程 妍，曲瑋茵，鄭文博，楊 媚，廖美德，周而勛，舒燦偉

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東省微生物信號(hào)與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，群體微生物研究中心，廣東 廣州 510642)

由立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKuhn AG1-IA)引起的水稻紋枯病是世界性的水稻病害之一[1]。近年來(lái)，隨著水稻矮稈多蘗品種的密植以及氮肥過(guò)量施用等原因[2]，水稻紋枯病逐漸成為危害水稻生產(chǎn)的第一大病害[3]，每年可導(dǎo)致數(shù)億公斤水稻產(chǎn)量的損失，嚴(yán)重時(shí)可以使水稻減產(chǎn)50%，甚至絕收[4-5]?；瘜W(xué)防治由于其具有經(jīng)濟(jì)高效、防治簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)一直被用于防治水稻紋枯病。但是，過(guò)度使用化學(xué)藥劑引發(fā)了眾多隨之而來(lái)的問(wèn)題，如環(huán)境污染、紋枯病菌耐藥性增強(qiáng)等。因此，開(kāi)發(fā)廣譜、高效、低毒、環(huán)保的微生物農(nóng)藥用于防治水稻紋枯病迫在眉睫。

近年來(lái)，植物病害的生物防治引起了廣泛的關(guān)注，研究者也對(duì)植物潛在的抗病機(jī)理進(jìn)行了探索。植物與病原生物在長(zhǎng)期互作、協(xié)同進(jìn)化中逐漸形成了一系列防衛(wèi)機(jī)制，即植物受物理、化學(xué)或生物方法處理后，對(duì)隨后某種或某些病原物的侵染所產(chǎn)生的誘導(dǎo)抗病性。壞死型病原物侵染或某些生化制劑誘導(dǎo)處理后，植株未受侵染或處理部位產(chǎn)生對(duì)隨后病原物侵染的抗性，稱為系統(tǒng)性獲得抗性(Systemic acquired resistance，SAR)[6]，這種抗性是在水楊酸(Salicylic acid，SA)以及病程相關(guān)蛋白(Pathogenesis-related proteins，PR蛋白)的積累后誘發(fā)的。NPR1(Nonexpressor of PR genes 1)基因是控制SA積累的關(guān)鍵基因[7]，能夠激活多種抗病相關(guān)基因(PR1等)的表達(dá)，提高植物的抗病性[8]。另一種與SAR相似的抗性表型可以被一些非致病性的細(xì)菌刺激，稱為誘導(dǎo)性系統(tǒng)抗性(Induced systemic resistance，ISR)[9-10]。與SAR不同，ISR是由茉莉酸和乙烯(Jasmonic acid/ethylene，JA/ET)信號(hào)傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)的[11-12]。

目前已有很多報(bào)道表明，生防菌可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生SAR或ISR從而提高植物對(duì)病原菌的抗病性。在水稻中，陳志誼等[13]報(bào)道了枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Bs-916可以誘導(dǎo)苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)等抗病性有關(guān)的酶類活性大幅度提高，從而控制水稻紋枯病(R.solani)和稻曲病(Ustilaginoideaoryzae)的發(fā)生[14]。戴秀華[15]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)Lx-11能夠誘導(dǎo)PR4、PR10a、LOX等基因的表達(dá)以及過(guò)氧化物酶(POD)、SOD等抗氧化酶活性的變化，從而起到防止水稻細(xì)菌性條斑病菌(Xanthomonasoryzae)侵染與蔓延的作用。近年來(lái)，Rais等[16]也報(bào)道了芽孢桿菌(Bacillusspp.)KFP-5等菌株可以誘導(dǎo)水稻體內(nèi)SOD和POD等抗氧化防御酶活性的提高，從而降低稻瘟病(Pyriculariaoryzae)的發(fā)病率。

在其他作物中，Viswanathan等[17]報(bào)道了甘蔗根際促生菌株可誘導(dǎo)甘蔗對(duì)鐮刀菌的抗病反應(yīng)，經(jīng)處理后甘蔗組織中幾丁質(zhì)酶、POD等防御酶的水平顯著提高。Sharma等[18]研究發(fā)現(xiàn)，惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)CRN-09和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)CRN-16能夠協(xié)同誘導(dǎo)綠豆的系統(tǒng)抗性，從而抑制了殼球孢菌(Macrophominaphaseolina)的侵染。Droby等[19]發(fā)現(xiàn)了假絲酵母菌(Candidaoleophila)能誘導(dǎo)葡萄柚的系統(tǒng)性抗性，抑制果實(shí)采后腐爛病菌青霉菌的孢子萌發(fā)和芽管生長(zhǎng)。除了生防菌本身的直接誘導(dǎo)作用，其產(chǎn)生的活性物質(zhì)同樣可以誘導(dǎo)植物的抗性。芽孢桿菌(Bacillussp.)JS菌株的揮發(fā)物通過(guò)激活PR基因的表達(dá)并誘導(dǎo)煙草植株產(chǎn)生系統(tǒng)抗性[20]。棘孢木霉(Trichodermaasperellum)T-34菌株產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物可以局部觸發(fā)根系中鐵穩(wěn)態(tài)的重新調(diào)整，通過(guò)啟動(dòng)依賴于JA的防御系統(tǒng)從而誘發(fā)植物產(chǎn)生ISR[21]。

根據(jù)梁小文等[22]之前的報(bào)道，克里本類芽孢桿菌(Paenibacilluskribbensis)PS04可以抑制水稻紋枯病菌的生長(zhǎng)并激發(fā)水稻的系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性[23]，其發(fā)酵液的最高防治效率達(dá)93.65%，粗代謝產(chǎn)物的最高防治效率為73.85%[24]。在國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目的支持下，熱帶與亞熱帶真菌研究室利用該菌株制備成了生防菌劑，在廣東省內(nèi)的水稻生產(chǎn)基地進(jìn)行了大面積的推廣示范，取得良好的田間防病促生效果，但有關(guān)該菌對(duì)水稻的誘導(dǎo)抗病機(jī)理和抗病途徑的調(diào)控還不清楚。因此，本研究的目的是揭示在克里本類芽孢桿菌處理下水稻抗病相關(guān)基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，并確定該菌誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗病性的途徑。

1 材料和方法

1.1 PS04發(fā)酵液的制備

將PS04菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中活化，將活化好的種子培養(yǎng)液，按5%的比例接種到改良查氏培養(yǎng)液(3%蔗糖，0.15% NaNO3，0.1% K2HPO4，0.05% MgSO4，0.05% KCl，0.001% FeSO4)中，在30 ℃條件下以180 r/min培養(yǎng)84 h得到發(fā)酵原液。發(fā)酵原液稀釋200倍后用于噴施水稻。

1.2 水稻的種植和處理

將水稻(品種9311)催芽后播于白色的箱中，每盆6排，每排10株，共播15盆。待稻苗長(zhǎng)至三葉一心期時(shí)進(jìn)行人工噴施處理，接種菌液量為100 mL/盆，以清水噴施為對(duì)照。以不處理的樣本為0 h。噴施24 h后開(kāi)始計(jì)時(shí)取樣，再按3，6，9，12，24 h分別采集葉片，立即投入液氮中，于-80 ℃冰箱保存。

1.3 cDNA第一鏈合成及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用Plant RNA Extraction Kit(TaKaRa，中國(guó)，大連)提取水稻葉片的總RNA，用DNase Ⅰ(TaKaRa，中國(guó)，大連)處理后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript 1stStrand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，中國(guó)，大連)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)在Bio-Rad熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國(guó)，加利福尼亞州)上進(jìn)行反應(yīng)。Real-time PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，退火溫度15 s，72 ℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3個(gè)技術(shù)重復(fù)和3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。本研究所用引物序列如表1所示。相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析，以水稻Actin基因?yàn)閮?nèi)參。顯著性分析用SPSS 23軟件(IBM，美國(guó)，紐約)進(jìn)行。

表1 使用的PCR引物序列Tab.1 Sequences of all PCR primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 PS04誘導(dǎo)PR途徑基因表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果表明，PS04菌株發(fā)酵液能夠誘導(dǎo)水稻防衛(wèi)反應(yīng)基因OsPR1、OsPR2、OsPR3、OsPR4、OsPR5、OsPR10和OsPR16的表達(dá)。OsPR1基因在第9小時(shí)表達(dá)量最高隨后下降；OsPR2基因在9 h表達(dá)量較高，此后緩慢降低，到24 h表達(dá)量達(dá)到最大值；OsPR3、OsPR4、OsPR5和OsPR16基因從3 h逐漸升高至6 h出現(xiàn)峰值，隨后急劇下降；OsPR10基因從9 h升高至12 h表達(dá)量最高隨后急劇下降；NPR1基因在第3小時(shí)表達(dá)量最高隨后急劇下降(圖1)。但本研究發(fā)現(xiàn)，水稻的OsPR6、OsPR8、OsPR9、OsPR13和OsPR14基因均不表達(dá)。

2.2 PS04誘導(dǎo)SA途徑基因表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果表明，PS04菌株發(fā)酵液能夠誘導(dǎo)基因PAL和OsNAC4的表達(dá)。PAL基因在6 h表達(dá)量急劇升高到最大值隨后急劇降低；OsNAC4基因從3 h逐漸升高至9 h出現(xiàn)峰值，在此后緩慢降低，但直到24 h的表達(dá)量仍顯著高于對(duì)照(圖2)，說(shuō)明生防菌對(duì)水稻誘導(dǎo)抗性作用與水楊酸合成途徑有關(guān)。

2.3 PS04誘導(dǎo)JA途徑基因表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果表明，PS04菌株發(fā)酵液能夠誘導(dǎo)LOX基因的表達(dá)。AOS2基因在未噴施菌株發(fā)酵液時(shí)表達(dá)很高，噴施后表達(dá)受到抑制，表達(dá)量從3 h逐漸升高至6 h出現(xiàn)高峰，在此后急劇下降，且直到24 h的表達(dá)量與對(duì)照相比均顯著降低，這說(shuō)明該基因的表達(dá)是受到抑制的；LOX基因在3 h時(shí)表達(dá)量急劇升高到峰值隨后急劇下降(圖3)。這些結(jié)果表明，該菌對(duì)水稻誘導(dǎo)抗性作用與茉莉酸合成途徑也有關(guān)，發(fā)揮主要誘導(dǎo)作用的是LOX基因。

圖1 PS04誘導(dǎo)水稻PR途徑基因表達(dá)Fig.1 Effect of PS04 on the expression of PR pathway genes in rice plant

圖2 PS04誘導(dǎo)水稻SA途徑基因表達(dá)Fig.2 Effect of PS04 on the expression of SA pathway genes in rice plant

2.4 PS04誘導(dǎo)ET途徑基因表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果表明，EIN2基因在3 h與對(duì)照相比顯著降低，3 h后逐漸升高至9 h出現(xiàn)小高峰，此后緩慢降低，但到24 h的表達(dá)量達(dá)到最大值，且與對(duì)照相比仍然顯著升高(圖4)。結(jié)果表明，生防菌對(duì)水稻誘導(dǎo)抗性作用與乙烯合成途徑有關(guān)。

圖3 PS04誘導(dǎo)水稻JA途徑基因表達(dá)Fig.3 Effect of PS04 on the expression of JA pathway genes in rice plant

圖4 PS04誘導(dǎo)水稻ET途徑基因表達(dá)Fig.4 Effect of PS04 on the expression of ET pathway gene in rice plant

3 討論

本研究利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)水稻應(yīng)答克里本類芽孢桿菌PS04處理后誘導(dǎo)抗性相關(guān)基因的表達(dá)譜進(jìn)行表達(dá)分析。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PS04菌株誘導(dǎo)了水稻防衛(wèi)反應(yīng)基因OsPR1、OsPR2、OsPR3、OsPR4、OsPR5、OsPR10、OsPR16的表達(dá)，說(shuō)明克里本類芽孢桿菌對(duì)水稻具有誘導(dǎo)抗性作用。但對(duì)于水稻抗性基因的誘導(dǎo)具有明顯的時(shí)間特性，推測(cè)其原因是PS04菌株誘導(dǎo)一定時(shí)間后相關(guān)抗性基因表達(dá)水平逐步達(dá)到峰值，抗病水平也達(dá)到最高，但隨著時(shí)間的推移，生防菌在植物體內(nèi)的濃度逐漸下降直至消失，誘導(dǎo)的抗病性水平也隨之下降[25]。NPR1被認(rèn)為是SA和JA途徑交叉的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，是植物系統(tǒng)性抗性的重要調(diào)節(jié)中心。NPR1基因在細(xì)胞核內(nèi)的積累是誘導(dǎo)水楊酸(SA)介導(dǎo)的PR基因表達(dá)和SAR產(chǎn)生的充分必要條件。NPR1通過(guò)與TGA轉(zhuǎn)錄因子相互作用調(diào)控PR基因表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)NPR1基因在3 h時(shí)表達(dá)量最高，隨后表達(dá)量迅速下降，PS04處理可以很快誘導(dǎo)NPR1的表達(dá)。在其他研究中，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)PTS-394誘導(dǎo)番茄抗病信號(hào)通路節(jié)點(diǎn)基因NPR1在24～72 h得到了顯著表達(dá)；煙草的NPR1基因在枯草芽孢桿菌(B.subtilis)OKB105處理12 h后有明顯的表達(dá)[26]；普城沙雷菌(Serratiaplymuthica)A21-4處理辣椒后體內(nèi)的NPR1基因從第3天顯著增加到第7天表達(dá)量達(dá)到最大[27]。因此本研究發(fā)現(xiàn)，克里本類芽報(bào)桿菌誘導(dǎo)水稻的NPR1基因顯著表達(dá)的時(shí)間是接種后3 h，這個(gè)時(shí)間點(diǎn)比其他菌株報(bào)道的時(shí)間快，說(shuō)明噴施PS04后，水稻的抗性相關(guān)基因很快就被調(diào)動(dòng)起來(lái)。

JA通常與ET協(xié)同發(fā)揮其刺激抗性的作用，ET/JA信號(hào)會(huì)對(duì)SA信號(hào)通路產(chǎn)生負(fù)向影響，從而微調(diào)植物的防御反應(yīng)。本研究選取了2個(gè)SA途徑相關(guān)基因PAL、OsNAC4進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果顯示，PAL基因在6 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值，隨后急劇降低；OsNAC4基因在9 h時(shí)表達(dá)量最高隨后下降。這2個(gè)基因的表達(dá)量變化受到克里本類芽孢桿菌顯著誘導(dǎo)，說(shuō)明克里本類芽孢桿菌是通過(guò)SA途徑起誘導(dǎo)抗性的作用。JA合成途徑開(kāi)始于α亞麻酸，LOX和AOS是該途徑的2個(gè)重要的基因。本研究發(fā)現(xiàn)，受克里本類芽孢桿菌處理后，LOX基因在3 h時(shí)表達(dá)量最高隨后急劇下降，說(shuō)明克里本類芽孢桿菌也通過(guò)JA途徑起作用。張榮勝[28]的研究也發(fā)現(xiàn)，噴施解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliguefaciens)Lx-11 24 h后水稻植株中PAL和NPR1基因的表達(dá)量達(dá)到最大值，隨著時(shí)間的增加，基因表達(dá)水平有所降低，LOX基因的表達(dá)水平也有所提高。因此本研究發(fā)現(xiàn)，克里本類芽孢桿菌可能是通過(guò)JA途徑介導(dǎo)的誘導(dǎo)抗性。綜上，本研究的結(jié)果表明，克里本類芽孢桿菌可以同時(shí)誘導(dǎo)水稻的SAR和ISR途徑基因的表達(dá)，從而提高了水稻的抗病性。