楊 敏

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 香料研究所，昆明 650201； 2.云南大學(xué) 教育部自然資源藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650091)

蒜頭果(MalaniaoleiferaChun et S. Lee)又名馬蘭后、咪民、猴子果、山桐果等[1]，常綠喬木，屬鐵青樹科(Olacaceae)蒜頭果屬，是我國特有單種屬稀有植物。蒜頭果是國家二級(jí)保護(hù)樹種，廣西重點(diǎn)保護(hù)野生植物，僅分布于廣西西部和云南東南部的狹窄地帶，生長于石灰?guī)r的山坡、山腳雜木林中土壤濕潤肥沃的地方。國外無蒜頭果資源也未見有關(guān)蒜頭果的研究報(bào)道，國內(nèi)植物學(xué)家對(duì)蒜頭果研究的歷史也很短，直到1980年，廣西植物研究所的李樹剛教授才正式發(fā)表蒜頭果的拉丁名為Malaniaoleifera，并將其置于鐵青樹科。蒜頭果種仁富含油脂，含油率高達(dá)51.85%～67.0%，油中脂肪酸主要為油酸、棕櫚酸和硬脂酸等，為良好的木本油料[2]。蒜頭果油中含有二十四碳-15-烯酸，其是一種長鏈單不飽和脂肪酸，具有活躍腦細(xì)胞，治療身體免疫缺乏性疾病、心血管疾病等功用，是合成麝香酮的理想原料[2]。目前有關(guān)蒜頭果的研究并不多，且主要側(cè)重在種質(zhì)資源調(diào)查[3]、育苗技術(shù)[4]、營林、瀕危機(jī)制[5]、所含油脂的利用等方面[6]，對(duì)蒜頭果蛋白的研究鮮有報(bào)道。

本文以蒜頭果種仁為原料，通過粉碎、抽提、硫酸銨沉淀、疏水色譜層析等分離手段，分離純化出蒜頭果蛋白，分析測(cè)定了其相對(duì)分子質(zhì)量、氨基酸組成、等電點(diǎn)、中性糖含量等基本理化指標(biāo)及細(xì)胞活性，為蒜頭果蛋白作為新藥的研發(fā)奠定基礎(chǔ)，為蒜頭果資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蒜頭果種仁，購自云南文山。Hiprep 16/10 Phenyl FF(High Sub,20 mL)層析柱,Amersham公司；考馬斯亮藍(lán)G-250；β-巰基乙醇，Amresco公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

Amersham AKTA explorer 100蛋白純化系統(tǒng)，Amersham Hoefer SE260蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)，HITACHI CR21G高速冷凍離心機(jī)，CHRIST ALPHA1-4真空冷凍干燥機(jī)，Amersham小型濕法電轉(zhuǎn)儀，Molecular Devices Corporation Spectra Max190超級(jí)酶標(biāo)儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蒜頭果蛋白的提取、純化

將蒜頭果種仁搗碎，加入pH 7.2的磷酸鹽緩沖液中4℃浸提過夜，紗布過濾，離心去除不溶物，上清液加入30%～80%硫酸銨梯度沉淀。用少量去離子水溶解沉淀，離心，收集沉淀充分透析，真空冷凍干燥得粗蛋白干粉。用20 mmol/L pH 7.2磷酸鹽緩沖液(內(nèi)含25 mol/L(NH4)2SO4)平衡疏水預(yù)裝柱Hiprep 16/10 Phenyl FF(High Sub)后，沉淀用20 mmol/L pH 7.2的磷酸鹽緩沖液溶解后進(jìn)樣，用去離子水按0%～100%線性梯度洗脫，流速為4 mL/min，按峰高用分部收集器收集目標(biāo)蛋白(malanin)。

1.2.2 純度鑒定

SDS-PAGE檢測(cè)產(chǎn)物純度：分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為3%，考馬斯亮藍(lán)G-250染色[7]。蒜頭果蛋白取樣量為20 μL，在處理蒜頭果蛋白樣品時(shí)，為了驗(yàn)證蒜頭果蛋白中的二硫鍵，分別在上樣緩沖液中一個(gè)加入5 μLβ-巰基乙醇，另一個(gè)則不加β-巰基乙醇，在相同條件下各煮沸5 min變性后，再進(jìn)行SDS-PAGE以進(jìn)行比較。

1.2.3 相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定

樣品送至上海中科新生命生物科技有限公司采用基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)測(cè)定。

1.2.4 氨基酸含量的測(cè)定

用6 mol/L鹽酸將蒜頭果蛋白回流煮沸24 h左右，使之水解成游離的氨基酸，采用氨基酸自動(dòng)分析儀分析各氨基酸的含量。

采用堿水解-熒光分光光度法測(cè)定色氨酸含量。在蛋白質(zhì)的氫氧化鈉水解液中，能檢測(cè)到色氨酸和酪氨酸的熒光。在pH為11時(shí)，色氨酸的熒光強(qiáng)度比酪氨酸的大100倍，且兩種氨基酸的熒光峰相差40 nm，因此在有大量酪氨酸存在的情況下可用熒光分光光度法測(cè)定色氨酸含量。實(shí)驗(yàn)方法按文獻(xiàn)[8]進(jìn)行，在熒光分光光度計(jì)上，測(cè)定蒜頭果蛋白氫氧化鈉水解液的熒光強(qiáng)度。根據(jù)色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度曲線，計(jì)算蒜頭果蛋白色氨酸含量。

1.2.5 等電點(diǎn)的測(cè)定

將蒜頭果蛋白干粉樣品送至上海中科新生命生物科技有限公司采用平板等點(diǎn)聚焦法(IEF-PAGE)測(cè)定蒜頭果蛋白的等電點(diǎn)。

1.2.6 中性糖含量的測(cè)定

1.2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

采用硫酸苯酚法[9-11]進(jìn)行中性糖含量的測(cè)定。以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)，參照袁燕等[12]的方法在波長490 nm[13]下測(cè)定不同質(zhì)量濃度的葡萄糖溶液的吸光度，以葡萄糖溶液質(zhì)量濃度(Y)為縱坐標(biāo)，吸光度(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=0.008 07+0.031 52X(R=0.998 14)。

1.2.6.2 樣品中性糖含量的測(cè)定

取已知質(zhì)量濃度的蒜頭果蛋白溶液250 μL于2 mL離心管中(2個(gè)平行樣)，加入150 μL 6%的苯酚，渦旋混勻，再迅速滴入750 μL濃硫酸，渦旋混勻，于90℃水浴20 min。待樣品冷卻至室溫后每個(gè)樣品吸取200 μL轉(zhuǎn)移至96孔酶標(biāo)板于酶標(biāo)儀上讀取 490 nm 處的吸光度,計(jì)算中性糖含量。中性糖含量=V×w/m×100%，式中：V為樣品稀釋后的體積，w為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的糖質(zhì)量濃度，m為樣品的質(zhì)量。

1.2.7 蒜頭果蛋白質(zhì)譜鑒定

應(yīng)用SDS-PAGE將蒜頭果蛋白分離出蒜頭果蛋白-A和蒜頭果蛋白-B 2條蛋白帶，從膠中切取目的蛋白條帶，經(jīng)脫色液脫色，二硫蘇糖醇還原，碘乙酰胺烷基化，胰蛋白酶酶解，三氟乙酸萃取和用ZipTip C18柱脫鹽處理，將制備好的樣品與基質(zhì)按1∶1 混勻后點(diǎn)于靶上，采用MALDI-TOF-MS分析(激光波長337 nm，加速電壓20 kV,正離子模式檢測(cè)，質(zhì)譜信號(hào)為單次掃描累加)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定[14]。

1.2.8 自由巰基含量的測(cè)定

DTNB(Ellman’s reagent)可以與巰基結(jié)合，形成的復(fù)合物在412 nm處有光吸收，因而可以用此法對(duì)蛋白中的自由巰基定量。實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行。

取一塊96孔酶標(biāo)板，選取一塊4 mm×4 mm的區(qū)域每孔加入DTNB工作液200 μL、50 μL Tris-HCl緩沖溶液(1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0)、50 μL DTNB貯液(2 mmol/L DTNB，50 mmol/L乙酸鈉)、100 μL蒸餾水，再分別加入50 μL 160 μmol/L胰蛋白酶(由PDB結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫查詢得知胰蛋白酶不含自由巰基，可作為陰性對(duì)照)、蒜頭果蛋白、BSA(由PDB結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫查得每分子BSA含1個(gè)自由巰基，可作為陽性對(duì)照)，空白對(duì)照加入50 μL蒸餾水，每個(gè)樣品設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，37℃放置10 min，于酶標(biāo)儀上讀取412 nm處的吸光度。

1.2.9 蒜頭果蛋白的細(xì)胞活性測(cè)定

將Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)和Hela(人宮頸癌細(xì)胞)在含有10%滅活小牛血清的DMEM培養(yǎng)液內(nèi)，37℃、5%CO2條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，同時(shí)將蒜頭果蛋白干粉配成質(zhì)量濃度分別為50、10、1、0.1 μg/mL的溶液，在無菌室的超凈工作臺(tái)上用一次性過濾器(0.22 μm)過濾除菌后，點(diǎn)樣(50 μL/孔)，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后，用倒置顯微鏡觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 蒜頭果蛋白的分離純化

圖1為280 nm下蒜頭果蛋白分離純化的疏水色譜層析圖。從圖1可以看出，在280 nm下吸收值最大的吸收峰即為蒜頭果蛋白。另外，在蒜頭果蛋白分離純化過程中發(fā)現(xiàn)，硫酸銨沉淀時(shí)，最佳的硫酸銨飽和度區(qū)間是30%～50%，是蛋白集中沉淀區(qū)。

圖1 蒜頭果蛋白分離純化的疏水色譜層析圖

2.2 蒜頭果蛋白的純度鑒定

圖2為蒜頭果蛋白的SDS-PAGE圖。由圖2可見，非還原的蒜頭果蛋白樣品只有1條非常清晰的條帶，說明蒜頭果蛋白純度比較高，而用β-巰基乙醇處理后還原的蒜頭果蛋白則被裂解成A、B 2條帶，說明蒜頭果蛋白是一種雙鏈蛋白質(zhì)。

注：1.標(biāo)準(zhǔn)蛋白； 2.粗蛋白； 3.非還原的蒜頭果蛋白；4.還原處理的蒜頭果蛋白。

圖2 蒜頭果蛋白的SDS-PAGE圖

2.3 蒜頭果蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量

圖3為蒜頭果蛋白B鏈的質(zhì)譜圖。 B鏈的表觀相對(duì)分子質(zhì)量約為30 kDa(見圖2)，結(jié)合圖3可知，B鏈相對(duì)分子質(zhì)量為29 444.7 Da，前面出現(xiàn)的兩個(gè)峰分別為二價(jià)峰和三價(jià)峰。經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定完整的蒜頭果蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為61 875 Da，因而A鏈相對(duì)分子質(zhì)量為32 430.3 Da。

圖3 蒜頭果蛋白B鏈的質(zhì)譜圖

2.4 蒜頭果蛋白的氨基酸含量

蒜頭果蛋白的氨基酸組成測(cè)定結(jié)果見表1。由表1可見，蒜頭果蛋白中含有18種氨基酸，其中天冬氨酸含量最高，蛋氨酸含量最低。

表1 蒜頭果蛋白的氨基酸組成 %

2.5 蒜頭果蛋白等電點(diǎn)

蒜頭果蛋白的平板等點(diǎn)聚焦電泳圖如圖4所示。由圖4可見，蒜頭果蛋白的等電點(diǎn)約為4.6。

注：圖中左邊泳道為Marker，從上往下依次為pH 9.6、pH 8.2、pH 8、pH 7.8、pH 7.5、pH 7.1、pH 7、pH 6.5、pH 6、pH 5.1、pH 4.75、pH 4.5，右邊泳道為蒜頭果蛋白。

圖4 蒜頭果蛋白的平板等點(diǎn)聚焦電泳圖

2.6 蒜頭果蛋白中性糖含量

SDS-PAGE中蒜頭果蛋白能被高碘酸-Schiff(PAS)染成紫紅色，說明其是一種糖蛋白。實(shí)驗(yàn)測(cè)得蒜頭果蛋白中性糖含量為6.0%，蒜頭果蛋白的A鏈中性糖含量為10.4%，B鏈不含糖。

2.7 蒜頭果蛋白的質(zhì)譜鑒定

按照1.2.7方法，采用MALDI-TOF-MS和ESI-MS/MS分別測(cè)得A鏈和B鏈肽質(zhì)量酶譜，在蛋白質(zhì)Peptldent數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，沒有發(fā)現(xiàn)與蒜頭果蛋白相匹配的蛋白質(zhì)序列，因此可以確定蒜頭果蛋白為新蛋白質(zhì)。

2.8 蒜頭果蛋白自由巰基含量

蒜頭果蛋白自由巰基含量的測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 DTNB法測(cè)定蒜頭果蛋白自由巰基的含量

由表2可知，與DTNB工作液反應(yīng)后，蒜頭果蛋白、胰蛋白酶溶液的A412與空白相近，而BSA溶液的A412明顯高出許多?？蓳?jù)此得出結(jié)論：蒜頭果蛋白不含自由巰基。

2.9 蒜頭果蛋白細(xì)胞活性

按1.2.9方法，發(fā)現(xiàn)點(diǎn)樣后培養(yǎng)1 d就可以觀察到細(xì)胞的病變，用倒置顯微鏡觀察，開始時(shí)有部分細(xì)胞緊縮，然后可見整片的細(xì)胞呈網(wǎng)狀，繼而細(xì)胞發(fā)生崩解。與陰性對(duì)照比較，蒜頭果蛋白表現(xiàn)出非常強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性，即使在0.1 μg/mL質(zhì)量濃度下，Hela和Vero細(xì)胞2 d后全部死亡。圖5、圖6分別為觀測(cè)的未加蒜頭果蛋白、加蒜頭果蛋白(0.1 μg/mL)培養(yǎng)的Hela細(xì)胞。

圖5 未加蒜頭果蛋白培養(yǎng)的Hela細(xì)胞

圖6 加蒜頭果蛋白(0.1 μg/mL)培養(yǎng)后的Hela細(xì)胞

有研究發(fā)現(xiàn)蒜頭果蛋白能抑制肝癌細(xì)胞HepG-2的生長[16]，對(duì)人白血病HL-60細(xì)胞的生長具有明顯的抑制作用，且呈一定的劑量和時(shí)間依賴性[17]，具有明顯抑制人白血病K562細(xì)胞體外生長的作用[18]。

3 結(jié) 論

本研究采用磷酸鹽緩沖溶液浸提、硫酸銨沉淀、疏水色譜層析得到了高純度的蒜頭果蛋白(malanin)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)最佳的硫酸銨飽和度區(qū)間是30%～50%，是蛋白集中沉淀區(qū)。蒜頭果蛋白含有18種氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為61 875 Da，等電點(diǎn)為4.6，中性糖含量為6.0%，由A、B鏈通過二硫鍵連接而成。本研究發(fā)現(xiàn)蒜頭果蛋白具有抑制Hela和Vero細(xì)胞體外生長的作用，且毒性非常大，具有用于免疫毒素治療癌癥的應(yīng)用前景。蒜頭果蛋白的理化性質(zhì)以及細(xì)胞毒理學(xué)有待進(jìn)一步深入研究。