代永聯(lián)，郝小靜，衣服德，檀學進，馮永勝

(青島市畜牧獸醫(yī)研究所，山東 青島 266100)

志賀氏菌是一種能引起人和動物腹瀉的革蘭氏陰性桿菌。根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)，其可分為痢疾志賀氏菌(Shigella dyseteriae)、福氏志賀氏菌(Sh.flexneri)、鮑氏志賀氏菌(Sh.boydii)和宋內(nèi)氏志賀氏菌(Sh.sonnei)四個種群[1]。2019年9月，我們從青島某規(guī)?；u場的病雞肝臟中分離到了一株疑似志賀氏菌的病原菌(編號為LB2-1)，通過分離培養(yǎng)、生化反應以及16S rDNA測序，最終確定該菌株為宋內(nèi)氏志賀氏菌。藥敏試驗發(fā)現(xiàn)，該菌株對多種抗生素有不同程度的耐藥性，但對左氧氟沙星和丁胺卡那最為敏感，對新霉素和鹽酸多西環(huán)素的敏感性次之，這一結(jié)果可供當?shù)仉u場在防治畜禽宋內(nèi)氏志賀氏菌病時提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

NA培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、志賀氏菌顯色培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基和志賀氏菌成套生化鑒定管等均購于青島海博生物技術有限公司。

1.2 主要儀器設備

SW-CJ-1FD型超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)，SHP-250型智能生化培養(yǎng)箱(上海三發(fā)科學儀器有限公司)，ZHWY-100B型恒溫培養(yǎng)搖床箱(上海一恒科學儀器有限公司)，BX53生物顯微鏡(日本奧林巴斯醫(yī)療株式會社)，Research plus 可調(diào)量程移液器(Eppendorf 公司)。

1.3 方法

1.3.1 細菌的分離純化

在無菌狀態(tài)下，從病雞的肝臟內(nèi)部取少量病料，分別劃線接種于SS瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上，并置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h～24 h，觀察菌落生長狀況與形態(tài)；挑選典型菌落接種于含5 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的試管中，置于37℃恒溫搖床(轉(zhuǎn)速為170 r/min，下同)中培養(yǎng)18 h～24 h；從營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中取適量菌液，劃線接種于NA 瓊脂上，然后將其置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，純化培養(yǎng)18 h～24 h；按照以上方法重復純化3～5次，直至獲得純的菌落，隨后挑選典型菌落進行革蘭氏染色，再用顯微鏡檢查，觀察細菌形態(tài)。

1.3.2 細菌的顯色培養(yǎng)

用接種環(huán)取一環(huán)菌液，接種于志賀氏顯色培養(yǎng)基上，將接種好的培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h～24 h。

1.3.3 細菌的生化試驗

挑選志賀氏顯色培養(yǎng)基上的典型菌落，隨后分別接種于三糖鐵瓊脂和志賀氏菌成套生化鑒定管進行測定，詳細觀察并記錄結(jié)果。

1.3.4 16S rDNA 測序分析

對數(shù)期的菌樣由上海派森諾基因科技有限公司進行檢測。

1.3.5 藥敏試驗

選取氨芐西林鈉、復方新諾明、鏈霉素、慶大霉素、頭孢曲松鈉、氟苯尼考、新霉素、左氧氟沙星、丁胺卡那和鹽酸多西環(huán)素等10種藥敏試紙片，按照世界衛(wèi)生組織推薦的Kirby-Bauer法進行耐藥試驗[2]，并按照美國臨床實驗室標準委員會標準進行判斷。

2 結(jié)果

2.1 菌落形態(tài)與革蘭氏染色特性

細菌在SS瓊脂培養(yǎng)基上形成整體半透明、邊緣整齊、表面光滑、稍微凸起和濕潤圓形的菌落；在NA 瓊脂上形成直徑為3 mm左右有白色凸起且表面光滑且濕潤圓形的菌落；在麥康凱培養(yǎng)基上形成無色透明、光滑且凸起的圓形菌落。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，該菌為紅色且兩端鈍圓的短桿狀陰性菌。

2.2 顯色培養(yǎng)結(jié)果

致病菌LB2-1在志賀氏顯色培養(yǎng)基上呈直徑為1 mm～3 mm的圓形、邊緣整齊、表面光滑、稍微凸起以及帶藍色中心的白色菌落。

2.3 生化檢驗結(jié)果

三糖鐵瓊脂反應結(jié)果顯示：底層產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣，斜面顏色未變，未產(chǎn)生H2S；經(jīng)過志賀氏菌成套生化鑒定管測定，參照志賀氏菌生化鑒定GB 4789.5-2012《食品安全國家標準食品微生物學檢驗志賀氏菌檢驗》標準判定，詳細結(jié)果見表1。

2.4 16S rDNA測序分析結(jié)果

送上海派森諾基因科技有限公司進行16S rDNA 測序，美國國家生物技術信息中心官網(wǎng)上利用BLAST 與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對分析，結(jié)果表明LB2-1 菌株與宋內(nèi)氏志賀氏菌(Sh.sonnei)的進化距離較近且同源性高，相似度為99.72%。

2.5 耐藥試驗檢測結(jié)果，

LB2-1 菌株對10種常用抗生素的耐藥分析結(jié)果見表2。

由表2 可知，LB2-1 菌株對氨芐西林、復方新諾明、鏈霉素和氟苯尼考等均產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，對左氧氟沙星和丁胺卡那有良好的敏感性。

3 討論

在中國，最常見的志賀氏菌是痢疾志賀氏菌和福氏志賀氏菌，宋內(nèi)氏志賀氏菌比較少見，但隨著人員的流動和動物品種的引進，我國畜禽養(yǎng)殖行業(yè)動物感染宋內(nèi)氏志賀氏菌的比例呈明顯的上升趨勢[2]。根據(jù)本試驗對病原菌LB2-1 菌株的分離與鑒定，最終確定其為宋內(nèi)氏志賀氏菌，說明本地區(qū)其他畜禽養(yǎng)殖場也存在動物感染宋內(nèi)氏志賀氏菌的風險，因此本地區(qū)畜禽養(yǎng)殖場需要加強動物感染宋內(nèi)氏志賀氏菌的防治工作。

近年來，隨著抗生素的大量使用，許多細菌對各種抗生素產(chǎn)生了不同程度的多重耐藥性，志賀氏菌的耐藥范圍和耐藥水平也在不斷攀升[3]。本次藥敏試驗發(fā)現(xiàn)，LB2-1 菌株已經(jīng)對氨芐西林、復方新諾明和鏈霉素等多數(shù)抗生素產(chǎn)生了耐藥性，因此在進行臨床治療時，獸醫(yī)要注意篩選敏感抗生素，做到精準用藥；同時，在幾種敏感抗生素中，應采用輪換用藥，避免細菌產(chǎn)生耐藥性。另外，近年來有些科研單位和獸藥生產(chǎn)廠研制的新型微生態(tài)制劑(如噬菌體)、裂解酶和中草藥等來替代抗生素，也成為解決畜禽細菌性疾病防治的一種新途徑。