趙亞男，曾德新，郭德華，蔣 原，蔣魯巖，李鑫妮，陳 偉, 湯 芳，薛 峰，戴建君

腸出血性大腸桿菌O157∶H7是一種危害嚴(yán)重的人獸共患病原體，主要通過(guò)受污染的食物傳播，如牛肉、奶制品、蔬菜和水果[1]。反芻動(dòng)物，特別是牛，是大腸桿菌O157∶H7的主要宿主[2-3]。雖然大腸桿菌O157∶H7對(duì)成年牛沒(méi)有致病性，但卻可以導(dǎo)致人的出血性腹瀉、溶血性尿毒癥綜合征(HUS)以及血栓性血小板減少性紫癜(TTP)。人的感染劑量一般很低，攝入10個(gè)活菌就足以引起感染[4-5]，幼兒最容易感染這種微生物[6-7]。由它引起的溶血性尿毒綜合征可導(dǎo)致紅細(xì)胞的破壞和腎功能衰竭。據(jù)報(bào)道，全球平均每年有3 890例溶血性尿毒癥病例，死亡人數(shù)達(dá)230人[8]。自1982年在美國(guó)首次被分離出來(lái)，并被認(rèn)為是一種新型的腸道致病菌[9]，美國(guó)又發(fā)生了多起該病的暴發(fā)流行[10-11]。此外，加拿大[12]、日本[13]等多個(gè)國(guó)家相繼發(fā)生此病原菌引起的暴發(fā)感染。我國(guó)受此病原菌的威脅也越來(lái)越大，自1986年在江蘇徐州首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，福建、甘肅、安徽等省先后自人畜以及其他動(dòng)物中分離出O157大腸桿菌[14]。

因此，大腸桿菌O157∶H7的檢測(cè)在食品安全、疾病控制、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域受到廣泛的關(guān)注。鑒于現(xiàn)在主流的檢測(cè)方法，如國(guó)標(biāo)法金標(biāo)準(zhǔn)，其檢測(cè)靈敏度高，但工序復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，并對(duì)檢測(cè)人員要求高[15]，使其無(wú)法及時(shí)預(yù)防疫情的暴發(fā)；如分子生物學(xué)方法，其時(shí)效快，成本低，但特異性易受引物、環(huán)境等因素影響而產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果[16]。而基于單克隆抗體的ELISA方法檢測(cè)病原體具有簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)。因此本研究利用抗O157∶H7特異性單克隆抗體2G5及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記單克隆抗體2E3 (HRP-2E3)，建立雙抗體夾心ELISA方法，為大腸桿菌O157∶H7提供可靠的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1菌株與抗體 38株O157∶H7和沙門(mén)氏菌、志賀桿菌等29株菌種由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存(見(jiàn)表2)，本次實(shí)驗(yàn)所用的2株大腸桿菌O157∶H7單克隆抗體(2G5、2E3)的雜交瘤細(xì)胞由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室篩選獲得。

1.2主要試劑與設(shè)備 脫脂奶、BSA、Tween 20購(gòu)自南京鼎思生物技術(shù)有限公司，10×PBS購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司，TMB單組份顯色液、辣根過(guò)氧化物酶購(gòu)自Sigma公司，PCR Kit 購(gòu)自Takara公司，DNA提取試劑盒購(gòu)自 TIANGEN公司，新生霉素增菌肉湯購(gòu)自北京陸橋公司，PCR儀為美國(guó)ABI公司，電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)均為上海天能公司，酶標(biāo)儀為西班牙基立福公司。

1.3PCR引物設(shè)計(jì)與合成 以大腸桿菌O157∶H7的菌體抗原基因rfbE[17-18]為目的基因，參考陳雅君等[19]報(bào)道的引物序列(表1)，委托金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成。

表1 rfbE基因引物序列及預(yù)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度
Tab.1 Primer sequence of rfbE and expected amplification length

引物序列(5'-3')擴(kuò)增長(zhǎng)度/bprfbE-FACTACAGGTGAAGGTGGAATG327rfbE-RTTCCTCTCTTTCCTCTGCGGT

1.4單克隆抗體的純化與標(biāo)記 凍融實(shí)驗(yàn)室存儲(chǔ)的單克隆抗體腹水，根據(jù)Protein A預(yù)裝重力柱(上海斯信生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化并進(jìn)行SDS-PAGE分析，測(cè)定單抗純度后凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

取純化后的單克隆抗體2E3，與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)進(jìn)行偶聯(lián)，得到酶標(biāo)記抗體(HRP-2E3)。采用過(guò)碘酸鈉法進(jìn)行標(biāo)記[20]，原理是過(guò)碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基，可與加入的IgG上的氨基形成Schiff氏堿而結(jié)合。

1.5雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的建立 以2G5為捕獲抗體，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記單克隆抗體2E3(HRP-2E3)為檢測(cè)抗體建立雙抗體夾心ELISA 檢測(cè)方法。具體步驟如下：①抗體包被：將2G5用包被液稀釋至一定濃度后包被酶標(biāo)板，每孔100 μL，4 ℃包被過(guò)夜；②封閉：PBST洗滌3次后，每孔300 μL封閉液于37 ℃進(jìn)行封閉；③加抗原：PBST洗滌3次，拍干，加入待測(cè)菌液，每孔100 μL，37 ℃孵育；④加酶標(biāo)抗體：PBST洗3次，拍干，酶標(biāo)抗體(HRP-2E3)稀釋至適宜濃度后，每孔100 μL，37 ℃孵育；⑤加底物顯色：洗板4次，拍干后每孔加入100 μL TMB單組份顯色液，置于37 ℃避光顯色；⑥終止：用2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，每孔100 μL，于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔OD值。

為了得到最優(yōu)檢測(cè)體系，分別對(duì)2G5包被濃度(1∶100、1∶200、1∶400、1∶800)，HRP-2E3檢測(cè)濃度(1∶100、1∶200、1∶400、1∶800)[21]，封閉液(1%BSA、2%BSA、10%BSA、1%明膠、2%明膠、5%脫脂奶)，最佳封閉時(shí)間(60 min、90 min、120 min)，抗原作用時(shí)間(45 min、60 min、90 min、120 min)，酶標(biāo)抗體作用時(shí)間(45 min、60 min、90 min、120 min)以及顯色液顯色時(shí)間(5 min、10 min、15 min、20 min)進(jìn)行優(yōu)化。

1.6雙抗體夾心ELISA靈敏度的檢測(cè) 將大腸桿菌O157∶H7培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(OD600=0.6，平板計(jì)數(shù)確定濃度為1×108CFU/mL)，0.4%甲醛滅活24 h后，用無(wú)菌PBS進(jìn)行10倍比稀釋得 10～108CFU/mL濃度菌液，按照已優(yōu)化好的最佳條件進(jìn)行雙抗體夾心ELISA檢測(cè)，每個(gè)濃度做3孔平行檢測(cè)，確定靈敏度。

1.7雙抗體夾心ELISA特異性的檢測(cè) 受試菌株包括38株O157∶H7和29株其它菌種，菌濃度均為108CFU/mL，驗(yàn)證建立的雙抗體夾心ELISA方法的特異性，同時(shí)使用國(guó)標(biāo)方法及PCR方法進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證。

1.8雙抗體夾心ELISA重復(fù)性的檢測(cè) 板內(nèi)重復(fù)性檢測(cè)，選取1×108、1×107、1×106、1×105CFU/mL這4個(gè)濃度進(jìn)行分析，每個(gè)濃度做5個(gè)重復(fù)，計(jì)算其板內(nèi)變異系數(shù)。板間重復(fù)性檢測(cè)，選擇同樣的濃度在5塊不同的酶標(biāo)板上不同時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算其板間變異系數(shù)。

1.9 樣品檢測(cè)

1.9.1模擬樣品檢測(cè) 構(gòu)建人工污染牛肉樣品，使用建立的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法，PCR檢測(cè)方法和國(guó)標(biāo)培養(yǎng)法對(duì)比檢測(cè)，驗(yàn)證所建立的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的實(shí)用性。

牛肉樣品(購(gòu)自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)附近農(nóng)貿(mào)市場(chǎng))，用超純水沖洗干凈后經(jīng)組織搗碎機(jī)加工成肉餡，用國(guó)標(biāo)培養(yǎng)法確定無(wú)O157∶H7自然污染后，置于高壓滅菌鍋內(nèi)121 ℃滅菌20 min。冷卻后，人工污染大腸桿菌O157∶H7，接種劑量分別為104、103、102、10、1 CFU/25 g，每個(gè)接種量設(shè)置3個(gè)平行，并以無(wú)菌生理鹽水作空白對(duì)照，取各濃度劑量人工污染樣品和空白無(wú)污染樣品25 g于 225 mL 新生霉素增菌肉湯，使用拍擊式均質(zhì)器連續(xù)均質(zhì)2 min，在37 ℃，100 r/min搖床增菌培養(yǎng)。

增菌至4、6、8、10 h，分別從各濃度增菌液和空白菌液取3份樣品，每份1 mL，800 r/min離心3 min去除沉渣，吸上清，10 000 r/min離心5 min，PBS洗滌3次，重懸后煮沸10 min，用上述建立的雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)；同樣取4、6、8、10 h增菌液，每份1 mL，設(shè)3個(gè)平行對(duì)照，PBS洗滌去除油脂和沉渣后，使用TINAGEN試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA，參考陳雅君等[19]報(bào)道的PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行PCR檢測(cè)；參照GB 4789.36-2016，增菌24 h后，對(duì)不同濃度人工污染樣品和空白無(wú)污染樣品進(jìn)行國(guó)標(biāo)法檢測(cè)。

1.9.2實(shí)際樣品檢測(cè) 從南京農(nóng)業(yè)大學(xué)附近的農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、超市采集100份樣品(牛肉40份、豬肉20份、雞肉20份、鮮奶20份)，用已建立的雙抗體夾心ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用國(guó)標(biāo)(GB 4789.36-2016)對(duì)比檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1SDS-PAGE檢測(cè)純化后2E3、2G5抗體純度 結(jié)果見(jiàn)圖1，在50 kDa和25 kDa處分別出現(xiàn)兩條蛋白帶，它們分別與鼠IgG重鏈和輕鏈的分子量相符合，說(shuō)明純化效果比較好。

注：M為蛋白Marker；1為純化前2E3；2為純化后2G5；3為純化前2G5；4為純化后2G5圖1 純化前后2E3、2G5單抗的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of monoclonal antibodies (2E3 and 2G5) before and after purification

2.22G5和HRP-2E3工作濃度的測(cè)定 方陣法測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，基于檢測(cè)效果和經(jīng)濟(jì)性考慮，選擇2G5抗體1∶400稀釋(4.48 μg/mL)，HRP-2E3抗體1∶100稀釋(19.9 μg/mL)為最終工作濃度，此時(shí)陽(yáng)性值OD450≈1，P/N值為26.15。

表2 2G5和HRP-2E3工作濃度測(cè)定結(jié)果
Tab.2 Results of working concentrations of 2G5 and HRP-2E3

酶標(biāo)抗體HRP-2E3稀釋倍數(shù)單克隆抗體2G5稀釋倍數(shù)P值N值1∶1001∶2001∶4001∶8001∶1001∶2001∶4001∶8001∶1001.5171.3421.0640.5090.0380.0650.0400.0581∶2000.3860.3360.3440.2260.0630.0370.0400.0351∶4000.2280.2180.1990.1300.0330.0290.0260.0201∶8000.1620.1890.1510.0900.0500.0320.0330.031

注：P值為陽(yáng)性樣品OD450nm值；N值為陰性樣品OD450nm值

2.3最佳封閉液及封閉時(shí)間的優(yōu)化 封閉對(duì)ELISA反應(yīng)至關(guān)重要，可以減少非特異性吸附，提高反應(yīng)的靈敏度及特異性。以陽(yáng)性孔OD450值與陰性對(duì)照孔OD450值之比(P/N值)最大為最優(yōu)條件，經(jīng)測(cè)定5%脫脂奶為最適封閉液(圖2A)，1.5 h為最佳封閉時(shí)間(圖2B)。

注：A最適封閉液的確定；B最佳封閉時(shí)間的確定圖2 最適封閉液及封閉時(shí)間的確定Fig.2 Determination of optimal blocking solution and blocking time

2.4抗原、酶標(biāo)抗體及顯色液作用時(shí)間的優(yōu)化 反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短會(huì)對(duì)OD450nm值產(chǎn)生影響，為提高反應(yīng)的特異性和靈敏度，本次實(shí)驗(yàn)分別對(duì)抗原、酶標(biāo)抗體及顯色液作用時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，P/N值最大判定為最優(yōu)條件。結(jié)果如圖3所示，抗原、酶標(biāo)抗體(HRP-2E3)、TMB單組份顯色液最佳作用時(shí)間分別為90 min(圖3A)、45 min(圖3B)、10 min(圖3C)。

圖3 抗原、酶標(biāo)抗體及顯色液作用時(shí)間的優(yōu)化Fig.3 Optimization of reaction time of antigen, enzyme-labeled antibody and chromogenic liquid

2.5雙抗體夾心ELISA靈敏度檢測(cè) 對(duì)10～108CFU/mL的8個(gè)濃度梯度的菌液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示，每個(gè)濃度做3個(gè)平行，隨著抗原濃度的降低，檢測(cè)OD450nm值也隨之下降(見(jiàn)圖4A)，以測(cè)定孔與陰性孔OD值之比大于2.1為陽(yáng)性的判斷標(biāo)準(zhǔn)，本方法對(duì)大腸桿菌O157∶H7的檢測(cè)限為 1×105CFU/mL，此時(shí)比值為2.21(見(jiàn)圖4B)。

2.6雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的特異性 同時(shí)使用建立的雙抗夾心ELISA方法、PCR檢測(cè)法和國(guó)標(biāo)方法對(duì)38株大腸桿菌O157∶H7和29株其他菌株進(jìn)行特異性檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。ELISA檢測(cè)方法和國(guó)標(biāo)法相同，38株大腸桿菌O157∶H7檢測(cè)結(jié)果顯示陽(yáng)性，其他29株菌株檢測(cè)結(jié)果為陰性，與預(yù)期結(jié)果一致，顯示了高度的特異性。PCR檢測(cè)法和其他兩種方法的檢出結(jié)果也基本一致，但是溫和氣單胞菌出現(xiàn)了假陽(yáng)性結(jié)果，可見(jiàn)相比培養(yǎng)法和免疫學(xué)檢測(cè)方法，PCR等分子生物學(xué)檢測(cè)方法在特異性方面還存在一定的弊端。

注：A為每個(gè)稀釋度的OD450nm值；B為每個(gè)稀釋度的P/N值圖4 雙抗體夾心ELISA靈敏度檢測(cè)Fig.4 Sensitivity test of established double-antibody sandwich ELISA

表3 特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
Tab.3 Results of specific test

菌株編號(hào)數(shù)量ELISA檢測(cè)結(jié)果PCR檢測(cè)結(jié)果國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果大腸桿菌O157∶H7ATCC 438591+++EH1-EH3737+++大腸桿菌ATCC 259221---大腸桿菌O127∶H6AH1-11---大腸桿菌O8AH3-41---大腸桿菌O20AH3-521---大腸桿菌O25JS2-31---大腸桿菌O78JS2-51---大腸桿菌O128JS2-311---大腸桿菌K88JS3-71---沙門(mén)氏菌JS 5-31---單核細(xì)胞增多李斯特菌ATCC1---銅綠假單胞菌ATCC359231---表皮葡萄球菌ATCC122281---最小弧菌CICC104741---霍亂弧菌BNCC2320301---創(chuàng)傷弧菌CICC103831---

表3(續(xù))

菌株編號(hào)數(shù)量ELISA檢測(cè)結(jié)果PCR檢測(cè)結(jié)果國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果奇異變形桿菌CMCC490051---普通變形桿菌CMCC490271---弗氏耶爾森菌ATCC237151---副溶血弧菌ATCC338471---枯草芽孢桿菌NJXW 18050281---志賀桿菌NJXW 18050331---金黃色葡萄球菌NJXW 18050011---嗜水氣單胞菌NJXW 18030281---副豬嗜血桿菌NJXW 18011---臘樣芽孢桿菌NJXW 17110011---禽分支桿菌NJXW 1305067 1---鴨疫里氏桿菌NJXW 18030011---溫和氣單胞菌NJXW 18030391-+-鏈球菌NJXW 17110201---

注：“+”代表陽(yáng)性，“-”代表陰性

2.7雙抗體夾心ELISA重復(fù)性檢測(cè) 由檢測(cè)結(jié)果可知，板內(nèi)變異系數(shù)小于5%(見(jiàn)表4)，板間變異系數(shù)小于7%(見(jiàn)表5)，板間變異系數(shù)略大于板內(nèi)變異系數(shù)，可能是由于每天環(huán)境條件不同，如溫度和濕度變化有關(guān)，也可能與溶液的再制備有關(guān)，但均小于10%，說(shuō)明建立的ELISA檢測(cè)方法具有較好的重復(fù)性和精密度[22-23]。

表4 板內(nèi)重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果
Tab.4 Results of intraplate repeatability test

菌濃度(CFU/mL)1×1081×1071×1061×105A孔1.0961.0070.4480.105B孔1.0070.9640.5070.112C孔1.0160.9340.4780.107D孔0.9920.9440.4950.115E孔0.9950.9480.4880.109平均值(x)1.0210.9590.4830.110標(biāo)準(zhǔn)差(s)0.0430.0290.0220.004變異系數(shù)(CV%)4.202.994.623.63

表5 板間重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果
Tab.5 Results of interplate repeatability test

菌濃度(CFU/mL)1×1081×1071×1061×105酶標(biāo)板11.1050.9950.5150.100酶標(biāo)板21.0670.9590.5310.108酶標(biāo)板30.9800.93704600.101酶標(biāo)板41.0290.9900.4940.103酶標(biāo)板50.9910.8870.4650.091平均值(x)1.0340.9540.4930.101標(biāo)準(zhǔn)差(s)0.0520.0440.0310.006變異系數(shù)(CV%)5.054.626.256.15

2.8 樣品檢測(cè)

2.8.1牛肉模擬樣品檢測(cè) 雙抗體夾心ELISA檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表6，以測(cè)定孔與陰性孔OD值之比大于2.1為陽(yáng)性的判斷標(biāo)準(zhǔn)，增菌4 h、6 h、8 h、10 h后，檢測(cè)靈敏度分別為102CFU/25 g、10 CFU/25 g、1 CFU/25 g、1 CFU/25 g?？梢?jiàn)經(jīng)8 h增菌培養(yǎng)后，建立的ELISA檢測(cè)方法對(duì)牛肉中大腸桿菌O157∶H7的檢測(cè)限可達(dá)1 CFU/25 g。

普通PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)平行，增菌4 h、6 h、8 h后，檢測(cè)靈敏度分別為104CFU/25 g、102CFU/25 g、10 CFU/25 g，增菌10 h后，才可檢測(cè)到1CFU/25 g，且陽(yáng)性條帶較淺。陰性樣品均無(wú)條帶，說(shuō)明檢測(cè)過(guò)程無(wú)污染。該方法增菌8 h后對(duì)牛肉樣品檢測(cè)靈敏度只能達(dá)到10 CFU/25 g，比ELISA檢測(cè)降低一個(gè)數(shù)量級(jí)。

按照國(guó)標(biāo)法操作規(guī)范對(duì)不同濃度污染樣品和無(wú)污染樣品進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)可疑菌落挑選和大腸桿菌O157∶H7干制生化鑒定試劑盒鑒定，各濃度污染樣均為檢測(cè)陽(yáng)性，且空白樣為檢測(cè)陰性，說(shuō)明國(guó)標(biāo)培養(yǎng)法檢測(cè)靈敏度很高，達(dá)1 CFU/mL，但是其檢測(cè)周期較長(zhǎng)，需7 d左右，對(duì)于有些H鞭毛不易凝集的菌株，其檢測(cè)周期更長(zhǎng)。

表6 牛肉模擬樣品檢測(cè)結(jié)果
Tab.6 Results of beef simulation sample test

樣品劑量(cfu)104103102101空白4 h+++---6 h++++--8 h+++++-10 h+++++-

注：A為增菌4 h；B為增菌6 h；C為增菌8 h；D為增菌10 h；1-3為104 CFU/25 g；4-6為103 CFU/25 g；7-9為102 CFU/25 g；10-12為10 CFU/25 g；13-15為1 CFU/25 g；16-18為陰性樣品；19為陽(yáng)性對(duì)照；20為陰性對(duì)照?qǐng)D5 樣品增菌4、6、8、10 h rfbE基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 Results of rfbE gene amplification after sample enrichment for 4, 6, 8 and 10 h

2.8.2實(shí)際樣品檢測(cè) 用已建立的夾心ELISA檢測(cè)方法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法(GB 4789.36-2016)分別對(duì)100份樣品進(jìn)行檢測(cè)，兩種方法結(jié)果一致，均為陰性，進(jìn)一步證明了所建立方法的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。

3 討 論

大腸桿菌O157∶H7是一種嚴(yán)重的食源性致病微生物，常常引起食品安全事故，威脅著我們的生命安全[24-25]。因此，建立高效、快速的檢測(cè)方法是預(yù)防和及時(shí)發(fā)現(xiàn)該暴發(fā)的關(guān)鍵因素。單克隆抗體因其具有專(zhuān)一的特異性，性質(zhì)穩(wěn)定，一經(jīng)制備可長(zhǎng)時(shí)間獲得等優(yōu)勢(shì)而廣泛應(yīng)用于疾病的診斷。因此，本實(shí)驗(yàn)利用前期制備的2株抗大腸桿菌O157∶H7單克隆抗體建立夾心ELISA檢測(cè)方法。該免疫學(xué)方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和檢測(cè)周期短等優(yōu)點(diǎn)。

包被是雙抗體夾心ELISA實(shí)驗(yàn)非常重要的一步，若抗體包被濃度過(guò)低，不能完全覆蓋固相載體表面，使捕獲抗體吸附的抗原量不夠，則可能出現(xiàn)假陰性；若包被濃度過(guò)高，抗體分子間的相互作用就會(huì)造成蛋白分子層疊，在隨后的洗滌過(guò)程中，這些抗體容易被洗去，影響實(shí)驗(yàn)的靈敏度。制得的酶標(biāo)記抗體需要確定其最適工作濃度，濃度過(guò)高，則可使非特異性反應(yīng)增加，陰性結(jié)果偏高；而濃度過(guò)低又可影響測(cè)定的敏感性。所以本實(shí)驗(yàn)通過(guò)方陣法，確定了最佳的抗體包被濃度(4.48 μg/mL)和酶標(biāo)抗體反應(yīng)濃度(19.9 μg/mL)。

為了驗(yàn)證建立的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的實(shí)用性，設(shè)計(jì)人工污染牛肉樣品，用ELISA檢測(cè)法同PCR和國(guó)標(biāo)培養(yǎng)法進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，從靈敏度、檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)等因素綜合分析，展現(xiàn)其在實(shí)際樣品檢測(cè)中的優(yōu)越性。結(jié)果顯示，選擇性前增菌8 h后，ELISA檢測(cè)靈敏度可達(dá)1 CFU/25 g，比PCR檢測(cè)高一個(gè)數(shù)量級(jí)。國(guó)標(biāo)法需增菌18～24 h，才可達(dá)到1 CFU/25 g的檢測(cè)靈敏度；而完成整個(gè)檢測(cè)過(guò)程，ELISA只需5～6 h，而國(guó)標(biāo)培養(yǎng)法則需要7 d乃至更長(zhǎng)時(shí)間。由此可見(jiàn)，建立的ELISA檢測(cè)法集合了國(guó)標(biāo)培養(yǎng)法檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)和PCR法檢測(cè)周期短的優(yōu)點(diǎn)，更能滿足實(shí)際應(yīng)用的需求。

本實(shí)驗(yàn)建立的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法對(duì)污染樣品的檢測(cè)靈敏度高于吳大成等[14]采用雙抗體夾心ELISA的檢測(cè)方法，增菌培養(yǎng)12 h后，最低檢測(cè)限為0.4～4 CFU/g；黃海燕等[26]40 ℃增菌8 h檢測(cè)限為2 CFU，即 0.08 CFU/g；以及宋宏新等[27]增菌14 h，檢測(cè)線為0.1～0.2 CFU/g。因此，本檢測(cè)方法具有較好的特異性及靈敏度，可用于實(shí)際樣品中大腸桿菌O157∶H7檢測(cè)。

綜上所述，本次實(shí)驗(yàn)建立的雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法特異性、靈敏度、精密度良好，優(yōu)于國(guó)標(biāo)法及普通PCR檢測(cè)。但是最近有學(xué)者[28]用一種新的方法(紙基夾心ELISA)檢測(cè)大腸桿菌，該方法檢測(cè)快速，不需依賴(lài)酶標(biāo)儀等昂貴儀器，整個(gè)操作過(guò)程不到1 h，并且其最低檢測(cè)限為1×105CFU/mL，靈敏度較高，可以用于現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)?？梢灶A(yù)見(jiàn)如將所建立的ELISA體系應(yīng)用于紙基微流控芯片，建立紙基夾心ELISA檢測(cè)方法，將會(huì)大大縮短檢測(cè)的時(shí)間及成本，取得更為可觀的效果。

利益沖突：無(wú)