徐家淳，孫偉明，覃啟京，王 凱，程汝珍，李 強，紀(jì) 靖，周 震Δ

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300150； 2. 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193； 3. 廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院，南寧 530201)

腦血流下降是腦梗死發(fā)生后最直接的表現(xiàn)，也是引起腦組織損害的根本原因[1-2]。腦梗死后缺血中心區(qū)缺乏血流供應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元不可逆性壞死；半暗帶血流灌注較低，但處于動態(tài)變化中，若能及時恢復(fù)血流供應(yīng)，該區(qū)神經(jīng)元可繼續(xù)存活并發(fā)揮功能，神經(jīng)功能可恢復(fù)。因此，及時恢復(fù)血流供應(yīng)，拯救半暗帶是治療腦梗死的關(guān)鍵。本課題組一直致力于化痰通絡(luò)法治療腦梗死的臨床和實驗研究，臨床中發(fā)現(xiàn)該法可有效改善腦梗死患者神經(jīng)功能，提高日常生活能力[3-4]。實驗研究亦發(fā)現(xiàn)，該法能減少溶栓后再梗死，預(yù)防出血轉(zhuǎn)化，保護神經(jīng)元[5-6]。本研究中課題組首次將激光散斑對比成像技術(shù)應(yīng)用于觀察化痰通絡(luò)法改善急性腦梗死大鼠腦血流的動態(tài)變化，為揭示化痰通絡(luò)法治療腦梗死的作用機制提供部分實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級SD雄性大鼠27只，體質(zhì)量240～260 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(合格證號SCXK(京)2012-0001)；大鼠均飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心12 h光照-黑暗交替，室溫23～25 ℃，相對濕度50%～60%。采用隨機數(shù)字表法將27只大鼠隨機分為假手術(shù)1 d、3 d、7 d組，模型1 d、3 d、7 d組，中藥1 d、3 d、7 d組，每組3只。造模前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，食水自由。

1.2 主要試劑與儀器

生理鹽水(石家莊四藥有限公司)；水合氯醛(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)。

激光散斑成像系統(tǒng)(南開大學(xué)電子信息與光學(xué)工程學(xué)院)；T60電磨機(永康市奇創(chuàng)工貿(mào)有限公司)；腦立體定位儀(瑞沃德)。

1.3 化痰通絡(luò)法復(fù)方

化痰通絡(luò)法復(fù)方組成：天麻10 g，半夏10 g，丹參30 g，膽南星5 g，川芎10 g，地龍10 g，酒大黃5 g。將上述藥物400 g(5付)加水濃縮至500 mL，生藥濃度為0.8 g/mL，由天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑中心制備，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 造模

2.1.1 造模時點 按照大鼠分組制備假手術(shù)組1 d、3 d、7 d大鼠，模型組1 d、3 d、7 d MCAO大鼠，中藥組1 d、3 d、7 d MCAO大鼠，每組每個時間點3只大鼠。

2.1.2 造模方法 本實驗參照Longa線栓法[7]將中藥組及模型組大鼠制備大腦中動脈栓塞(MCAO)模型：麻醉大鼠后仰臥位固定，備皮消毒頸部皮膚暴露左側(cè)頸總動脈(CCA)，沿CCA向上分離左側(cè)頸外動脈(ECA)和頸內(nèi)動脈(ICA)，在CCA遠(yuǎn)心端和近心端及ECA靠近分叉處掛棉線備用，微動脈夾暫時夾閉ICA，近心端結(jié)扎CCA、ECA，距CCA分叉5 mm處剪一小口，插入栓線至ICA微動脈夾處，松開動脈夾，棉線拴牢栓線，進栓距分叉處18 mm左右遇到阻力時停止進栓，系牢CCA遠(yuǎn)心端的細(xì)線，常規(guī)清理并縫合手術(shù)創(chuàng)口，消毒手術(shù)切口皮膚。假手術(shù)大鼠僅暴露并分離頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈不進栓，所有實驗大鼠術(shù)前禁食24 h。

2.2 灌胃

2.2.1 灌胃時點 1 d組大鼠在造模結(jié)束大鼠蘇醒后灌胃1次，3 d組大鼠每日灌胃1次共3次，7 d組大鼠每日灌胃1次共7次。

2.2.2 灌胃方法 造模成功后，各組均采用灌胃給藥。中藥給藥劑量參照《藥理實驗方法學(xué)》[8]中“人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表”計算，中藥組大鼠按照7.2 g/kg灌胃，假手術(shù)組及模型組大鼠采用與中藥組相同劑量的蒸餾水在相同時間點灌胃，每日1次。

2.3 激光散斑對比成像技術(shù)檢測腦血流變化

本實驗參照J(rèn)oseph S. Paul等[9]方法，利用激光散斑對比成像技術(shù)觀察MCAO模型大鼠缺血半暗帶腦血流變化。

2.3.1 檢測時點 1 d組大鼠在造模后24 h、3 d組大鼠在造模后72 h、7 d組大鼠在造模后7 d分別進行腦血流檢測。

2.3.2 檢測方法 大鼠麻醉后俯臥位固定于腦立體定位儀上，剃去頭部毛發(fā)，消毒后從頭部正中剪開頭皮及筋膜暴露顱骨，黑色記號筆在距前囟2 mm、中線左側(cè)旁開2 mm處作一長軸約12 mm、短軸約6 mm的橢圓形，沿此橢圓邊緣打磨顱骨，磨薄至硬腦膜外，用眼科鑷在最薄處將該區(qū)域掀開，暴露骨窗作為血流檢測部位，波長為671 nm的激光照射骨窗上，相機芯片上形成血管的動態(tài)散斑圖(成像面積直徑5 mm，曝光時間10 ms，幀頻20 Hz，圖像分辨率1024×1280)，采用matlab程序計算區(qū)域1/K2值的均值作為血流速度。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠腦血流變化

圖1示，激光散斑對比成像偽彩色血流圖顯示，假手術(shù)組大鼠在各個時間點觀測區(qū)血流量豐富，血流速度穩(wěn)定(圖中顏色越深紅代表血流速度越快)；而大腦中動脈栓塞1 d后，模型組和中藥組大鼠觀測區(qū)血流速度下降明顯；3 d和7 d時模型組大鼠腦血流未見明顯恢復(fù)，而中藥組在3 d時即見明顯血流增加，7 d時血流偽彩圖顏色加深，表明血流速度明顯加快。

圖1 各組大鼠偽彩色血流圖

3.2 化痰通絡(luò)法復(fù)方對MCAO模型大鼠相對腦血流影響

表1示，與假手術(shù)組比較，模型組1 d時腦血流速度明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000<0.05)；在3 d時，模型組腦血流速度繼續(xù)降低，7 d時略有增加；中藥組腦血流在1 d亦明顯降低，但在3 d時即明顯增高，血流速度明顯高于模型組(P=0.000<0.05)，且高于假手術(shù)組(P=0.000<0.05)；7 d時中藥組腦血流速度繼續(xù)升高，明顯高于模型組(P=0.000<0.05)和假手術(shù)組(P=0.000<0.05)。

表1 各組大鼠不同時間點相對腦血流速度平均值

注：與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

4 討論

急性腦梗死發(fā)生后腦血流的改變是其特征性改變，也是引起腦梗死后腦損害的直接原因。重建和恢復(fù)半暗帶血運，提高腦梗死后中斷的血流供應(yīng)，是治療腦梗死的重要措施。大量臨床研究證實，中醫(yī)藥療法可有效改善急性腦梗死患者神經(jīng)功能缺損癥狀[10-12]，實驗研究也在揭示中醫(yī)藥療法的作用機制[13-14]。研究表明，中醫(yī)藥療法促進腦梗死患者恢復(fù)可能與改善腦血流有關(guān)。如臨床研究發(fā)現(xiàn)，黃芪桂枝五物湯[15]、補陽還五湯[16]、逐瘀通絡(luò)湯[17]等皆可有效改善腦梗死患者腦血流狀況。而實驗研究顯示，梓葛凍干粉[18]、丹紅注射液等可以明顯改善急性腦梗死大鼠的腦血流。

對大腦血流的檢測，不僅可以通過觀察局部腦血流的速度加深對腦梗死病理過程的認(rèn)識，還可以對腦梗死的治療效果進行直觀評價。目前臨床中常用的腦血流檢測方法有腦電圖[19]、正電子發(fā)射斷層成像[20]和功能性核磁共振成像[21]等，但是這些方法存在著空間分辨率和時間分辨率較低的缺點，且設(shè)備昂貴不適宜于基礎(chǔ)研究。近年來，激光散斑對比度成像技術(shù)(laser speckle contrast analysis，LASCA)逐漸成為一種新興的全景快速成像方法，在臨床醫(yī)學(xué)研究方面應(yīng)用比較廣泛[22-23]。它利用相干光照射在血管上，不僅可快速獲得腦組織高時空分辨率的血管分布二維圖像，同時也可定性顯示血管內(nèi)血液流動速度的變化[24-25]，已被越來越多地用來檢測腦梗死后血流變化[9, 24]。

本研究中課題組采用激光散斑對比成像系統(tǒng)觀察化痰通絡(luò)法復(fù)方對大鼠腦梗死后腦血流的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在大腦中動脈栓塞1 d后，模型組和中藥組大鼠腦血流速度均下降至假手術(shù)組1/2左右，從腦血流變化情況說明造模成功。模型組大鼠腦血流速度在3 d時持續(xù)下降，7 d時腦血流速度與3 d時基本一致，均低于造模后1 d時，表明在未進行干預(yù)情況下，大鼠半暗帶已經(jīng)下降的腦血流未能得到及時、有效的恢復(fù)，符合腦梗死后缺血中心區(qū)和缺血半暗帶動態(tài)變化的病理過程；而中藥組大鼠在化痰通絡(luò)法復(fù)方干預(yù)3 d后，腦血流不僅恢復(fù)甚至略高于正常水平，7 d時腦血流速度為正常水平的159%，表明化痰通絡(luò)法復(fù)方可有效恢復(fù)并提高腦梗死后大腦血流速度。推測化痰通絡(luò)法復(fù)方在治療7 d時腦血流速度提升如此之高的原因與代償供應(yīng)、改善微循環(huán)和為滿足腦梗死后腦血流供應(yīng)有關(guān)。