程 劼，韓彩芹，謝建春，蘇曉鷗*，王培龍*

1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京 100081 2. 江蘇師范大學(xué)物理與電子工程學(xué)院，先進(jìn)激光材料與器件江蘇省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221116 3. 北京工商大學(xué)，食品營(yíng)養(yǎng)與人體健康先進(jìn)創(chuàng)新中心，北京 100048

引 言

丙烯酰胺(acrylamide, AAm)，1994年被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)列為2A級(jí)致癌物質(zhì)。 研究表明，AAm具有神經(jīng)毒性，生殖毒性，遺傳毒性，免疫毒性。 其中神經(jīng)毒性已經(jīng)在人體內(nèi)得到證實(shí)[1]。 AAm是工業(yè)上廣泛使用的一種化工原料，在富含淀粉類食品(如馬鈴薯、烘烤面包，焙烤咖啡等)的高溫加工中(通常>120℃)伴隨著美拉德反應(yīng)產(chǎn)生。 存在于食品中的AAm對(duì)人體存在極大的暴露風(fēng)險(xiǎn)。 2012年，歐洲食品安全局(EFSA)制定食品中AAm的限量水平[2]。 2017年，歐盟明確了食品原料中如面包，烘烤咖啡，嬰幼兒食品中AAm的限量值為300～850 μg·kg-1 [3]。 對(duì)AAm的控制和監(jiān)控勢(shì)在必行。 目前，分析AAm的方法主要包括大型儀器設(shè)備分析和快速分析兩大類。 前者一般包括如氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[4]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜[5]等方法。 這些方法通常需要昂貴的儀器設(shè)備，且樣品前處理過程較為復(fù)雜。 近年來，也有一些基于比色法[6]、量子點(diǎn)磷光探針[7]、熒光猝滅傳感[8]等快速分析方法的報(bào)道。 表面增強(qiáng)拉曼光譜(surface-enhanced Raman scattering，SERS)是近年來發(fā)展迅速的一種快速檢測(cè)技術(shù)，它是入射光激發(fā)納米尺度金屬材料產(chǎn)生的一種拉曼散射增強(qiáng)效應(yīng)，基于電磁場(chǎng)物理增強(qiáng)(EM)和化學(xué)電荷轉(zhuǎn)移化學(xué)增強(qiáng)(CT)的增強(qiáng)機(jī)制，可實(shí)現(xiàn)對(duì)單分子的高靈敏“指紋”識(shí)別，信號(hào)增強(qiáng)104～1014倍，檢測(cè)靈敏度可達(dá)ng甚至pg水平。 借助SERS高靈敏分析的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，利用SERS實(shí)現(xiàn)對(duì)AAm的檢測(cè)分析也見文獻(xiàn)報(bào)道。 如Wang等設(shè)計(jì)合成了PDA@AgNPs復(fù)合型納米基底，實(shí)現(xiàn)了飲用水中AAm在0. 04 μg·L-1水平上的高靈敏分析[9]。 該方法靈敏度高，但基底保存周期較短(2個(gè)月)，一定程度上影響了方法的實(shí)用性。 Gezer研究組也開發(fā)了玉米蛋白負(fù)載納米金復(fù)合增強(qiáng)體系，對(duì)AAm的檢測(cè)靈敏度為10 μg·mL-1 [10]。 本課題組也開發(fā)出一種基于氧化石墨烯負(fù)載納米金的增強(qiáng)基底，實(shí)現(xiàn)對(duì)煎炸食品中AAm的快速分析，檢測(cè)時(shí)間9.5 min·樣-1，靈敏度達(dá)2 μg·kg-1 [11]，基底保存周期180 d。 利用SERS實(shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)際樣品基質(zhì)中目標(biāo)物的高靈敏分析有兩個(gè)重要因素。 一是基底構(gòu)筑是實(shí)現(xiàn)高敏分析的關(guān)鍵，基底的穩(wěn)定性決定了分析方法的實(shí)用性； 二是樣品基質(zhì)復(fù)雜，干擾成分多，需要輔助快速的樣品前處理技術(shù)，最大程度降低樣品基質(zhì)的干擾。 基于分子印跡、抗體特異性識(shí)別等的技術(shù)可與SERS方法聯(lián)用[12]，實(shí)現(xiàn)SERS分析前樣品凈化。 這其中，保證高回收率是關(guān)鍵。 研究采用QuECHERS(Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe)技術(shù)，結(jié)合AgNR@AuNPs復(fù)合基底，5 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)煎炸食品中AAm的高靈敏分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

拉曼光譜儀(自行研制)： 785 nm激光器，10×物鏡； 電子束蒸鍍系統(tǒng)(DE 500, DE Technology)； 場(chǎng)發(fā)射電鏡(SU 8010, Hitachi, Tokyo, Japan)。 丙烯酰胺(≥99%，Sigma-Aldrich)； 吸附劑(含4.0 g MgSO4和0.5 g NaCl，Agilent Technologies)； QuEChERS分散萃取料包(150 mg MgSO4，50 mg PSA，P/N: 5982—5022)； 銀與鈦(99.9%，Kurt J. Lesker)； 氯金酸(純度≥99.0%，上海國(guó)藥集團(tuán))； 10份煎炸樣品采集于貴陽、廈門等3地市場(chǎng)。

1.2 基底制備與表征

AuNPs的制備采用經(jīng)典的檸檬酸鈉還原氯金酸的方法。 首先將氯金酸(1 Wt%, 50 mL)加熱至沸騰，隨后逐滴加入檸檬酸三鈉(1 Wt%, 35 mL)，待混合物變成紅褐色后繼續(xù)加熱20 min，撤去熱源攪拌至室溫。 AgNR的制備應(yīng)用掠入射沉積法(oblique angle deposition)在電子束蒸鍍系統(tǒng)上制備。 玻璃襯底用乙醇超聲清洗5 min，N2流干燥，5×10-7Torr，濺射角0°。 依次鈦(20 nm，0.2 nm·s-1)、銀(100 nm, 0.3 nm·s-1)靶材鍍膜，隨后調(diào)整濺射角86°，鍍膜2 000 nm。 最后通過射頻等離子體(28 W)氬氣清洗基底30 s。 場(chǎng)發(fā)射電鏡進(jìn)行基底結(jié)構(gòu)表征。 以AAm標(biāo)液(c=10 μg·L-1) 為探針，測(cè)試AuNPs (70 nm)，AgNPs (70 nm)，AgNR，AgNR@AuNPs的SERS活性。

1.3 樣品前處理與SERS分析

1.0 g樣品中加入4 mL正己烷，在陶瓷均質(zhì)器中混勻1 min。 依次加入8 mL混合溶劑(水/乙腈，V/V=1∶1)和吸附劑，混合1 min，12 000 r·min-1離心10 s，移取下層1 mL，加入QuEChERS分散固相萃取料包，振蕩20 s，12 000 r·min-1離心10 s，收集上層液待測(cè)。 分別移取10 μL AuNPs與10 μL待測(cè)液混合，分取10 μL于AgNR表面，進(jìn)行拉曼光譜掃描。 單次掃描時(shí)間4 s，掃描5個(gè)點(diǎn)取平均，光譜采用“Savitzky-Golay”二階導(dǎo)數(shù)變換法處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)表征

AgNR@AuNPs中AgNR長(zhǎng)L=(990±50) nm； 直徑D=(100±8) nm； Ag陣列間距S=(105±10) nm，AgNR水平傾角β=74°±2°。 AuNPs粒徑70 nm。 AuNPs分別負(fù)載于AgNR表面及AgNR納米棒之間，產(chǎn)生高密度增強(qiáng)“熱點(diǎn)”(圖1)。

圖1 AgNR SEM (a)俯視圖； (b) 剖面圖； 復(fù)合基底SEM (c) 俯視圖； (d) 剖面圖

Fig.1(a)Topviewand(b)cross-sectionalSEMimagesoftheAgNRsubstrate; (C)Topviewand(D)cross-sectionalSEMimagesofthecompositesubstrate

2.2 基底優(yōu)化與SERS活性

樣品混合順序也影響分析靈敏度。 圖3對(duì)比了兩種混合順序，即(1)將樣品首先與AuNPs混合，然后再轉(zhuǎn)移至AgNR上； (2)將AuNPs轉(zhuǎn)移至AgNR上，再加入樣品對(duì)SERS分析的影響。 方法(1)比(2)具有更高的I1 482。 樣品中AAm首先與AuNPs相互作用，形成“靜電復(fù)合物”，更多的AAm受AuNPs熱點(diǎn)影響，轉(zhuǎn)移至AgNR表面后，部分未發(fā)生作用的AAm在AgNR熱點(diǎn)作用下，也同時(shí)產(chǎn)生SERS信號(hào)。 而將AuNPs預(yù)先轉(zhuǎn)移至AgNR表面，樣品后加入，AAm在液固界面分布較為分散，處于熱點(diǎn)區(qū)域AAm濃度較低，表現(xiàn)出較弱的I1 482。

圖2 (a)四種基底拉曼活性對(duì)比; (b) 檸檬酸鈉用量對(duì)I1 482影響

Fig.2(a)TheenhancedSERSspectraofAAmstandardsolutioninthepresenceoffourdifferentsubstrates; (b)DifferentadditionamountsofaqueoussodiumcitratevsI1 482

圖3 操作順序影響

2.3 基底保存穩(wěn)定性

AgNR@AuNPs表面容易被氧化，需充氮密封保存。 每次使用前利用稀硝酸(10-7mol·L-1)浸沒清洗基底，除去表面氧化物，隨后用無水甲醇沖洗兩次，自然風(fēng)干后使用。 為考察基底穩(wěn)定性，在第0, 1, 3, 7, 14, 30, 60, 120和180 d進(jìn)行基底活性測(cè)試。 從圖4中可以看到基底在0～180 d內(nèi)，I1 482基本趨于穩(wěn)定，RSD=7.73%。

圖4 基底保存時(shí)間對(duì)I1 482影響

2.4 樣品前處理

2.4.1 除脂溶劑優(yōu)化

煎炸類食品富含油脂類化合物，去除油脂干擾有利于提高SERS分析的靈敏度。 以油條(GC-MS方法確證[14])為考察基質(zhì)，對(duì)比正己烷、環(huán)己烷和甲苯的除脂效果。 如圖5所示，正己烷除脂最佳。

圖5 除脂溶劑效果對(duì)比

2.4.2 提取溶劑優(yōu)化

AAm極性較強(qiáng)，常選用水作為提取溶劑。 以油條、薯?xiàng)l和油炸方便面為基質(zhì)，賦值濃度10 μg·kg-1。 表1可以看到，利用水∶乙腈(V/V=1∶1)作為提取溶劑，回收率高于水和乙腈。 進(jìn)一步優(yōu)化了水與乙腈的用量比，固定提取溶劑體積8 mL，體積比在1∶7～7∶1之間變化，回收率見表1。 當(dāng)水∶乙腈(V/V=1∶1)時(shí)，回收率較佳。

表1 提取溶劑優(yōu)選

2.4.3 QuECHERS材料優(yōu)選

比較了兩種凈化材料(MgSO44.0 g+NaCl 0.5 g和MgSO44.0 g+CH3COONa 2.0 g)的凈化效果。 選擇MgSO4+NaCl作為凈化材料回收率較高，這可能是由于NaCl具有防止乳化的功能，此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]。

表2 QuECHERS材料對(duì)回收率的影響

2.5 方法性能

選擇油炸方便面作為基質(zhì)(GC-MS分析AAm陰性)，賦值樣品濃度分別為c=5, 10, 30, 50, 100 μg·kg-1。 圖6所示I1 482與c呈較好線性關(guān)系(R2=0.985)。 靈敏度(1 μg·kg-1)采用空白樣品I1 478三倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算所得，結(jié)果通過添加回收驗(yàn)證，靈敏度高于EU規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn)(300～800 μg·kg-1)，能滿足實(shí)際應(yīng)用的需求。 也對(duì)薯?xiàng)l、油條等基質(zhì)進(jìn)行了線性和靈敏度測(cè)試，由于每種類型基質(zhì)組成的差異性，SERS反映的背景吸收也不同，但I(xiàn)1 478處與c相關(guān)性良好，結(jié)果相似。

圖6 基質(zhì)添加譜圖與線性曲線

方法回收率，精密度和穩(wěn)定性通過基質(zhì)添加考察(表3)。 對(duì)于薯?xiàng)l和方便面基質(zhì)，回收率與課題組先前研究的利用石墨烯負(fù)載納米金進(jìn)行AAm分析所得數(shù)據(jù)幾乎一致[13]，這也證明了方法的可靠性。 在5個(gè)濃度水平下回收率77.1%～93.6%，RSD均小于4.0%，回收率和精密度與原有報(bào)道相比均有所改善。 日間與日內(nèi)精密度RSD從原來6.8%下降至5.5%。 這可能是由于與液相基底相比，AgNR固相基底的有序性提高了分析穩(wěn)定性。

表3 回收率

表4 日間與日內(nèi)精密度

2.6 樣品分析

采用建立的SERS方法對(duì)10份煎炸樣品進(jìn)行分析，并與GC-MS進(jìn)行對(duì)比。 從表5中可發(fā)現(xiàn)，SERS沒有出現(xiàn)“假陰性”或者“假陽性”，但結(jié)果普遍比GC-MS結(jié)果高，這可能與所用拉曼光譜儀分辨率有關(guān)系，較低分辨導(dǎo)致Δν=1 482 cm-1處重疊峰無法分離和識(shí)別。

表5 實(shí)際樣品分析結(jié)果

a濃度低于方法檢測(cè)限(1 μg·kg-1)

abelow the detection limit (1 μg·kg-1)

3 結(jié) 論

建立了一種基于復(fù)合納米結(jié)構(gòu)的煎炸食品中丙烯酰胺的SERS快速分析方法。 利用AgNR@AuNPs作為增強(qiáng)基底，基底保存時(shí)間不少于180天，并結(jié)合QuECHERS凈化方法，5 min內(nèi)完成檢測(cè)，分析靈敏度1 μg·kg-1，在5～100 μg·kg-1濃度范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)定量分析(R2=0.985)，平均回收率77.1%～93.6%，RSD小于4.0%。 所建立的方法有望用于食品安全現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。