強(qiáng)度曲線下方的面積(AUCBlank)，按公式(4)計(jì)算待測(cè)樣品熒光強(qiáng)度曲線下方的凈面積。以標(biāo)準(zhǔn)品Trolox濃度及其熒光衰減曲線下方的凈面積建立回歸方程，待測(cè)樣品的ORAC值通過(guò)回歸方程計(jì)算，結(jié)果以每毫克多酚提取物(以干基計(jì))所對(duì)應(yīng)的Trolox當(dāng)量表示(μmol Trolox/mg)。

(3)

AUCNet=AUCSample-AUCBlank

(4)

式中：F0，時(shí)間為0 min時(shí)的熒光強(qiáng)度；Fi，時(shí)間為第imin 時(shí)的熒光強(qiáng)度；AUC，待測(cè)樣品在時(shí)間imin內(nèi)熒光衰減曲線下方的面積；AUCNet，待測(cè)樣品在時(shí)間imin內(nèi)熒光衰減曲線下方的凈面積。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation，SD)表示。運(yùn)用SPSS version 17.0 軟件分析不同處理間的差異顯著性。運(yùn)用Excel 2007中的Correl函數(shù)計(jì)算總酚含量與以DPPH、ABTS、FRAP和ORAC法測(cè)定的抗氧化活性之間的相互關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外模擬消化過(guò)程中總酚含量的變化

以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用福林酚法測(cè)定總酚含量，線性方程為Y=0.115 1X+0.002 5，R2=0.997 3，線性范圍為0～100 mg/L。根據(jù)線性方程，計(jì)算不同消化階段樣品中的總酚含量，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，消化前樣品中的總酚含量最高，經(jīng)過(guò)胃消化(胃消化0、0.5、1 h相比)，總酚含量顯著增加，與文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致，但在腸消化過(guò)程中，總酚含量先增加而后減少，且胃腸消化過(guò)程中總酚含量均低于消化前樣品，說(shuō)明胃腸消化導(dǎo)致多酚降解或者轉(zhuǎn)化，與文獻(xiàn)[1]報(bào)道一致。胃消化0.5 h時(shí)總酚含量顯著高于胃消化0 h的含量，可能是因?yàn)槲赶缸饔眉捌鋸?qiáng)酸環(huán)境，使部分結(jié)合態(tài)酚分解釋放出游離態(tài)酚，從而使可測(cè)定的總酚含量增加；此后，直至胃消化1 h，總酚含量略有下降，可能與胃消化酶活性被抑制使游離態(tài)酚釋放量減少有關(guān)。在腸消化初始階段(0 h)，總酚含量突然降低，這是由于腸消化液的加入，對(duì)多酚起到稀釋作用，此外，pH值上升，酸堿環(huán)境改變，導(dǎo)致可測(cè)的多酚含量降低。此后，直至腸消化2 h，總酚含量基本保持不變。在腸消化3 h時(shí)，總酚含量又突然增加，可能與腸消化酶作用有關(guān)，腸消化酶使底物中的結(jié)合態(tài)酚分解，釋放游離態(tài)酚，因此總酚含量增加。此后，總酚含量開(kāi)始減少，其原因可能是胰酶活性降低，結(jié)合態(tài)酚分解減慢，也可能是游離態(tài)酚轉(zhuǎn)化為其他化合物，從而使游離態(tài)酚含量減少。在胃腸消化過(guò)程中，腸消化液中總酚含量低于胃消化液中的含量，說(shuō)明胃腸消化降低了蘋果多酚提取物中的總酚含量。

表1 體外不同消化階段消化液中總酚含量Table 1 Total phenolic content at different digestion stages in vitro

注：不同字母表示在相同消化液中消化不同時(shí)間，差異顯著(P<0.05)

2.2 體外模擬消化過(guò)程中抗氧化活性變化

2.2.1 DPPH自由基清除能力

體外模擬消化過(guò)程中DPPH自由基清除率的變化如圖1所示。由圖1可知，消化前樣品對(duì)DPPH自由基清除率為(37.24±1.63)%，胃消化0 h和1 h、腸消化2 h和4 h時(shí)DPPH自由基清除率分別為(74.17±1.40)%，(68.57±1.25)%，(88.81±2.95)%和(80.84±2.22)%。當(dāng)胃消化0 h和1 h時(shí)，蘋果多酚對(duì)DPPH自由基清除率分別是消化前樣品的1.99倍和1.84倍；在腸消化2 h和4 h時(shí)，DPPH自由基清除率分別是消化前樣品的2.38倍和2.17倍。在腸消化2 h時(shí)DPPH自由基清除率最大。

與消化前樣品相比，胃消化0 h時(shí)，DPPH自由基清除率顯著增加，可能是由于胃消化液的強(qiáng)酸性環(huán)境，促使某些結(jié)合態(tài)酚分解釋放出游離態(tài)酚，增強(qiáng)了對(duì)DPPH自由基的清除能力。在胃消化1 h時(shí)，DPPH自由基清除能力略有下降，可能是游離酚降解或轉(zhuǎn)化為其他成分。在腸消化2 h時(shí)，DPPH自由基清除率最大，這是由于腸消化液中消化酶的作用，使得結(jié)合態(tài)酚分解釋放出游離態(tài)酚。在腸消化4 h時(shí)，DPPH自由基清除率顯著下降，可能是因?yàn)榉磻?yīng)體系中易被氧化的多酚類物質(zhì)發(fā)生降解或轉(zhuǎn)化，從而使得DPPH自由基清除率降低。

因此，經(jīng)過(guò)胃腸消化，蘋果多酚提取物對(duì)DPPH自由基清除率顯著提高，說(shuō)明胃腸消化增強(qiáng)了蘋果多酚提取物的抗氧化活性，這與JAYAWARDENA等[15]報(bào)道不一致，JAYAWARDENA等[15]發(fā)現(xiàn)胃腸消化不一定增強(qiáng)蘋果汁對(duì)DPPH自由基的清除效果。

2.2.2 ABTS自由基清除能力

不同消化階段蘋果多酚提取物對(duì)ABTS自由基清除能力如圖1所示。與消化前樣品相比，胃消化和腸消化均顯著提高蘋果多酚提取物對(duì)ABTS自由基清除能力(P<0.05)。在胃消化階段，ABTS自由基清除率逐漸增加但效果不顯著(P>0.05)；與胃消化相比，腸消化階段ABTS自由基清除率顯著增加，在腸消化2 h時(shí)，ABTS自由基清除率最高為(84.31±3.51)%，約是消化前樣品的1.95倍，再隨著腸消化時(shí)間延長(zhǎng)，ABTS自由基清除率反而顯著下降，這與QUAN等[26]報(bào)道一致。其原因可能是從胃消化到腸消化pH值的改變導(dǎo)致多酚類化合物的結(jié)構(gòu)變化，從而降低對(duì)自由基的清除能力[26]。據(jù)報(bào)道，蘋果多酚在較低的pH條件下顯示出較強(qiáng)的抗氧化能力，在較高的pH條件下被氧化成醌，清除自由基能力下降[26]。此外，消化酶(蛋白質(zhì))可能通過(guò)氫鍵、共價(jià)鍵、疏水相互作用與多酚鍵合，從而影響多酚的抗氧化能力[22, 26]。

圖1 體外模擬消化過(guò)程中DPPH和ABTS自由基清除率的變化Fig.1 Changes of DPPH and ABTS radical scavenging rates during in vitro simulated digestion注：不同大小寫字母分別表示ABTS和DPPH自由基清除率差異顯著(P < 0.05)(下同)

2.2.3 鐵離子還原能力

如圖2所示，與消化前樣品相比，體外模擬胃消化能夠顯著提高蘋果多酚提取物的鐵離子還原能力(P< 0.05)，在胃消化1 h時(shí)，F(xiàn)RAP達(dá)到最大值為(4.25±0.13) μmol Trolox/mg。但是當(dāng)蘋果多酚提取物由胃消化進(jìn)入腸消化后，F(xiàn)RAP值呈顯著性下降趨勢(shì)，說(shuō)明蘋果多酚提取物對(duì)鐵離子的還原能力隨著腸消化時(shí)間延長(zhǎng)顯著下降，這一現(xiàn)象與BOUAYED等[1]報(bào)道一致。鐵離子還原能力在腸消化階段顯著下降，可能與腸消化階段多酚濃度低有關(guān)，也可能與pH值有關(guān)[1]。根據(jù)鐵離子還原能力測(cè)定方法，可以得知pH 3.6是FRAP值測(cè)定的合適條件，胃消化液pH 2.0與pH 3.6較接近，而腸消化液pH 7.0與pH 3.6偏離較遠(yuǎn)，由此推測(cè)，pH值的改變可能是導(dǎo)致腸消化階段FRAP值顯著下降的原因之一[1]。

2.2.4 氧自由基吸收能力

胃腸消化過(guò)程中氧自由基吸收能力變化如圖2所示。胃腸消化后溶液的ORAC值顯著高于消化前樣品(P< 0.05)，在胃消化1 h時(shí)，ORAC值最大，最大值為(4.77±0.19) μmol Trolox/mg。由胃消化進(jìn)入到腸消化時(shí)，ORAC值顯著降低，可能是由于pH值改變及消化酶作用，導(dǎo)致酚類物質(zhì)不穩(wěn)定發(fā)生降解或轉(zhuǎn)化，從而降低其抗氧化活性。但在腸消化階段隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，ORAC值下降并不明顯(P>0.05)。

圖2 體外模擬消化過(guò)程中FRAP值和ORAC值的變化Fig.2 Changes of FRAP and ORAC values during in vitro simulated digestion

2.3 總酚含量與抗氧化活性之間的相關(guān)性

利用Excel 2007中的correl函數(shù)，分別對(duì)消化前樣品、胃消化0 h和1 h、腸消化2 h和4 h樣品的總酚含量與DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、ORAC值及FRAP值之間的相互關(guān)系進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果以絕對(duì)值表示見(jiàn)表2，其絕對(duì)值越接近于1，說(shuō)明兩者相關(guān)性越強(qiáng)，其絕對(duì)值越小，說(shuō)明兩者之間相關(guān)性小或不相關(guān)。

表2 總酚含量及抗氧化活性之間的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between total phenolic content and antioxidant activities

由表2可知，總酚含量與以DPPH、ABTS及ORAC法測(cè)定的抗氧化活性高度相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.933 7、0.851 3和0.747 6；總酚含量與FRAP值之間相關(guān)系數(shù)為0.504 7，說(shuō)明兩者之間相關(guān)性不高；DPPH與ABTS之間相關(guān)系數(shù)為0.960 8，表明兩者高度相關(guān)(如圖1所示)；ORAC與DPPH、與ABTS之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.687 8和0.785 7，說(shuō)明相關(guān)性高；FRAP與TPC、DPPH、ABTS及ORAC之間的相關(guān)系數(shù)均低于0.60，說(shuō)明FRAP值與總酚含量及其他方法測(cè)定的抗氧化活性之間相關(guān)性不高。PODSEDEK等[27]研究發(fā)現(xiàn)總酚含量與抗氧化活性(以ABTS和FRAP法測(cè)定)之間的相關(guān)系數(shù)大于0.97，說(shuō)明總酚含量與抗氧化活性高度相關(guān)。本研究中總酚含量與ABTS法測(cè)定的抗氧化活性相關(guān)性較高，但與FRAP測(cè)定的抗氧化活性相關(guān)性不高，這與PODSEDEK等[27]報(bào)道不完全一致。JAYAWARDENA等[15]報(bào)道總酚含量與ORAC、FRAP、DPPH、ABTS之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.975、0.893、0.821、0.752，DUDONNE等[20]報(bào)道總酚含量與ABTS、DPPH、FRAP、ORAC相關(guān)系數(shù)依次為0.966、0.939、0.906和0.831，而本研究發(fā)現(xiàn)總酚含量與不同方法測(cè)定的抗氧化活性按照相關(guān)系數(shù)由高到低依次為DPPH(0.933 7)、ABTS(0.851 3)、ORAC(0.747 6)及FRAP(0.504 7)。由此看出，總酚含量與抗氧化活性之間的相關(guān)性，除了與抗氧化活性的測(cè)定方法有關(guān)[15]，還可能與酚類物質(zhì)的來(lái)源、主要酚類成分、游離或結(jié)合狀態(tài)等有關(guān)。

2.4 體外模擬消化過(guò)程中主要酚類物質(zhì)的變化

圖3-a為標(biāo)準(zhǔn)品綠原酸、兒茶素、表兒茶素、咖啡酸、原花青素，槲皮素和根皮素的高效液相色譜圖，分別對(duì)應(yīng)峰1～7，其保留時(shí)間分別為19.391、19.865、21.242、22.351、25.858、53.275、56.142 min。圖3-b～圖3-f分別為消化前樣品、胃消化0 h、胃消化1 h、腸消化 2 h和4 h的樣品的高效液相色譜圖。

a-標(biāo)準(zhǔn)品;b-消化前樣品;c-胃消化0 h;d-胃消化1 h;e-腸消化2 h;f-腸消化4 h峰1～7分別對(duì)應(yīng)綠原酸、兒茶素、表兒茶素、咖啡酸、原花青素、槲皮素和根皮素圖3 胃腸消化液及標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖Fig.3 High performance liquid chromatogram of gastrointestinal digestive juice and standards

由圖3可知，綠原酸是蘋果多酚提取物中的主要成分，在胃腸消化液中均可檢出，其峰面積及峰高均隨著消化進(jìn)程(消化前→胃消化→腸消化)顯著性下降；兒茶素在消化前樣品中未被檢出，在胃消化的初始階段(0 h)及胃消化1 h時(shí)，均檢測(cè)到兒茶素色譜峰，可能是由于胃消化液pH值較低的強(qiáng)酸性環(huán)境使蘋果多酚提取物中其他成分轉(zhuǎn)化為兒茶素，但隨著腸消化液pH值升高，兒茶素分子又轉(zhuǎn)化為其他成分，所以在腸消化液中未檢出兒茶素。表兒茶素和咖啡酸在消化前樣品及胃消化液中均可檢測(cè)到色譜峰，在腸消化液中未檢測(cè)到，說(shuō)明胃腸消化也影響其分子存在形式；原花青素僅在消化前樣品中檢測(cè)到色譜峰，說(shuō)明原花青素不穩(wěn)定，在胃腸消化中容易降解或轉(zhuǎn)化。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間，初步判斷不同消化階段樣品中多酚成分；以標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)、以濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各標(biāo)準(zhǔn)品的線性方程，根據(jù)消化液中多酚對(duì)應(yīng)的峰面積，由線性方程計(jì)算消化液中主要酚類物質(zhì)的含量(表3)。

由表3可知，消化前樣品中綠原酸含量最高為(285.46±20.55) μg/mL，其次為原花青素(19.60±1.26) μg/mL、表兒茶素(17.92±5.02) μg/mL和咖啡酸(12.60±3.73) μg/mL。兒茶素、槲皮素及根皮素在消化前樣品未檢測(cè)到，說(shuō)明蘋果多酚提取物不含有兒茶素、槲皮素及根皮素，或因其含量較低未被檢出。

表3 不同消化階段消化液中主要酚類物質(zhì)含量 單位：μg/mLTable 3 The content of main phenolic components in digestive juice at different digestion stages

注：同一行中不同字母表示差異顯著(P<0.05)，-表示未檢出

由表3還可以看出，蘋果多酚提取物在胃腸消化過(guò)程中主要酚類物質(zhì)的含量發(fā)生顯著性變化，經(jīng)胃腸消化后，僅能檢測(cè)出綠原酸，其含量由消化前(285.46±20.55) μg/mL減少到(16.24±4.55) μg/mL。BOUAYED等[28]報(bào)道綠原酸是蘋果多種含量最高的酚類物質(zhì)(11.8～16.3 mg/100g)，其次，因蘋果品種不同，可能是表兒茶素(4.8～7.8 mg/100g)也可能是原花青素(5.0～7.1 mg/100g)；在胃消化和腸消化過(guò)程中綠原酸含量急劇減少，表兒茶素和咖啡酸在胃消化液中含量均較低，在腸消化液中其含量更低甚至檢不出含量，原花青素在腸消化液中未檢出。由此看出，本研究中主要酚類物質(zhì)含量高低及在胃腸消化過(guò)程中的變化趨勢(shì)與BOUAYED等[28]報(bào)道相一致。

由圖3和表3可知，蘋果多酚提取物中主要酚類物質(zhì)在胃腸消化過(guò)程中不穩(wěn)定，會(huì)發(fā)生降解或轉(zhuǎn)化。與腸消化相比，胃消化過(guò)程中強(qiáng)酸性環(huán)境在一定程度上抑制酚類物質(zhì)的降解，這一現(xiàn)象與文獻(xiàn)[29]報(bào)道一致。

由表1不同消化液中總酚含量及表3不同消化液中主要酚類物質(zhì)的含量，可以看出，總酚含量高于主要酚類物質(zhì)的含量之和，說(shuō)明胃腸消化液中存在一定量的不同于研究中所使用的標(biāo)準(zhǔn)品的酚類物質(zhì)，或許是這些標(biāo)準(zhǔn)品的降解或轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。由圖1和圖2可以看出胃腸消化后抗氧化能力顯著高于消化前樣品，說(shuō)明蘋果多酚提取物經(jīng)過(guò)胃腸消化產(chǎn)生了抗氧化物質(zhì)，這些抗氧化物質(zhì)并不是這幾種給定的標(biāo)準(zhǔn)品，胃腸消化后抗氧化能力的增強(qiáng)歸因于胃腸消化后新生成的抗氧化成分。由此可知，胃腸消化使蘋果多酚提取物中主要酚類物質(zhì)發(fā)生降解或轉(zhuǎn)化，同時(shí)產(chǎn)生新的抗氧化成分，這些新的抗氧化成分有待于進(jìn)一步探討。

3 結(jié)論

蘋果多酚是膳食中抗氧化劑的主要成分，本研究采用體外消化模型探討蘋果多酚提取物在胃腸消化過(guò)程中總酚含量、主要酚類物質(zhì)含量、DPPH和ABTS自由基清除能力、鐵離子還原能力以及氧自由基吸收能力。結(jié)果表明，胃消化液中總酚含量隨著消化時(shí)間延長(zhǎng)而增加，腸消化液中總酚含量隨著消化時(shí)間延長(zhǎng)先增加后減少，但均低于消化前樣品中的含量；胃消化液中可檢測(cè)的主要酚類物質(zhì)按照含量由高到低依次為綠原酸、表兒茶素、咖啡酸、兒茶素；腸消化液中可檢測(cè)的主要酚類物質(zhì)為綠原酸；胃腸消化使主要酚類物質(zhì)發(fā)生降解或轉(zhuǎn)化；胃腸消化增強(qiáng)了蘋果多酚提取物對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基清除能力、鐵離子還原能力以及氧自由基吸收能力；相關(guān)性分析表明，總酚含量與以DPPH、ABTS、ORAC法測(cè)定的抗氧化活性之間高度相關(guān)，與以FRAP法測(cè)定的抗氧化活性相關(guān)性不高。

植物多酚是植物次級(jí)代謝產(chǎn)物中的一大類物質(zhì)，具有8 000多種化合物[28]，由于品種類型、存在部位、含量高低、提取方法、檢測(cè)方法、操作技術(shù)等的不同，在分析檢測(cè)時(shí)僅僅依據(jù)現(xiàn)有的幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。此外，在胃腸消化時(shí)，由于酸堿穩(wěn)定性、與消化酶的相互作用及食品基質(zhì)的影響，酚類物質(zhì)的存在形式及其生物活性可能發(fā)生很大變化?？寡趸钚詸z測(cè)方法包括DPPH、ORAC、FRAP、ABTS及細(xì)胞培養(yǎng)法，其方法和原理不同，所反應(yīng)的抗氧化機(jī)理有著本質(zhì)上的差異，僅靠一種方法評(píng)價(jià)多酚類物質(zhì)的抗氧化活性是不全面的。因此，有關(guān)蘋果多酚類物質(zhì)的酚類組成、胃腸消化對(duì)其成分的影響及其抗氧化活性評(píng)價(jià)，還有待于深入研究。