王 俊，董海冉，常 宏，王 偉，包冬芳，趙孝岳，趙 雪，韓英鵬

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150030)

大豆是我國重要的糧食作物和油料作物，也是我國人民植食性蛋白的主要來源[1]。異黃酮是一種黃酮類化合物，又稱植物雌激素[2]，包括游離型的大豆黃素、染料木素和黃豆黃素3種[3]，主要存在于大豆、菜豆、苜蓿等豆科植物中，其中以大豆的含量最高[4]。大豆異黃酮是大豆重要的次生代謝產(chǎn)物之一。它不僅參與調(diào)節(jié)植物的生長活動(dòng)，還對(duì)人體健康具有重要作用。為了滿足市場(chǎng)對(duì)大豆異黃酮的需求，高異黃酮含量的大豆品種選育成為育種人員的重要目標(biāo)之一。

異黃酮主要通過苯丙氨酸代謝途徑進(jìn)行生物合成，這一途徑是從莽草酸途徑衍生的植物特有的次生代謝途徑，也是植物三大次生代謝途徑之一[5]。在自然狀態(tài)中，異黃酮以3種母核的形式存在，它們通過β-糖苷鍵和葡萄糖結(jié)合，形成異黃酮葡萄糖苷，在大豆中存在[6]。黃酮類色素等次生代謝產(chǎn)物的糖苷主要經(jīng)過糖基化修飾，存在于植物天然次生代謝產(chǎn)物合成的最后一步[7]。UGT是存在于自然界中的一種重要修飾分子，UDP(尿嘧啶二磷酸腺苷)所活化的糖分子也能被UGT轉(zhuǎn)移到生物大分子上。UGT可修飾大豆中的黃酮類化合物，形成異黃酮糖苷，也是異黃酮的合成過程中的一類重要次生代謝產(chǎn)物[8]。目前，UGT基因已在多種植物(如水稻[9]、玉米[10]、蕎麥[11]、三花龍膽[12])中被研究，付曉雯[8]從葛根中成功克隆出具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性的GT4基因，并驗(yàn)證該基因可以影響大豆苷元、染料木素、黃豆黃素等物質(zhì)的合成。李紅艷等[13]在丹參中成功克隆糖基轉(zhuǎn)移酶基因SmUF3GT，發(fā)現(xiàn)其可以將不穩(wěn)定的類黃酮色素轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定類黃酮苷元。尤章[14]發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿中MsUGT73B2基因影響黃酮物質(zhì)的合成。Achnine等[15]發(fā)現(xiàn)蒺藜苜蓿GT99D基因參與合成黃酮類物質(zhì)。而大豆糖基轉(zhuǎn)移酶基因功能尚鮮見報(bào)道。

本研究以高異黃酮品種中豆27為試驗(yàn)材料，克隆GmUGT73全長序列并構(gòu)建植物表達(dá)載體pCambia3300-GmUGT73，利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆快速轉(zhuǎn)化技術(shù)來驗(yàn)證GmUGT73基因與異黃酮含量的關(guān)系，進(jìn)而為分子標(biāo)記輔助育種提供基因資源。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

大豆品種：中豆27由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所培育；東農(nóng)50由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所提供。

菌種和載體：K599發(fā)根農(nóng)桿菌、pCambia3300載體、大腸桿菌DH5α感受態(tài)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大豆總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 將大豆材料中豆27的種子種在12 cm×12 cm的小方缽中，缽中裝滅菌蛭石。將材料放置于16 h光和8 h暗，溫度(23±2)℃，濕度60%的光照培養(yǎng)箱內(nèi)。待大豆幼苗第一輪三出復(fù)葉完全展開時(shí)，取葉片組織15～30 mg，置于液氮中，依照TRIzol的方法提取高異黃酮品種中豆27葉片的總RNA。采用東洋坊反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2GmUGT73的生物信息學(xué)分析 通過測(cè)序獲得了DNA序列，并且利用DNAMAN軟件將其翻譯氨基酸序列。利用ProtParam、ProtCcale、TMpred和MEMSAT-SVM在線軟件，可以對(duì)氨基酸的理化性質(zhì)、親水性、疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)等指標(biāo)進(jìn)行初步分析，進(jìn)而初步預(yù)測(cè)基因的功能。

1.2.3 RT-PCR法克隆GmUGT73全長基因 在Phytozomev 11.0數(shù)據(jù)庫查找GmUGT73基因的全長序列，GmUGT73CDS區(qū)域全長1 395 bp，根據(jù)GmUGT73基因的CDS序列設(shè)計(jì)引物(表1)，將cDNA作為模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序根據(jù)高保真DNA聚合酶(Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase)說明書進(jìn)行操作。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的方法對(duì)目的基因片段進(jìn)行電泳檢測(cè)。

表1 PCR引物Tab.1 Primers for PCR

1.2.4 目的片段回收 獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈照射下，用解剖刀迅速切下含目的片段的瓊脂糖凝膠(質(zhì)量一般小于0.3 g)，放入干凈的1.5 mL離心管中，利用膠回收試劑盒將目的片段進(jìn)行回收，放入-20 ℃冰箱中保存。

1.2.5 表達(dá)載體構(gòu)建與目的基因片段連接 在pCambia3300表達(dá)載體上找到單酶切位點(diǎn)，采用XbaⅠ酶，在37 ℃水浴鍋中5 h將其載體線性化，采用電泳的方法檢驗(yàn)酶切結(jié)果。采用電擊法將目的片段與植物表達(dá)載體相連接，采用的大腸桿菌感受態(tài)DH5α是博邁德生物技術(shù)公司生產(chǎn)的。

1.2.6 菌液驗(yàn)證及測(cè)序 利用PCR鑒定陽性克隆的方法，對(duì)菌液進(jìn)行PCR檢測(cè)(Easy-Taq為PCR擴(kuò)增酶)。將鑒定為陽性克隆的菌液送到測(cè)序公司測(cè)序。利用OMEGA公司生產(chǎn)的提質(zhì)粒盒子(Plasmid Mini Kit(D6942-02*))對(duì)測(cè)序合格的樣品提取質(zhì)粒。

1.2.7 大豆根部轉(zhuǎn)化與異黃酮含量測(cè)定 根據(jù)陳安樂[16]大豆發(fā)根轉(zhuǎn)化方法對(duì)GmUGT73基因以東農(nóng)50為材料進(jìn)行K599發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化與侵染，對(duì)根部進(jìn)行DNA提取，采用PCR鑒定的方法，并根據(jù)朱瑩等[17]液相色譜法(HPLC)測(cè)定異黃酮含量的方法，對(duì)大豆根部異黃酮進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmUGT73基因的克隆與轉(zhuǎn)化

選取中豆27的第一輪完全展開的三出復(fù)葉提取總RNA，通過瓊脂糖電泳檢測(cè)，其中18S和28S條帶清晰可見(圖1)。通過Nanovue儀器對(duì)提取的總RNA進(jìn)行濃度檢測(cè)，結(jié)果表明，RNA純度較高，完整性好，適合反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行基因克隆。

圖1 RNA電泳圖Fig.1 Agarosegel electrophoriesis of RNA

將中豆27的第一輪三出復(fù)葉總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以其為模板、GmUGT73-R和GmUGT73-F為引物，經(jīng)PCR反應(yīng)后獲得目的片段，其長度為1 000～2 000 bp，與目的基因片段長度一致(圖2)，然后通過In-Fusion連接的方法將目的基因連接到植物過表達(dá)載體上。

對(duì)轉(zhuǎn)化大腸桿菌的菌液進(jìn)行PCR陽性檢測(cè)(圖2)，將陽性克隆的菌液送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，下載全基因組基因序列與測(cè)序結(jié)果比對(duì)，將完全匹配的序列作為最終序列。

圖2 目的基因電泳圖Fig.2 Electrophoresis result of gene amplification

2.2 生物信息學(xué)分析

利用在線軟件對(duì)GmUGT73蛋白序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，GmUGT73基因的編碼區(qū)編碼464個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為51.186 5 ku，理論等電點(diǎn)(pI)為6.27，其原子總數(shù)為7 176，其分子式是C2281H3580N608O685S22。在GmUGT73蛋白的氨基酸序列中，含量最多的是Leu，占總數(shù)的11.6%；不存在Pyl和Sec 2種氨基酸。GmUGT73蛋白質(zhì)總正電和負(fù)電殘基數(shù)分別為37和41，蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為36.93，表明該蛋白相對(duì)比較穩(wěn)定。GmUGT73蛋白GRAVY值為-0.111，脂溶指數(shù)為86.19，屬于親水性蛋白。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)得到GmUGT73蛋白質(zhì)中含有33.19% α-螺旋、41.59%片層結(jié)構(gòu)、4.74% β-轉(zhuǎn)角、20.47%無規(guī)則卷曲。用在線軟件SWISS-MODEL預(yù)測(cè)中豆27中GmUGT73蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖3)。

圖3 GmUGT73蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)Fig.3 Predict of 3-D structure of GmUGT73 protein

2.3 PCR鑒定發(fā)根農(nóng)桿菌陽性克隆

用基因克隆引物對(duì)含有目的基因的發(fā)根農(nóng)桿菌采取PCR陽性鑒定，結(jié)果顯示，菌液均為陽性克隆，代表目標(biāo)轉(zhuǎn)化成功(圖4)。

2.4 轉(zhuǎn)基因陽性根鑒定

對(duì)接種20 d后的發(fā)根植株，隨機(jī)選取10株，提取根部中的DNA，采用PCR檢測(cè)的方法對(duì)其進(jìn)行陽性鑒定，結(jié)果顯示其中9株為陽性(圖5)。

1.DL2000 Marker；2-6.5個(gè)不同單克隆菌液；7.水陰性對(duì)照； 8.大腸重組質(zhì)粒pCambia3300-GmUGT73陽性對(duì)照。 1.DL2000 Marker；2-6.Five different monoclonal solutions； 7.Water negative control；8.E.coli plasmids pCambia3300-GmUGT73.

1-10.選取的10株發(fā)根植株；水.陰性對(duì)照；M.DL2000 Marker。 1-10.Chosen ten root plants；Water.Negative control；M.DL2000 Marker.

2.5 轉(zhuǎn)基因陽性根異黃酮含量測(cè)定

隨機(jī)選取5株轉(zhuǎn)基因陽性根，并將其與對(duì)照處理同等條件下采用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行異黃酮相關(guān)含量的測(cè)量，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因陽性根中大豆苷元和大豆苷含量極顯著高于對(duì)照材料，其他組分無顯著變化，對(duì)2組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析，差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)，所以初步認(rèn)定GmUGT73基因具有促進(jìn)異黃酮合成的作用(圖6)。

1.對(duì)照大豆根系；2-6.轉(zhuǎn)基因陽性發(fā)根根系。不同大寫字母代表對(duì)照與轉(zhuǎn)基因根系之間異黃酮含量的差異極顯著(P<0.01)。 1.Control roots；2-6. Transgenic positive roots.Different capital letters represent extremely significant differences in isoflavone content between control and transgenic roots(P<0.01).

3 討論與結(jié)論

轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因編輯技術(shù)不斷提高，伴隨產(chǎn)生了更多的遺傳轉(zhuǎn)化方法和技術(shù)，給分子育種和定向改良作物性狀提供新思路。至今在植物中使用較多的方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、花粉管通道法等，其中科研人員最為熱衷的是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，主要是其價(jià)格成本低、耗時(shí)短[18]。采取發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法，可以影響次生代謝產(chǎn)物的合成[19]。證明發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化在篩選異黃酮合成基因方面具有可行性。付曉雯[8]研究發(fā)現(xiàn)，葛根中異黃酮含量受到糖基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因的影響。Baek等[20]研究發(fā)現(xiàn)，朝鮮黑莓中糖基轉(zhuǎn)移酶基因在類黃酮合成過程中發(fā)揮重要作用。本研究通過發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將GmUGT73基因轉(zhuǎn)入東農(nóng)50品種中，獲得15個(gè)轉(zhuǎn)基因陽性根，用高效液相色譜法測(cè)定轉(zhuǎn)基因陽性根組織的異黃酮含量，驗(yàn)證GmUGT73基因是否參與大豆異黃酮的合成過程。結(jié)果證明GmUGT73基因可能參與大豆異黃酮的積累過程。

大豆異黃酮多以苷元形式發(fā)揮生物功能，糖基化后其生理作用發(fā)生改變[21-23]。因此，糖基化對(duì)異黃酮組分的生物功能具有重要的作用。最早發(fā)現(xiàn)的大豆異黃酮特異UGT基因是GmIF7GT，它是在大豆幼苗中提取出來的[24]，它對(duì)異黃酮合成具有促進(jìn)作用。后來Dhaubhadel等[25]發(fā)現(xiàn)UGT73F2糖基轉(zhuǎn)移酶基因可以促進(jìn)染料木素和黃酮黃豆黃素合成，從而使黃豆黃苷和染料木苷的含量增多。本研究以中豆27為試驗(yàn)材料，克隆出糖基轉(zhuǎn)移酶基因GmUGT73，連接pCambia3300過表達(dá)載體，通過K599轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌，結(jié)果表明，發(fā)根中的大豆苷元(Daidzein)和大豆苷(Daidzin)含量增加，異黃酮含量顯著提高，這表明GmUGT73參與大豆異黃酮代謝過程。

通過RT-PCR方法從大豆中豆27中克隆獲得GmUGT73基因的CDS全長序列；GmUGT73基因編碼區(qū)編碼464個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為51.186 5 ku，該基因編碼的蛋白比較穩(wěn)定，親水性較強(qiáng)；成功構(gòu)建pCambia3300-GmUGT73植物表達(dá)載體，發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化大豆東農(nóng)50，獲得的轉(zhuǎn)基因陽性根中異黃酮含量和對(duì)照處理相比極顯著提高(P<0.01)，說明該基因可能具有合成大豆異黃酮的功能。