李小康，魚濤，李紅，李金靈，屈撐囤，2

(1.西安石油大學 陜西省油氣田環(huán)境污染控制技術(shù)與儲層保護重點實驗室，陜西 西安 710065；2.石油石化污染物控制與處理國家重點實驗室，北京 102206)

石油污染日益增多，對環(huán)境的破壞范圍也逐漸擴大，給人們的生產(chǎn)生活造成嚴重影響。如何環(huán)保、無害的處理石油污染是當下環(huán)境治理需要解決的問題[1]。目前，在眾多修復技術(shù)中，生物修復作為一種溫和、環(huán)保、經(jīng)濟、操作簡單的修復技術(shù)，對土壤生態(tài)恢復可起到很好的輔助作用，因此，生物修復技術(shù)成為土壤修復研究的熱點。但是，由于微生物個體微小、抗性低、活性不穩(wěn)定，在營養(yǎng)物質(zhì)匱乏的石油污染土壤中極易失活，對土壤中污染物的降解效果較差[2]。研究表明[3]，通過添加外源刺激物可以提高微生物的降解活性和種群數(shù)量，縮短酶促降解周期，提高降解石油污染物的效率。

1 刺激物促進微生物降解石油污染物的機理

石油污染物進入環(huán)境中，單一營養(yǎng)物質(zhì)不能維持微生物生長繁殖，需要額外添加一些刺激物質(zhì)，并使用物理刺激方法增強微生物活性，提高微生物對石油烴的利用效率。多數(shù)刺激物質(zhì)主要含有N、P、K、S等營養(yǎng)元素，可調(diào)節(jié)土壤的營養(yǎng)元素比例，為微生物修復土壤營造合適的生存環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)[4]，向土壤中投加營養(yǎng)物質(zhì)會激活微生物體內(nèi)酶的活性，增強微生物代謝系統(tǒng)對營養(yǎng)物質(zhì)的分配和轉(zhuǎn)運速率，保證原油在微生物體內(nèi)被高效快速的分解。如圖1所示，微生物在物理刺激(如通空氣、電刺激等)作用下改變細胞膜性質(zhì)，增強微生物和原油的接觸，提高攝取效率。在營養(yǎng)刺激作用下，微生物加快對石油烴的分解代謝，提高合成代謝速率，短時間達到高數(shù)量、高活性，增強對原油污染土壤的修復能力。Wu等[5]研究表明，TPH的降解速率與微生物的種群數(shù)量和活性之間存在線性相關(guān)性。Witzig等[6]發(fā)現(xiàn)土壤中營養(yǎng)物質(zhì)的含量過低，微生物體內(nèi)酶的合成效率也會降低，代謝系統(tǒng)功能減弱。所以，生物刺激是提高含油污染土壤修復的必要手段。

圖1 微生物刺激作用途徑

營養(yǎng)刺激和微生物代謝也存在一定的關(guān)系。Thingstad等[7]利用monod模型方程探究了石油烴降解過程中的微生物生長率、微生物對原油和營養(yǎng)物質(zhì)的攝取速率及微生物的實際呼吸速率，證明了營養(yǎng)物質(zhì)的濃度會影響微生物對底物的攝取效率，影響微生物自身的呼吸速率、生物活性和生物數(shù)量。微生物與營養(yǎng)刺激關(guān)系模型方程如式(1)～(5)所示。

μ=μmax(1-f)

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

2 不同類型刺激物對微生物的降解效果影響

通過生物刺激提高微生物降解石油污染的方法較多，分為化學刺激和物理刺激，化學刺激包含有機物刺激和無機物刺激，物理刺激可以通過物理作用改造微生物自身與它們的生存環(huán)境，提高微生物降解效率。

2.1 化學刺激對微生物石油降解

2.1.1 無機刺激物的種類及效果影響 石油污染修復過程中，無機刺激物主要以N、P化合物為主。Wu等[8]添加N、P無機鹽刺激石油微生物處理含油污染土壤，石油烴類物質(zhì)降解效率(60%)高于未添加無機鹽的對照組(降解率僅為34%)，微生物活性和數(shù)量均比對照組高。合適的營養(yǎng)比例和加量也能進一步促進微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的攝取，減少過多的營養(yǎng)物質(zhì)對環(huán)境的污染。王艷杰等[9]使用NH4NO3和 K2HPO4刺激微生物修復石油污染，發(fā)現(xiàn)土壤C∶N∶P為100∶10∶1 時，土壤生物量最高，比對照組高出40%左右，芳香烴降解率也達到43.89%。刺激物加量和微生物修復石油污染效果之間也存在規(guī)律，Khan等[10]利用NPK無機肥作為刺激物，顯著提高了微生物對石油烴的修復效率，分析發(fā)現(xiàn)在一定的污染濃度和無機肥濃度范圍內(nèi)，污染處理效果隨刺激物濃度的增加而增加。但是無機營養(yǎng)物質(zhì)在土壤中容易隨雨水流失，濃度變化較大，Xu等[11]使用包膜的無機營養(yǎng)肥料刺激微生物修復海灘殘留的石油烴，對污染物中的烷烴降解率達到 95%以上，其中，包膜無機肥對土壤中微生物的作用效果比直接添加無機肥持續(xù)的時間更長，各組分營養(yǎng)濃度更加穩(wěn)定。還有一些其它的無機刺激物都能很好地提高微生物的活性，增強微生物對污染物的降解，見表1。

表1 提高微生物降解效率的無機刺激物

微生物生長代謝需要從外界吸收各種營養(yǎng)元素，保障自身的物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化。Kalantary等[15]通過分析含不同元素化合物的添加對微生物降解多環(huán)芳烴的影響效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)元素對降解率影響大小為：N>K>P>Cl>Na>Mg>(Cu、Fe、B、Mo、Co、Ni)。Nolin 等[16]通過試驗測得細菌細胞內(nèi)各元素含量：N為1 163～5 390 mmol/L，K為128～462 mmol/L，P為106～642 mmol/L，Cl 為23～85 mmol/L，S為32～162 mmol/L，Mg為13～55 mmol/L。其中S、Cl、Mg在細胞中分布較為廣泛。由此可以得出：某元素在胞內(nèi)含量越高，分布越廣泛，該元素對微生物降解石油烴的影響也越大，添加對應元素的化合物時，微生物的降解活性也會增加。但是同種元素所組成的不同化合物由于各自結(jié)構(gòu)的差異，微生物對其吸收轉(zhuǎn)化效率也會存在差別。

2.1.2 有機刺激物的種類及對微生物降解原油的促進效果 無機刺激物由于在土壤中存在時間短，容易改變土壤酸堿度和氮水比，給微生物代謝造成不利影響。因此，常使用有機刺激物增強微生物的活性和降解效率。氨基酸作為蛋白基本組成成分，常被用作肥料和微生物刺激物的主要成分。Zhang等[17]發(fā)現(xiàn)氨基酸復合肥的施用在促進植物生長的同時，也將土壤中的細菌數(shù)量提高1.57～2.18倍，加快細菌對土壤中有機物利用。近年來，研究利用血紅蛋白作為刺激物促進微生物對石油烴的修復，效果十分顯著[18]。王輝等[19]利用血粉作為刺激物，促進微生物對土壤中DDTs的修復，5個月后，降解率達到43.13%，比添加葡萄糖和乳化油的修復效率高出8%，血粉中含有多種氨基酸，可以為微生物降解提供豐富的氮源。

腐殖質(zhì)作為常用的土壤改良劑，可以防止石油造成的土壤板結(jié)，改善微生物所處的生存環(huán)境。Kalantary等[20]實驗發(fā)現(xiàn)，腐殖質(zhì)可以抑制土壤與多環(huán)芳烴結(jié)合，使微生物更好地與多環(huán)芳烴接觸，在腐殖質(zhì)-多環(huán)芳烴條件下，微生物數(shù)量比土壤-多環(huán)芳烴條件下提高6倍，明顯增加微生物對土壤中多環(huán)芳烴的利用度。一些石油污染土壤的修復也會使用有機廢物來提高微生物的降解活性，Al-Kindi等[21]使用廢蘑菇堆肥(SMC)，家禽糞便(PM)刺激微生物修復石油污染土壤，96 d后，添加SMC和PM的菌群呼吸活動產(chǎn)生的CO2從(8.7±1.9) mg CO2/g增加到(25.7±1.6)，(23.4±1.2)mg CO2/g，這也是一種有效的資源利用的方式。

植物本身就是微生物生長繁殖的天然培養(yǎng)基，一些植物的根系分泌物還會促進微生物對土壤中有機物的降解。Zhang等[22]研究了黃瓜根際細菌對氯嘧磺隆的降解作用。結(jié)果顯示黃瓜根系的細菌含量達到2.14×105個/g，遠高于周圍環(huán)境的微生物數(shù)量，HPLC檢測發(fā)現(xiàn)黃瓜根系分泌的5種有機酸，其中，檸檬酸和富馬酸顯著刺激了黃瓜根際上細菌的定殖，比單純微生物修復的降解率高出18.4%。許超等[23]利用玉米和叢枝菌根真菌組合降解土壤中的芘，玉米根系分泌的琥珀酸和水楊酸為真菌提供共代謝底物，增強了微生物的活性和數(shù)量，提高了土壤中芘的降解效率。植物根系及其分泌物給微生物的新陳代謝提供最佳助力，配合外源營養(yǎng)物質(zhì)會更大限度地提升微生物對石油烴的修復效率，這也是當下土壤修復的一個研究方向。

除以上常用的刺激物外，許多研究也利用其它的有機刺激物來促進微生物對石油烴的降解，表2為提高微生物降解效率的有機刺激物。

表2 提高微生物降解效率的有機刺激物

不同的有機刺激物質(zhì)對微生物修復石油污染的促進作用各有不同。Peltola 等[32]利用投加尿素和亞甲基脲維持土壤氮含量，發(fā)現(xiàn)亞甲基脲更容易提高微生物對高濃度油的降解。尿素也會增高土壤氮含量，促進微生物的降解，但修復一段時間后，土壤pH>8.5。李援等[33 ]在實驗過程中向土壤加入1.0 g/kg 的尿素時，總石油烴降解30 d后的降解率為51.6%，未加尿素的降解率為36.0%。由此可得尿素的添加適合短期土壤修復，長時間修復土壤會增大土壤pH，對土壤菌群造成危害。

許多表面活性劑可以很好地促進微生物的生長代謝，但促進效果存在差異。Patowary等[34]向污染土壤施用鼠李糖脂1.5 g/L，6個月后，測得微生物對石油烴(TPH)降解率達到86.1%，施用十二烷基硫酸鈉(SDS)的生物降解率只達到68.1%，GC-MS分析鼠李糖脂處理的土壤消除了3種多環(huán)芳烴，即氟蒽、苯并芴和苯并蒽，而添加SDS的土壤中這幾種物質(zhì)依然存在，SDS只起到乳化原油的作用。Li 等[35]利用不同表面活性劑促進微生物修復石油污染土壤時，發(fā)現(xiàn)卵磷脂可以促使微生物產(chǎn)生生物電(0.321 C/(d·g))，提高石油降解菌對烴類的降解，而單硬脂酸甘油酯和十六烷基三甲基溴化銨對于促進石油烴降解效果不明顯。十二烷基硫酸鈉與β-環(huán)糊精對微生物具有選擇富集性，可使梭菌豐度增加。花莉等[36]認為單純使用微生物降解含油土壤的效率較低，僅為22.68%。分別添加Tween80、(鼠李糖脂)RL后，柴油土壤的修復效果達到46.11% 和45.32%。由此可以看出卵磷脂、RL、Tween80是目前較為好的微生物土壤修復助劑，以上其它幾種表面活性劑對微生物降解石油污染物的促進作用較低。有機刺激物促進微生物修復的效果取決于微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和營養(yǎng)物質(zhì)之間含量平衡，缺少或增加某些元素含量都會降低微生物的活性。單從營養(yǎng)元素對微生物影響來看，有機營養(yǎng)元素對微生物的促進作用大小也符合N>K>P>Cl>Na>Mg。

2.2 物理刺激對微生物修復含油土壤的影響 添加外源刺激物可以顯著促進微生物的降解效果，輔助一些物理刺激方式會進一步提升修復效率。Guo等[37]實驗發(fā)現(xiàn)微生物-電場聯(lián)合修復石油污染土壤的效果較單純微生物修復有明顯提高，當電場強度在0.02 V/cm以下，修復效果隨電場強度的增加而增加。王冰等[38]通過實驗發(fā)現(xiàn)電動-微生物修復技術(shù)對膠質(zhì)降解率是單純微生物處理法的 3.06倍。經(jīng)過50 d的修復，微生物量比單純的生物修復提高了2個數(shù)量級。Luo 等[39]在探究指數(shù)生長期苯酚降解菌在不同直流電流下的細胞表面性質(zhì)。發(fā)現(xiàn)20 mA的電流可以增加細胞表面疏水性并使細胞形狀變平，有利于和有機物的接觸，提高降解效果。因此，選擇合適的電流能有效促進微生物體內(nèi)電化學過程的進行，增強物質(zhì)的攝取和分解，對于微生物降解含油污染物起到很好的輔助作用。

石油污染土壤修復過程中，土壤中的含氧量達到20～200 mg/L時，微生物可完全降解石油污染物。Thomé等[40]利用微生物-通風技術(shù)修復土壤中石油污染物，經(jīng)過120 d，降解率達到85%。劉沙沙等[41]利用生物通風法修復柴油污染土壤，向土壤中通入空氣時微生物的數(shù)量和活性比自然修復狀態(tài)高。氧作為電子受體，可提高微生物體內(nèi)的加氧酶對分子氧和能量的利用，加快細胞中營養(yǎng)物質(zhì)的分解代謝。使用通風法加氧時，氣流強度為2 L/min和最長氣流間隔為每48 h通氣1 h是最經(jīng)濟有效的。

3 多種方式聯(lián)合刺激微生物修復原油污染實例

石油污染物進入土壤中，會降低微生物的酶促氧化作用。單一的生物刺激方法不能完全提高微生物的降解活性，通常使用多種刺激方式聯(lián)合促進微生物的物質(zhì)代謝，縮短微生物酶促氧化周期，達到高效修復的目的。Sun等[42]實驗得出不同的刺激組合方法對促進微生物修復原油的效果不同：營養(yǎng)物質(zhì)+植物+生物強化>營養(yǎng)物質(zhì)+生物強化>植物+生物強化>僅加水。修復過程中使用營養(yǎng)物質(zhì)的種類和刺激方式的多樣性使微生物土壤修復變得簡單易行，多數(shù)刺激物可以通過周圍環(huán)境獲得，降低現(xiàn)場修復的成本花費。表3為多種方式聯(lián)合刺激微生物高效修復含油污染土壤的實例。

表3 多種方式聯(lián)合刺激微生物修復含油污染土壤

以上不同實例由于實驗環(huán)境(石油組分、土質(zhì)、氣候等)不同，導致研究結(jié)果之間存在差異，相比于無刺激修復，不同的刺激修復技術(shù)集中表現(xiàn)了對石油污染物土壤的高效修復作用，對于一些難降解的大分子物質(zhì)，在生物刺激的作用下也能被高效的降解。

4 結(jié)論與展望

科學的設計方法是生物刺激有效性的保證，首先，確定所選微生物是否對土壤修復存在有效性，探究合適的外源刺激物質(zhì)及合適的生存環(huán)境(溫度、濕度、鹽度、堿度、土質(zhì)等)，在實驗允許的最大條件下實踐并改善，使微生物刺激修復技術(shù)能逐漸應用于深層土壤原位修復。未來關(guān)于如何刺激石油微生物來提高降解效率是一個值得研究的問題。今后可以從以下方面繼續(xù)探究：

(1)深入研究刺激物在微生物降解石油烴過程中的作用機理，研制出作用于微生物降解石油烴反應的催化物質(zhì)，改變石油烴在微生物體內(nèi)的分解方式，加快降解效率。

(2)探究不同刺激物在微生物體內(nèi)的相互作用機理，分析它們的作用方式，有針對性的組合刺激物質(zhì)，最大限度提高微生物降解效率。

(3)利用科學手段改造植物或微生物，產(chǎn)生大量的營養(yǎng)分泌物，刺激石油微生物對污染物的高效修復，減少外源刺激物添加。

(4)設計新型處理工藝，將處理工藝與刺激技術(shù)相結(jié)合，使其能穩(wěn)定高效地提升微生物活性，促進微生物高效降解石油污染。