李佳銳,張萃雯,劉化龍,王敬國(guó),孫 健,李 寧, 雷 蕾,李憲偉,鄒德堂,鄭洪亮

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 寒地糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與生理生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱 150030)

氣候變化和不合理的灌溉使全球鹽堿地的面積日趨增加。據(jù)統(tǒng)計(jì),全世界鹽堿地的面積約為9.54億hm2,且每年以1.0×106～1.5×106hm2的速度增長(zhǎng)[1]。松嫩平原西部是我國(guó)最主要的內(nèi)陸鹽堿地集中區(qū)之一,同時(shí)也是世界三大片蘇打鹽漬土集中分布區(qū)之一,鹽堿化土地面積300萬(wàn)hm2。鹽堿地種稻是改良鹽堿地最有效的手段之一,所以改良水稻耐鹽、堿性是鹽堿地種稻的前提。已有研究表明,水稻苗期對(duì)鹽、堿脅迫最為敏感[2],而苗期迅速返青成活是鹽堿地種稻的關(guān)鍵。鹽脅迫主要造成離子毒害和滲透脅迫,增加土壤滲透勢(shì)[3],使植株體內(nèi)的Na+含量升高,并影響K+的吸收,引起離子平衡失調(diào),進(jìn)而引起植物體內(nèi)的各種生理變化[4]。堿脅迫會(huì)使植株變矮,葉面積指數(shù)變小,分蘗減少,葉綠素含量降低,進(jìn)而生物學(xué)產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量下降[5-7]。鹽、堿雙重脅迫則會(huì)阻礙水稻的生長(zhǎng)發(fā)育,使細(xì)胞代謝減慢,光合作用和呼吸作用受阻。過(guò)度鹽堿害甚至還會(huì)導(dǎo)致水稻死亡[8]。綜上,鹽、堿脅迫不僅會(huì)限制水稻的生產(chǎn)面積進(jìn)一步擴(kuò)大,而且還會(huì)降低水稻產(chǎn)量。

近年來(lái),國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者對(duì)水稻的耐鹽、堿性進(jìn)行了大量的QTL定位研究。Sabouri等[9]定位到與耐鹽等級(jí)、苗高、和苗干質(zhì)量相關(guān)的6個(gè)QTL。Thomson等[10]利用NILs群體定位到了27個(gè)控制水稻苗期耐鹽相關(guān)性狀的QTL。祁棟靈[11]利用堿脅迫高產(chǎn)106/長(zhǎng)白9號(hào)的F2:3家系群體,檢測(cè)到7個(gè)影響水稻發(fā)芽率的QTL,6個(gè)影響水稻堿害率的QTL。楊靜[12]利用Lemont和特青的雙向回交導(dǎo)入系群體,檢測(cè)到了18個(gè)與耐鹽性相關(guān)的QTL。Lee等[13]利用NILs群體定位到2個(gè)影響水稻苗期鹽害級(jí)別的QTL。顧興友等[14]利用Pokkali和Peta的BC1群體,檢測(cè)到4個(gè)影響水稻苗期和成熟期耐鹽性的QTL。邢軍等[15]利用東農(nóng)425和長(zhǎng)白10號(hào)的RIL群體,檢測(cè)到5個(gè)耐鹽QTL和10個(gè)耐堿QTL。目前,在鹽脅迫下對(duì)水稻Na+、K+濃度的QTL定位研究較多,但在堿脅迫下的相關(guān)研究少有報(bào)道,同一試驗(yàn)中在鹽、堿脅迫條件下同時(shí)進(jìn)行研究和比較的分析更是鮮見(jiàn)報(bào)道。因此,在鹽、堿脅迫條件下同時(shí)對(duì)水稻Na+、K+的遺傳機(jī)制進(jìn)行研究具有重大意義,更為耐鹽、堿水稻的品種選育奠定基礎(chǔ)。

本研究利用小白粳子/空育131衍生的含有200個(gè)株系的RIL群體,及其包含142個(gè)SSR標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜對(duì)鹽、堿脅迫條件下水稻苗期鹽、堿害級(jí)別、地上部Na+濃度、K+濃度及Na+/K+進(jìn)行QTL分析,旨在進(jìn)一步獲得耐鹽、堿主效QTL,為水稻耐鹽、堿性QTL的精細(xì)定位和分子輔助選擇育種提供科學(xué)依據(jù)并奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以陸稻品種小白粳子為母本,耐鹽、堿水稻品種空育131為父本配置雜交組合,通過(guò)“單粒傳”得到了包含200個(gè)家系的F9群體材料。

1.2 水稻苗期耐鹽性和耐堿性鑒定

試驗(yàn)于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院水稻育種研究室內(nèi)進(jìn)行,試驗(yàn)共設(shè)鹽脅迫和堿脅迫2種處理。選取籽粒飽滿的種子在50 ℃烘干48 h打破休眠,用0.5%次氯酸鈉處理10 min進(jìn)行表面消毒,再用清水沖洗3次后催芽。每個(gè)家系及親本種子選取24粒露白發(fā)芽一致種子播種于底部剪孔的PCR板中,置于15 L盛有水的塑料盤中,用pH值5.5左右的清水培養(yǎng)至三葉一心期。鹽脅迫將清水換成含120 mmol/L NaCl的營(yíng)養(yǎng)液處理12 d,營(yíng)養(yǎng)液的pH維持在5.5左右,堿脅迫將清水換成40 mmol/L NaHCO3營(yíng)養(yǎng)液處理12 d,pH維持在8.5左右,每2 d換1次營(yíng)養(yǎng)液。在鹽、堿脅迫12 d后,每個(gè)株系選取10株測(cè)量鹽、堿害級(jí)別,鹽、堿害級(jí)別規(guī)定為1～9級(jí)(具體分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1)。然后收獲每個(gè)株系的地上部分,105 ℃殺青,隨后在80 ℃條件下烘干至恒質(zhì)量,每個(gè)品種稱取0.5 g剪碎的烘干苗放入試管中,然后加入10 mL濃度為1 mmol/L的稀鹽酸溶液,于55 ℃振蕩培養(yǎng)箱(ZHSY-50N型,由上海知楚儀器有限公司制造)中振蕩提取3 h,將樣品稀釋后用火焰光度計(jì)(M410型,由上海儀電分析儀器有限公司制造)分別測(cè)定Na+、K+濃度并進(jìn)一步計(jì)算Na+/K+(性狀縮寫見(jiàn)表2)。

表1 水稻苗期鹽、堿害級(jí)別的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Evaluation criteria for score of salt and alkali toxicity at seedling stage of rice

表2 性狀全稱及縮寫Tab.2 Characters full name and abbreviation

1.3 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建及 QTL 分析

本研究在Xing等[16]利用兩親本衍生的F6RIL群體構(gòu)建的包含104個(gè)SSR分子標(biāo)記的遺傳圖譜基礎(chǔ)上新增38個(gè)SSR標(biāo)記。利用Mapmaker 3.0軟件構(gòu)建圖譜,使用Kosambi函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)化為遺傳距離(cM),新圖譜全長(zhǎng)1 290.25 cM,平均標(biāo)記間距為9.09 cM。采用 Mapchart 2.2 進(jìn)行遺傳連鎖圖譜的繪制,利用 IciMapping v3.3的完備區(qū)間作圖法(ICIM)進(jìn)行QTL定位[17],LOD=2.5為QTL的閾值,QTL的命名原則遵循McCouch等[18]方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻鹽、堿脅迫條件下苗期 Na+、K+濃度分析

通過(guò)對(duì)親本及重組自交系群體在鹽、堿脅迫條件下鹽、堿害級(jí)別、地上部Na+、K+濃度及 Na+/K+的統(tǒng)計(jì)分析,可得出以下結(jié)果(表3)。在鹽、堿脅迫條件下SST、SSNC、SSKC、SSNK、SAT、ASNC、ASKC、ASNK在空育131和小白粳子兩親本間均呈極顯著差異。RIL群體中SST高于SAT,表明RIL群體相對(duì)鹽脅迫更耐堿脅迫；SSNC和SSKC分別高于ASNC和ASKC,但ASNK高于SSNK；SSNC數(shù)據(jù)變異范圍最大,為7.83～35.02,其次為ASNC,變異范圍為5.87～20.01,SSNK和ASNK的變異系數(shù)最大,分別為37.65%和32.47%；除ASKC外,重組自交系的其他性狀的平均值均介于小白粳子和空育131之間且存在明顯的超親分離現(xiàn)象。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布的適合性檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)基本都符合正態(tài)分布,表現(xiàn)出了典型的數(shù)量性狀遺傳特征,符合QTL定位的要求(圖1)。

表3 鹽、堿脅迫條件下水稻親本及重組自交系群體的表型性狀Tab.3 Phenotypic characters of rice parents and recombinant inbred populations under salt and alkaline stress

注:不同大寫字母表示在0.01水平上差異極顯著。

Note:Different capital letter indicate extremely significant difference at the level of 0.01.

圖1 鹽、堿脅迫下鹽堿害級(jí)別、地上部Na+濃度、K+濃度、Na+/K+的分布Fig.1 The distribution of score of salt toxicity and alkali toxicity,the shoot Na+ concentrations, K+ concentrations,Na+/K+under salt stress and alkaline stress

2.2 水稻鹽、堿脅迫條件下 Na+、K+相關(guān)表型性狀的相關(guān)性分析

對(duì)鹽、堿脅迫條件下SST、SSNC、SSKC、SSNK、SAT、ASNC、ASKC、ASNK等8個(gè)性狀進(jìn)行相關(guān)分析(表4)。鹽脅迫下,SSNK與SSNC呈極顯著正相關(guān),而SSNK與SSKC呈極顯著負(fù)相關(guān),SST與SSNC、SSNK呈顯著正相關(guān),說(shuō)明地上部Na+濃度越高,鹽害級(jí)別越大；堿脅迫下,ASNC與ASNK呈極顯著正相關(guān),與SAT呈顯著正相關(guān),ASKC與ASNC呈顯著正相關(guān),ASKC與ASNK呈顯著負(fù)相關(guān)。SSNC與SSNK、ASNC與ASNK的相關(guān)系數(shù)較大,分別為0.821和0.629；SSNK與ASKC呈極顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.429。

表4 各性狀間的相關(guān)系數(shù)Tab.4 Correlation coefficients of each trait

注:*.在0.05水平上顯著相關(guān)；**.在0.01水平上極顯著相關(guān)。

Note:*.Significant correlation at the level of 0.05;**.Extremely significant correlation at the level of 0.01.

2.3 水稻耐鹽、堿相關(guān)性狀的QTL分析

在鹽、堿脅迫條件下,對(duì)SST、SSNC、SSKC、SSNK、SAT、ASNC、ASKC、ASNK等8個(gè)性狀進(jìn)行QTL分析(表5),2種條件下共檢測(cè)到15個(gè)QTL,分布在第2,3,5,7,8,9,11,12染色體上(圖2),發(fā)現(xiàn)有13個(gè)QTL為已知QTL，LOD值2.52～6.59,表型貢獻(xiàn)率為6.10%～28.00%。

在鹽脅迫條件下共檢測(cè)到7個(gè)QTL。檢測(cè)到3個(gè)與SST相關(guān)的QTL,分布在第3,5,11染色體上,其中qSST11的貢獻(xiàn)率最大,為9.12%,增效等位基因來(lái)自于空育131；在第3和第9染色體上檢測(cè)到2個(gè)與SSNC相關(guān)的QTL,其中qSSNC9的貢獻(xiàn)率較大,為28.00%,增效等位基因來(lái)自于空育131；在第11染色體上檢測(cè)到1個(gè)與SSKC相關(guān)的QTL即qSSKC11,它的增效等位基因來(lái)自于空育131；在第2染色體上檢測(cè)到1個(gè)與SSNK相關(guān)的QTL即qSSNK2,它的增效等位基因來(lái)自于空育131。

在堿脅迫條件下共檢測(cè)到8個(gè)QTL。在第3,

表5 水稻苗期各性狀的QTL及遺傳效應(yīng)Tab.5 QTLs and genetic effects of rice traits at seedling stage

注:QTL命名中的第一個(gè)大寫字母S和A分別代表鹽脅迫和堿脅迫。

Note:The first capital letter S and A represent salt stress and alkaline stress.

.分別代表鹽脅迫下的SST、SSNC、SSKC、SSNK的QTL；.分別代表堿脅迫下的SAT、ASNC、ASKC、ASNK的QTL。 .QTL for SST，SSNC，SSKC，SSNK under salt stress;.QTL for SAT，ASNC，ASKC，ASNK under alkaline stress.

7,8染色體上檢測(cè)到3個(gè)與SAT有關(guān)的QTL即qSAT3、qSAT7、qSAT8,其中qSAT3的貢獻(xiàn)率最大,為10.13%,它的增效等位基因來(lái)自于空育131；在第8,12染色體上檢測(cè)到2個(gè)有關(guān)ASNC的QTL,其中qASNC8的貢獻(xiàn)率較大,為14.99%,增效等位基因來(lái)自于空育131；在第2和第8染色體上檢測(cè)到2個(gè)與ASKC相關(guān)的QTL,其中qASKC8的貢獻(xiàn)率最大,為14.53%,增效等位基因來(lái)自于空育131；在第3染色體上檢測(cè)到1個(gè)與ASNK相關(guān)的QTL即qASNK3,它的增效等位基因來(lái)自于小白粳子。

3 討論與結(jié)論

3.1 水稻苗期耐鹽、堿性及Na+、K+的關(guān)系

水稻的耐鹽、堿性是極其復(fù)雜的遺傳性狀,涉及水稻生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中不同階段的一系列生理生化過(guò)程。水稻發(fā)育過(guò)程中種子萌芽期和分蘗拔節(jié)期的耐鹽、堿性要強(qiáng)于幼苗期[26],同時(shí)水稻苗期是其受鹽、堿脅迫較敏感的時(shí)期,所以在苗期對(duì)水稻進(jìn)行相關(guān)性狀的耐鹽、堿性的檢測(cè),結(jié)果會(huì)較為準(zhǔn)確。鄭少玲等[27]認(rèn)為耐鹽的水稻品種自身會(huì)對(duì)Na+有積累作用,水稻地下部的Na+會(huì)抑制其向地上部運(yùn)輸,所以地上部的Na+較少,致使品種本身的耐鹽性提高。Sharma[28]對(duì)耐堿品種和敏堿品種做了比較分析,研究發(fā)現(xiàn)耐堿品種體內(nèi)積累了較低的Na+和較高的K+,而敏堿品種恰恰相反,說(shuō)明耐堿品種體內(nèi)存在一種生理機(jī)制,可以在吸收的K+同時(shí)控制Na+的進(jìn)入,進(jìn)而具有較高的K+/Na+。本研究中發(fā)現(xiàn),鹽、堿脅迫條件下水稻的SST與SAT定位在不同區(qū)間,說(shuō)明水稻耐鹽性和耐堿性之間可能存在不同的遺傳機(jī)制,而鹽脅迫下與Na+濃度相關(guān)的qSSNC3和堿脅迫下與Na+/K+相關(guān)的qASNK3定位在了相鄰區(qū)間,鹽脅迫下與Na+/K+相關(guān)的qSSNK2和堿脅迫下與K+濃度相關(guān)的qASKC2定位在了相同區(qū)間,說(shuō)明鹽、堿脅迫條件下的地上部Na+、K+濃度具有一定的遺傳重疊。

3.2 鹽、堿脅迫下Na+、K+的相關(guān)性與QTL分析

影響相關(guān)性狀的QTL常常被定位在相同或相鄰的染色體區(qū)域內(nèi)[29-31]。鹽脅迫下,鄭洪亮等[32]的研究發(fā)現(xiàn),影響水稻幼苗前期相對(duì)苗高的RSH與影響相對(duì)根數(shù)的RRN呈極顯著正相關(guān),qRSH3與qRRN3定位在了第3染色體的相同區(qū)間RM1324～RM517；堿脅迫下,鄒德堂等[33]的研究表明,影響水稻抽穗期葉長(zhǎng)的Ll與影響葉面積的LAR呈極顯著正相關(guān),qALl8與qALAR8定位在了第8染色體的相同區(qū)間RM22475～I(xiàn)ndel66。本研究中,SSNC與ASNK 呈顯著正相關(guān),SSNK與ASKC呈極顯著正相關(guān),ASKC與ASNC呈顯著正相關(guān),SAT與ASNC呈顯著正相關(guān)。同時(shí)通過(guò)QTL定位發(fā)現(xiàn),qSSNC3和qASNK3定位在了相鄰區(qū)間RM13893～RM1350和RM1350～RM504；qSSNK2和qASKC2定位在了相同區(qū)間RM341～RM1358；qASKC8與qASNC8定位在了相鄰區(qū)間RM1235～RM547和RM547～RM22750；qSAT8和qASNC8定位在了相同區(qū)間RM547～RM22750,表明這些QTL可能有部分重疊區(qū)域或存在緊密連鎖,或者為一因多效。

3.3 與前人研究結(jié)果的比較分析

到目前為止,前人已對(duì)水稻耐鹽、堿性QTL定位進(jìn)行了大量研究[34-36]。通過(guò)相同的SSR標(biāo)記和比較圖譜[37-39],將本研究定位到的苗期耐鹽、耐堿QTL與前人耐鹽、耐堿QTL結(jié)果進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)本研究檢測(cè)到的15個(gè)QTL中有13個(gè)與前人定位在相鄰或相同區(qū)間。本研究中影響苗期地上部鹽害級(jí)別的qSST3與程立銳[19]在鹽脅迫下檢測(cè)到的影響根部Na+濃度的qSRNC3-1定位在了相鄰區(qū)間；qSST5與柴路[20]在鹽脅迫下檢測(cè)到的影響單株產(chǎn)量的QTgw5定位在了相鄰區(qū)間；qSST11與在鹽脅迫下檢測(cè)到的影響千粒質(zhì)量的QGyp11定位在了相鄰區(qū)間[20]；qSSNC9、qSSNC3、qSSKC11、qSSNK2分別與在鹽脅迫下檢測(cè)到的影響單株產(chǎn)量的QTgw9[20]、影響發(fā)芽率的相對(duì)鹽害率qSRGP3-2[21]、影響單株產(chǎn)量的GYP[20]、影響Na+濃度的QSnc2[19]定位在了相鄰區(qū)間。影響苗期地上部K+濃度的qASKC8與在堿脅迫下檢測(cè)到的影響千粒質(zhì)量的GW定位在了相鄰區(qū)間[19]；qASNK3與曲英萍[21]在堿脅迫下檢測(cè)到的影響死葉率的qADLR3-2定位在了相鄰區(qū)間；qASKC2、qASNC12、qSAT3、qSAT7分別與在堿脅迫下檢測(cè)到的影響幼苗前期堿害率的ADS[25]、影響根數(shù)的qN-ARN3[24]、影響地上部Na+/K+濃度的qSNK3[22]、影響發(fā)芽率相對(duì)鹽害率的qAGRA7-2定位在了相鄰區(qū)間[23]。這些QTL能在不同遺傳背景下被檢測(cè)到,表明它們是穩(wěn)定的QTL。另外,本研究定位在相同區(qū)間RM547～RM22750的qSAT8和qASNC8,在前人研究中未見(jiàn)報(bào)道,可能是新的QTL位點(diǎn),有待進(jìn)一步研究。

3.4 結(jié)論

本研究在鹽、堿2種脅迫條件下共定位到了15個(gè)QTL,其中鹽、堿脅迫條件下分別檢測(cè)到7,8個(gè)QTL,分布在第2,3,5,7,8,9,11和12染色體上,表型貢獻(xiàn)率在6.10%～28.00%,其中13個(gè)QTL與前人定位在相鄰或相同區(qū)間,而位于RM547～RM22750之間的qSAT8和qASNC8為新的QTL位點(diǎn)。

水稻苗期耐鹽性和耐堿性之間可能存在不同的遺傳機(jī)制,而鹽、堿脅迫條件下地上部Na+、K+濃度具有一定的遺傳重疊。