付 晶，林 桐，陳艾玲，鄧 珊，劉春朋

（1.東北農業(yè)大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030；2.仲愷農業(yè)工程學院動物科技學院，廣州 510225）

內環(huán)境穩(wěn)態(tài)為畜禽健康必要條件。隨著畜牧業(yè)集約化、高密度飼養(yǎng)模式的推廣，在養(yǎng)殖過程中，如飼養(yǎng)管理不當可造成動物應激。機體產生過量自由基、體內氧化還原平衡遭到破壞，發(fā)生氧化應激損傷，嚴重影響機體健康和生產性能[1]。腸道為機體養(yǎng)分消化吸收、物質新陳代謝的主要器官，因其特有的血管解剖結構特點及對流氧交換機制決定其應激狀態(tài)下更易發(fā)生氧化損傷，誘發(fā)腸道疾病[2]。在畜牧業(yè)轉型升級、畜禽標準化規(guī)?；B(yǎng)殖模式持續(xù)推進的大趨勢下，畜禽腸道問題日益突出，為減輕氧化應激對畜禽腸道健康的影響，研究腸道氧化應激機理并尋找預防和修復腸道氧化損傷的方法成為亟待解決的問題之一。

肉鵝是我國華南地區(qū)主要水禽飼養(yǎng)種類。在生產周期中，腸道易受外界刺激，高飼料轉化率、養(yǎng)殖環(huán)境污染和頻繁的免疫程序等不利因素，均可導致肉鵝機體代謝過程中產生大量自由基，引發(fā)腸道疾病[3]?？寡趸瘎┛汕宄杂苫?、減緩氧化應激危害。隨著飼用抗生素的全面禁用，開發(fā)綠色功能性飼料添加劑在畜牧生產中尤為必要。

茶多酚（Tea polyphenols, TP）為一類從茶葉中提取的多酚類化合物總稱，作為天然藥物具有廣泛的藥理作用和生物學功能，如抗氧化、抗炎癥、抑菌、清除機體自由基等[4]。TP為迄今為止唯一被列入我國食品添加劑使用標準的天然抗氧化劑[5]。TP 作為飼料添加劑在家禽生產中已有應用，但其發(fā)揮生物學特性的內在機制有待進一步研究。目前，相關研究主要集中于雞、鴨等生長性能、繁殖性能、肉品質及菌群調節(jié)等方面[6]，關于TP 在養(yǎng)鵝生產中的應用尤其是對鵝腸道抗氧化功能研究未見報道。本研究體外分離培養(yǎng)鵝小腸上皮細胞，使用過氧化氫（H2O2）處理，建立氧化應激損傷細胞模型；采用TP對細胞作預處理，探討TP對H2O2引發(fā)細胞氧化應激損傷的保護作用機制，為TP 作為功能性飼料添加劑在養(yǎng)鵝生產中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

25～26胚齡發(fā)育良好的馬崗鵝鵝胚，購自廣州文健明種鵝養(yǎng)殖有限公司。茶多酚（純度≥98%），購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 主要試劑

DMEM/F12 培養(yǎng)基（11320033）、0.05% Trypsin-EDTA（2530062），購于Gibco 公司；表皮生長因子EGF（E4127）、青鏈霉素（V900929）、膠原酶Ⅺ（C7657）、中性蛋白酶Ⅰ（D4818）、L-谷氨酰胺（G8540）、3% H2O2，購自Sigma 公司；鼠尾膠原蛋白（C8062）、MTT 試劑盒（M1020）、一抗稀釋液（A1810），購自北京索萊寶科技有限公司；優(yōu)級胎牛血清（11011），購自杭州四季青公司；細胞角蛋白18 單克隆抗體（M01357）、SABC 免疫組化試劑盒（SA1021）、DAB顯色試劑盒（AR1022），購自武漢博士德公司；乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要儀器

超凈工作臺（VS-1300U），二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo fisher scientific），低溫高速離心機（Thermo fisher scientific），倒置顯微鏡（Olympus CX41），電熱恒溫水槽（上海一恒CU-600），酶標儀（Thermo fisher scientific 51119300），紫外分光光度計（Eppendorf）。

1.4 樣品采集及處理

1.4.1 鵝小腸上皮細胞分離、純化及鑒定

1.4.1.1 鵝小腸上皮細胞分離

取25～26胚齡發(fā)育良好鵝胚，75%酒精棉擦拭外殼，晾干后用滅菌解剖器械在超凈臺內取出小腸組織，暫置于DMEM/F12培養(yǎng)基。隨后在含有雙抗DMEM/F12培養(yǎng)液（不含血清）中，小心剝離腸系膜，使用PBS反復沖洗腸腔內容物，直至上清液澄清。將小腸組織剪成＜1 mm3碎塊，使用比例為9∶1膠原酶Ⅺ和中性蛋白酶混合酶，37 ℃消化25 min后，4 ℃離心10 min棄上清，即獲得鵝小腸上皮細胞沉淀。

1.4.1.2 鵝小腸上皮細胞純化

根據(jù)上皮細胞較成纖維細胞貼壁慢的特點，選用“相差貼壁法”使兩類細胞分離以達到純化目的。即：先將1.4.1.1中分離得到的細胞沉淀用含有雙抗和10%血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基吹勻，隨后將懸液接種至第1個培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)90 min；然后輕輕吸取全部培養(yǎng)液（含未貼壁上皮細胞），接種到第2 個培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，更換新鮮細胞培養(yǎng)液，即獲得純化的鵝小腸上皮細胞。

1.4.1.3 鵝小腸上皮細胞鑒定

取純化后傳至第二代的小腸上皮細胞，將其以每孔1×104密度接種到24 孔板上，培養(yǎng)3～4 d。吸去培養(yǎng)液，使用PBS洗滌細胞2～3次。然后按照博士德SABC免疫組化染色試劑盒說明書操作，細胞固定、滅活、封閉、一抗孵育、二抗孵育、SABC 染色和DAB 顯色。顯微鏡下觀察顯色情況，待10～15 min顯色完成后，蒸餾水充分洗滌以終止顯色反應。

1.4.2 茶多酚干預鵝小腸上皮細胞氧化應激損傷模型建立

1.4.2.1 H2O2誘導鵝小腸上皮細胞氧化應激損傷模型建立

按照每孔0.5～1×104個細胞將對數(shù)生長期鵝小腸上皮細胞接種于96 孔培養(yǎng)板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至80%時，棄去細胞培養(yǎng)上清液，加入配制的含有終濃度分別為0（對照組）、100、200、400、800 和1 600 μmol·L-1的H2O2培養(yǎng)液，每組6個平行。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)2 和4 h后，測定細胞存活率。

1.4.2.2 TP對鵝小腸上皮細胞增殖的影響

按照每孔0.5～1×104個細胞取對數(shù)生長期細胞，待細胞生長至80%時，棄去細胞培養(yǎng)上清液，加入配制的含有終濃度分別為0（對照組）、12.5、25、50、100 和200 μg·mL-1TP 培養(yǎng)液，每組6個平行。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，測定細胞存活率。

1.4.2.3 TP預處理鵝小腸上皮細胞損傷模型建立

試驗分為4 組：對照組、TP 處理組、H2O2處理組、TP和H2O2聯(lián)合組（TP預處理組）。其中：①對照組：用DMEM/F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)小腸上皮細胞12 h；②TP 處理組：用含有100 μg·mL-1TP 的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)小腸上皮細胞12 h；③H2O2處理組：先用DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)小腸上皮細胞10 h，再用含有400 μmol·L-1H2O2的DMEM/F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)小腸上皮細胞2 h；④TP+H2O2聯(lián)合組：先用含有100 μg·mL-1TP的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)小腸上皮細胞10 h，再加入終濃度為400 μmol·L-1H2O2，共培養(yǎng)2 h，測定相關指標。

1.4.3 鵝小腸上皮細胞活力檢測

按1.4.2 分組及藥物處理后，小心吸去原培養(yǎng)基，每孔加入90 μL新鮮DMEM/F12培養(yǎng)基和10 μL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；然后吸去培養(yǎng)基，再向每孔加入110 μL Formazan溶解液后，置于搖床上低速震蕩10 min，使結晶充分溶解。在酶標儀490 nm波長處測量各孔吸光值。設定對照組細胞存活率為100%，根據(jù)下列公式計算各組細胞存活率。

細胞存活率（%）=（處理組OD 平均值/對照組OD平均值）×100%

1.4.4 與氧化應激相關指標MDA、LDH、SOD 和GSH-Px測定

將鵝小腸上皮細胞以每孔2×105個細胞接種于6孔板中，按1.4.2.3分組及藥物處理后，收集細胞培養(yǎng)液，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液用于測定LDH 活性。取細胞，用0.05%胰蛋白酶-EDTA 消化細胞，收集細胞懸浮液，1 000 r·min-1離心10 min，棄上清后加入PBS配制細胞懸液，細胞破碎儀破碎細胞，測定MDA 含量及SOD 和GSH-Px 活性。MDA、LDH、SOD 和GSH-Px 測定依據(jù)南京建成生物工程研究所提供試劑盒說明書操作。采用微板法測定LDH 活性、TBA 法測定MDA 含量、黃嘌呤氧化酶法測定SOD 活性、比色法測定GSH-Px活性。

1.5 統(tǒng)計與分析

使用GraphPad Prism 5.0軟件統(tǒng)計學分析試驗數(shù)據(jù)并作圖。通過單向ANOVA評估比較平均值，采用Tukey檢驗組間多重比較。數(shù)據(jù)均用“mean±SD”表示。不同字母代表組間差異顯著（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 鵝小腸上皮細胞分離、純化及鑒定

成功建立鵝小腸上皮細胞體外培養(yǎng)方法，用混合酶（0.01 mg·mL-1膠原酶XI+0.1 mg·mL-1中性蛋白酶）消化法分離得到鵝小腸上皮細胞（見圖1a 和1b）。用相差貼壁法分離純化腸上皮細胞（見圖1c和1d），并以每孔0.5～2×104個細胞作為后續(xù)試驗中細胞接種濃度。細胞形態(tài)學觀察結果顯示（見圖1e和1f），分離得到細胞呈卵圓形或多角形，單層貼壁生長，邊緣清晰緊密相連；且獲得較多具有增殖活性的腸隱窩集團。此外，試驗選用上皮組織中特異性抗原（細胞角蛋白18 單克隆抗體）對傳至第二代細胞免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)90%以上細胞染色結果呈陽性（見圖1h），說明獲得的細胞為腸上皮細胞，可用于后續(xù)試驗。

2.2 茶多酚干預鵝小腸上皮細胞氧化應激損傷模型建立

2.2.1 H2O2對鵝小腸上皮細胞存活率的影響

由表1可見，與對照組相比，H2O2處理組細胞存活率隨著H2O2濃度增加而顯著降低（P＜0.05）。100 μmol·L-1組存活率均在80%左右，細胞損傷較?。?00 μmol·L-1組處理細胞4 h 后，細胞存活率低于50%，而2 h組細胞存活率相對于對照組顯著降低至71.46%（P＜0.05），符合建立氧化應激模型條件；800 和1 600 μmol·L-1組存活率進一步降至40%以下，細胞存活率較低。

2.2.2 H2O2作用2 h對鵝小腸上皮細胞形態(tài)的影響

由圖2可見，不同濃度H2O2處理鵝小腸上皮細胞2 h 后，對照組細胞形態(tài)正常，貼壁情況良好，細胞連接緊密無明顯間隙；100 μmol·L-1組細胞形態(tài)無明顯變化；200 μmol·L-1組僅少量細胞脫落；400 μmol·L-1組細胞體積縮小、脫落，局部出現(xiàn)細胞間隙變大，少量細胞變圓死亡；800 和1 600 μmol·L-1組細胞體積縮小變圓，細胞脫落嚴重且出現(xiàn)大面積空隙，細胞核突出，產生DNA損傷。

表1 H2O2對鵝小腸上皮細胞存活率的影響（n=6）Table 1 Effect of H2O2on the survival rate of small intestinal epithelial cells in goose embryo（n=6）

2.2.3 TP對鵝小腸上皮細胞存活率的影響

為確定TP 作用于腸上皮細胞安全劑量范圍，將不同濃度TP加入腸上皮細胞培養(yǎng)基中，檢測TP對腸上皮細胞存活率的影響。結果如圖3a 所示，與空白對照組相比，12.5～200 μg·mL-1TP處理上皮細胞后，在12 h 內，隨TP 濃度增大，細胞存活率上升且差異顯著（P＜0.05）。研究表明，TP可提高正常腸上皮細胞存活率，且具有一定劑量效應。但100 和200 μg·mL-1濃度TP 對細胞存活率的影響差異不顯著（P＞0.05），因此本研究選取100 μg·mL-1濃度TP 用于后續(xù)試驗。圖3b 顯示，與對照組相比，腸上皮細胞經H2O2處理后存活率（74.8%）顯著下降（P＜0.05），而經TP 預處理10 h 后腸上皮細胞經H2O2處理后存活率為117.94%。研究表明，TP對H2O2誘導的細胞損傷具有保護作用，可逆轉H2O2誘導的細胞氧化應激損傷。

2.3 TP 對H2O2 誘導鵝腸上皮細胞脂質過氧化（MDA）和乳酸脫氫酶（LDH）的影響

MDA 為脂質過氧化物重要降解產物之一，由圖4a可知，與對照組相比，H2O2組細胞MDA 含量顯著增加（P＜0.05）。與H2O2組相比，TP 與H2O2聯(lián)合處理（即用TP 預處理細胞10 h）可顯著降低H2O2導致的鵝小腸上皮細胞MDA 產生。當脂質過氧化物大量增加時可導致細胞膜損傷，而LDH 漏出率可反映細胞膜完整程度。圖4b 可知，與對照組相比，H2O2組細胞LDH 含量顯著增加（P＜0.05），而TP 組細胞LDH 含量明顯下降（P＜0.05）。與H2O2組相比，TP 與H2O2聯(lián)合處理可顯著降低H2O2導致的鵝小腸上皮細胞中LDH 產生。研究結果表明，在鵝腸上皮細胞中，TP 可抑制H2O2引起的細胞脂質過氧化發(fā)生和細胞膜通透性提高。

2.4 TP 對H2O2 誘導的鵝腸上皮細胞抗氧化酶SOD和GSH-Px的影響

由圖5可知，在鵝小腸上皮細胞中，與對照組相比，H2O2可顯著降低細胞SOD 和GSH-Px 活性（P＜0.05），TP組可顯著增加細胞SOD和GSH-Px活性（P＜0.05）。與H2O2模型組細胞相比，TP 預處理組也可顯著增加細胞SOD 和GSH-Px 活性（P＜0.05）。以上結果提示TP通過提高抗氧化酶系活性減輕H2O2所致的氧化應激損傷。

3 討論與結論

小腸上皮細胞為機體更新速度最快的一類細胞，其結構和功能完整性對動物健康具有重要作用。因此，體外培養(yǎng)小腸上皮細胞可進一步了解和模擬腸道生物學功能。本研究成功分離得到原代鵝小腸上皮細胞，為進一步研究腸道功能提供有效的細胞模型。

鵝是以草食為主的水禽，可充分利用纖維含量較高的青綠飼料和粗飼料，其小腸液微堿性環(huán)境及小腸內纖維素酶有助于對粗纖維的消化。因此，維持小腸正常生理功能對鵝的健康尤為必要[7]。本研究通過體外建立鵝小腸氧化應激損傷模型，研究鵝腸道發(fā)生氧化損傷機制。H2O2為一種重要的活性氧物質，可穿透細胞膜與細胞內鐵離子反應，生成具有高活性自由基，因其理化性質穩(wěn)定容易獲得，現(xiàn)已成為建立細胞氧化損傷模型的重要工具[8]?？琢盥?lián)等采用200 μmol·L-1濃度H2O2作用奶牛小腸上皮細胞2 h，成功建立奶牛小腸上皮細胞氧化損傷模型[9]。本試驗研究結果表明，選用濃度為400 μmol·L-1H2O2作用鵝小腸上皮細胞2 h，細胞存活率顯著降至71.4%，且此時細胞形態(tài)發(fā)生改變，說明細胞產生一定程度的氧化損傷，但不會直接造成細胞死亡，適宜的抗氧化劑干預，可能恢復損傷。因此，此濃度和作用時間可作為建立鵝小腸上皮細胞氧化應激損傷模型的適宜濃度，與孔令聯(lián)等研究不同，可能為細胞結構和耐受性不同所致[9]。

MDA 為脂質過氧化的標志性產物，可間接反映細胞氧化損傷程度[10]。LDH正常情況下存在于機體組織細胞胞質內，當細胞發(fā)生氧化損傷時，細胞膜受損，LDH 由胞質內泄漏。LDH 在細胞培養(yǎng)液中含量反映細胞膜受損程度[11]。SOD被稱為自由基清除劑，為生物體內重要的抗氧化酶，可將超氧自由基轉化為H2O2，使細胞免受氧化應激損傷[12]。SOD 活力可間接反映機體清除自由基能力。GSH-Px可使機體內有毒的過氧化物還原為無毒的羥基化合物，同時促進H2O2分解成氧氣和水，保持細胞膜結構和功能完整性[13]。王振云研究結果顯示，奶牛乳腺上皮細胞在H2O2誘導的氧化損傷下，MDA 和LDH 含量顯著增高，SOD 活性下降[14]。吳建民研究結果表明，雞小腸上皮細胞發(fā)生急性氧化應激損傷時，細胞培養(yǎng)液中LDH 酶活性顯著升高，細胞抗氧化酶SOD和GSH-Px活力顯著降低[15]。以上研究結果表明，H2O2可誘導不同動物上皮細胞發(fā)生氧化應激損傷。本試驗發(fā)現(xiàn)，當H2O2誘導鵝小腸上皮細胞時，細胞培養(yǎng)液中LDH和MDA 含量升高，SOD 和GSH-Px 活性下降。表明鵝小腸上皮細胞在H2O2作用下發(fā)生氧化應激損傷，不僅產生大量脂質過氧化物，且細胞膜通透性發(fā)生改變，即膜質內LDH 透過細胞膜釋，細胞培養(yǎng)液中LDH 水平顯著升高。而抗氧化酶活性下降，表明鵝小腸上皮細胞抗氧化能力降低。

近年研究表明，天然植物及其主效成分對畜禽具有抗氧化、增強免疫力、促生長等作用，已作為功能性飼料添加劑在畜牧業(yè)中廣泛應用[16]。TP為茶葉中多羥基酚類化合物總稱，結構中的酚羥基可與機體自由基結合，使自由基活性下降，減輕自由基對機體損傷[17]。大量體內、體外試驗表明TP 不僅可提高正常組織細胞的抗氧化能力，對氧化應激損傷細胞也具有保護作用，但對不同物種及其所處生物時期作用效果不同，發(fā)揮抗氧化能力有效劑量也不同。孫丹鳳研究表明，茶多酚可顯著降低肉鴨小腸黏膜中MDA 含量，顯著提高小腸黏膜中SOD、GSH-Px、二胺氧化酶（DAO）活性[18]。何夢曉等研究發(fā)現(xiàn)，TP 可提高感染雞球蟲肉仔雞生長性能和抗氧化能力，改善盲腸微生物組成[19]。Ma 等研究表明，TP 可通過激活NFE2L2/HMOX1 信號通路減緩奶牛乳腺上皮細胞發(fā)生的氧化應激損傷[20]；Zhao 等研究表明，TP 可通過提高小鼠肝細胞抗氧化能力緩解酒精誘導的急性肝損傷[21]。Cai 等研究表明，TP 通過提高小鼠腸上皮細胞增殖率和降低脂質過氧化程度保護小鼠腸道免受高脂飲食導致的氧化應激損傷[22]。本試驗結果發(fā)現(xiàn)，TP 不僅可提高正常腸上皮細胞增殖率和抗氧化能力，還可通過提高腸上皮細胞對氧自由基的清除能力，降低脂質過氧化反應，減輕氧自由基對細胞膜結構與功能損傷，實現(xiàn)對腸上皮細胞氧化應激狀態(tài)的保護作用。