吳 超，何新穎，畢建強，孫云川△

(1. 華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063700； 2.河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北 滄州 061000)

近年來，放療在腫瘤綜合治療中的地位日漸突出，尤其作為腹盆腔惡性腫瘤的主要治療方法之一，在病灶的局部控制及患者生活質(zhì)量改善等方面發(fā)揮著重要作用[1-2]。隨著腹盆腔腫瘤患者的增多，放射性腸炎的發(fā)生率也隨之增加。本研究擬通過觀察清熱涼血方對急性放射性腸炎大鼠模型的治療效果，對比急性放射性腸炎大鼠用藥后血液中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)表達的變化情況，探討清熱涼血方治療急性放射性腸炎可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量(220±20)g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料喂養(yǎng)，持續(xù)12 h明暗交替日光燈照明，室溫20～25 ℃，濕度 40%～70%，自由活動與飲水。

1.2 試劑與儀器

中藥組成：白頭翁、秦皮、黃柏、敗醬草、地榆、紫草、生甘草、馬齒莧(由醫(yī)院中藥房提供，藥劑制備：分2次加水共500 ml，濃縮取汁，每毫升含生藥約3 g)；地塞米松片(廣東華西藥業(yè)有限公司，批號H44024469，規(guī)格0.75 mg/片)。MDA試劑盒及T-SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號A001-1);甲醛(成都市科龍化工試劑廠) 水合氯醛(購自成都市科龍化工試劑廠)。simensPRIMUS直線加速器；臺式冷凍離心機(Eppendorf公司，TGL-18R，醫(yī)院實驗室提供)。

1.3 方法

1.3.1 制作模型 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，禁食禁水12 h后稱重按隨機數(shù)字表法分為2組，其中正常組8只，造模組52只。造模組采用10%水合氯醛麻醉(給藥標(biāo)準(zhǔn)：2.5 ml/kg)，麻醉后固定，采用simens6MV直線加速器對上述大鼠進行照射，照射范圍(胸骨劍突至肛門外緣)，100 cm源皮距，行單次照射200 cGy/min，總體照射劑量12 Gy[3]，照射前8 h禁食禁水，建立大鼠急性放射性腸炎模型。造模成功判定標(biāo)準(zhǔn)[4]：大鼠受照射后1 d內(nèi)吐黃水或出現(xiàn)黏液便、血便等大便性狀改變或出現(xiàn)其他放射性損傷癥狀。出現(xiàn)癥狀之后，隨機從造模大鼠中選取2只脫頸椎處死，剖取一段小腸縱軸剪開，0.9%生理鹽水沖洗后行甲醛固定、酒精脫水、石蠟包埋、HE染色、封片等處理后，光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠小腸組織改變，確認造模成功。記錄大鼠照射后體質(zhì)量、精神狀態(tài)及大便次數(shù)和性質(zhì)。

1.3.2 分組 根據(jù)隨機數(shù)字表法將急性放射性腸炎動物模型50只隨機分成模型組、西藥對照組、中藥灌胃組、中藥灌腸組、中藥灌胃+灌腸組每組各10只，未造模大鼠8只為正常組。

1.3.3 給藥 根據(jù)人與動物體表面積換算法確定每只大鼠灌胃或灌腸的原藥劑量。將自擬清熱涼血組方煎制成湯劑，按照2 g/kg體質(zhì)量的劑量和各自給藥方式分別給予3個中藥組，灌胃+灌胃組給予2份同等劑量中藥，分別用于灌腸與灌胃。西藥對照組給予相應(yīng)劑量的地塞米松，正常組和空白模型組給予等量生理鹽水，隔日1次，連續(xù)治療4周。4周后大鼠處死，處死前1 d禁水禁食，大鼠麻醉，每只經(jīng)腹動脈取血5 mL，血樣靜置2 h，用離心機2500 r/min離心15 min，取上清液，-20 ℃保存，待測超氧歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量。

1.4 觀察大鼠一般情況及體質(zhì)量變化

觀察并記錄給藥期間模型大鼠的體質(zhì)量、精神狀態(tài)、進食水及排便等情況變化，每周稱取各組大鼠體質(zhì)量1次，記錄大鼠癥狀緩解及死亡情況。

1.5 制定療效評定標(biāo)準(zhǔn)

表1示，參照炎癥性腸病生活質(zhì)量指數(shù)(IBDQ)和臨床結(jié)腸炎活動指數(shù)(SCCAI)[5]制定如下療效評定標(biāo)準(zhǔn)。

表1 炎癥性腸病療效評定標(biāo)準(zhǔn)

1.6 SOD活性測定及外周血MDA檢測

采用超氧歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)ELISA檢測試劑盒，嚴(yán)格按照操作說明進行，在酶標(biāo)儀上檢測并分析其含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況及體質(zhì)量變化

表2示，造模成功后模型組大鼠在第2～4天放射性損傷癥狀表現(xiàn)最嚴(yán)重，如吐黃、黏液便或稀爛血便，甚至出現(xiàn)不進食和水的情況。治療組癥狀較輕，造模各組大鼠體質(zhì)量無明顯差異(P>0.05)。所有治療組大鼠7～10 d精神狀態(tài)、進食水等出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，模型組仍有不同程度的黏液便或稀爛便。治療4周后，各治療組大鼠體質(zhì)量較模型組明顯升高(P<0.01)，中藥治療組體質(zhì)量高于西藥對照組(P<0.05)，中藥治療組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。實驗過程中共有3只大鼠死亡(其中對照組1只，灌胃組1只，灌腸+灌胃組1只)。治療組大鼠死亡原因可能為灌胃針刺破正常組織管腔、組織間隙感染致死。

2.2 治療組總體療效比較

表3示，西藥對照組相關(guān)癥狀緩解較快，但整體緩解率低于中藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，中藥治療各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 清熱涼血方對急性放射性腸炎大鼠血液SOD活性及MDA含量影響

表4示，模型組給藥大鼠血液中SOD活性顯著低于正常組，MDA的含量顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療組大鼠血液中SOD活性高于模型組，MDA含量低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；中藥治療組大鼠血液中SOD活性高于西藥對照組，MDA含量低于西藥對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，顯示清熱涼血方中藥療效優(yōu)于地塞米松；中藥治療組SOD活性、MDA含量無明顯差異，顯示不同的給藥方式不會影響大鼠血液中SOD活性及MDA的表達。

注：與正常組比較：■P<0.01；與模型組比較：★P<0.01；與對照組比較：▲P<0.05

表3 根據(jù)SCCAI及IBDQ評分各治療組不同階段有效率比較

注：各治療組與模型組比較：★P<0.05；與對照組比較：▲P<0.05

表4 給藥4周后各組大鼠血液相關(guān)指標(biāo)水平變化比較

注：與正常組比較：■P<0.05；與模型組比較：★P<0.05；與對照組比較：▲P<0.05

3 討論

放射性腸炎病變范圍可包括小腸、結(jié)腸、直腸[6]，盆腹腔惡性腫瘤經(jīng)放射治療的患者發(fā)生幾率為10%～21%。末端回腸鄰近盆腔照射野且位置相對固定，是損害高發(fā)區(qū)，其中腸黏膜基底部和黏膜上皮細胞表現(xiàn)最為明顯[7]。而放療后引起的腸道組織損傷已經(jīng)成為制約治療效果的主要因素。西藥治療放射性腸炎副反應(yīng)大，病情易反復(fù)，中醫(yī)藥治療具有副反應(yīng)小、并發(fā)癥少等優(yōu)點。與此同時，推廣使用中藥組方，在實用性與經(jīng)濟性方面適合中國國情[8]。

現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)認為放射線屬于熱毒，熱毒與濕邪在腸道相互裹挾，致使腸道氣血壅滯，傳導(dǎo)失司，故而出現(xiàn)腹痛、肛門重墜、里急后重等癥狀。濕熱毒邪灼傷腸道陰絡(luò)，導(dǎo)致腹瀉、黏液便或便血等。清熱涼血方中紫草甘寒，清熱解毒；白頭翁歸大腸經(jīng)，善清胃腸濕熱，二者共用涼血清熱，直折放射熱毒為君藥；生地榆功在清熱、涼血、生肌，治療便血效果上佳；黃連善除脾胃及腸道濕熱，黃柏主入下焦，槐角清熱瀉火，四者為臣協(xié)助君藥引藥直趨病所，直達腸道。生甘草、白芍酸甘化陰，能夠緩解熱毒所致陰津損傷，甘草又可調(diào)和藥性，諸藥合用共奏清熱解毒涼血之功?，F(xiàn)代藥理學(xué)亦表明，白頭翁中含有的三萜類化合物、木脂素及白頭翁皂抗炎作用顯著[9]，硬紫草羥基萘醌提取物可抑制TNBS誘導(dǎo)的腸道炎癥反應(yīng)[10]。陳紅宇等[11]測定地榆提取物對O2-和OH-清除作用的實驗證實，地榆提取物具有清除自由基的作用，清除效果與濃度成正比。黃芪具有顯著抗氧化作用，能夠抑制過氧化脂質(zhì)反應(yīng)[12]。

本實驗研究結(jié)果顯示，清熱涼血方可以改善急性放射性腸炎大鼠的精神狀態(tài)及黏液便、血便等腸道損傷，中藥灌腸、灌胃、灌腸+灌胃3組大鼠的癥狀改善率及血液學(xué)指標(biāo)均未見明顯差異(P<0.05)。藥物口服是目前基本給藥方式之一，臨床操作簡單易行，患者易于接受，療效相對穩(wěn)定，是本實驗推薦的給藥方式。

研究表明，腸道組織局部炎癥反應(yīng)與氧自由基密切相關(guān)[13]。氧自由基生物特性活潑，氧化性強，是細胞活動代謝的副產(chǎn)物，對人體損傷極大[14]。高能射線照射使機體處于應(yīng)激狀態(tài)下，致使細胞代謝明顯增高，超氧離子(O2-)、羥自由基(OH-)等高活性氧產(chǎn)生增多，氧化作用增強，過多的氧自由基攻擊生物結(jié)構(gòu)膜上的不飽和脂肪酸，從而引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)(LPO)，破壞膜的正常結(jié)構(gòu)，改變其流動性，導(dǎo)致穿孔等氧化應(yīng)激性損傷。丙二醛(MDA)等脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，也能夠讓組織中細胞膜結(jié)構(gòu)損傷、蛋白質(zhì)變性和DNA損傷。同時，過多的氧自由基可引起氨基酸殘基突變，致使蛋白質(zhì)的生物特性改變，加速氧化降解進而影響到細胞蛋白質(zhì)的合成與功能。DNA雙螺旋外側(cè)嘧啶和嘌呤同樣對自由基敏感，過多的氧自由基能夠使DNA鏈結(jié)構(gòu)斷裂，引發(fā)細胞凋亡。測定組織中的MDA的含量，不僅可以間接反映組織中氧自由基生成量，而且同時也反映組織生物膜脂質(zhì)過氧化的程度和組織膜結(jié)構(gòu)受損程度[15]。與此同時，機體擁有完整的抗氧化系統(tǒng)。其中酶促防御系統(tǒng)可通過產(chǎn)生過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)等清除氧自由基，中斷鏈鎖反應(yīng)，使氧自由基產(chǎn)生和清除實現(xiàn)動態(tài)平衡。非酶促防御系統(tǒng)和機體自我修復(fù)系統(tǒng)也能夠減少氧自由基對機體的損壞。通過檢測SOD，其結(jié)果可間接反映結(jié)腸組織清除氧自由基的能力[16-17]。氧自由基在體內(nèi)存在時間極短，難于直接檢測，但可通過檢測血液中MDA含量及SOD活性，間接測定體內(nèi)氧自由基活性水平，判斷組織細胞的損傷程度。

實驗結(jié)果表明，清熱涼血方可降低急性放射性腸炎大鼠機體中丙二醛含量，提高超氧化物歧化酶活性，清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕腸黏膜過氧化作用，加快腸道組織損傷修復(fù)，此項研究為清熱涼血方的臨床應(yīng)用提供了更為可靠的實驗依據(jù)。