劉 丹,趙子龍,梁 丹,曹婷婷,李素敏,王從磊, 時(shí)曉偉,楊曉然,張 明,朱 銘,王建賀,馮 剛,李素英

(1.天津市農(nóng)作物研究所,天津市農(nóng)作物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300384；2.唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系,河北 唐山 063000)

谷子起源于我國(guó),已有8 700年的栽培歷史,營(yíng)養(yǎng)均衡,歷史上曾是養(yǎng)育中華民族的主糧。目前,谷子主要分布于中國(guó)、印度等發(fā)展中國(guó)家,中國(guó)谷子種植面積占全球的80%左右。小麥起源于亞洲西部,公元前2 000年左右,我國(guó)開(kāi)始種植小麥[1]。由于小麥適口性突出,逐步發(fā)展為全球性主糧,在我國(guó)也逐步取代谷子的主糧地位；而谷子雖然具有營(yíng)養(yǎng)全面、均衡,但由于適口性較差,逐步退出主糧地位、成為雜糧,也成為制約其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要限制因素。

蛋白質(zhì)、淀粉是作物籽粒的主要營(yíng)養(yǎng)成分,二者共同決定了作物的品質(zhì)及產(chǎn)量,對(duì)作物具有重要意義[2-3]。小麥中的蛋白可形成面筋,用于制作面包、面條、饅頭等食物[4],而谷子、水稻、玉米中籽粒的成分基本不能形成面筋,難以單獨(dú)制作面包、面條、饅頭等食物。淀粉為多聚葡萄糖,占籽粒成分的80%左右,依據(jù)糖苷鍵的不同分為直鏈淀粉和支鏈淀粉兩類[5],兩類淀粉均以顆粒狀形態(tài)積累在胚乳中,體積大的淀粉顆粒為A型淀粉粒,體積小的淀粉顆粒為B型淀粉粒,體積最小的淀粉顆粒為C型[6-8]。在掃描電鏡下,淀粉粒呈現(xiàn)圓球形、橢球形、多面形,且不同作物A型、B型、C型淀粉顆粒含量明顯不同。作物籽粒中的蛋白質(zhì)占籽粒成分的10%～15%,依據(jù)溶解性的不同,分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白,其中清蛋白為水溶性蛋白,球蛋白為鹽溶性蛋白,醇溶蛋白主要溶解于醇類物質(zhì),而谷蛋白主要溶解于酸或堿[9-10]。不同作物間蛋白種類及其構(gòu)成比例和構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸種類和含量存在較大差異[11-13]。因此,如何通過(guò)研究籽粒蛋白、淀粉構(gòu)成及結(jié)構(gòu),改良谷子品質(zhì),成為擺在廣大農(nóng)業(yè)科研工作者面前的一個(gè)重要課題,也是解決制約谷子產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸難題的關(guān)鍵所在。

關(guān)于小麥蛋白成分及其構(gòu)成比例已有一些報(bào)道。Henkrar等[14]研究表明,小麥籽粒中,麥谷蛋白和醇溶蛋白均占蛋白總量的40%左右,二者通過(guò)蛋白質(zhì)之間的相互作用形成面筋。谷蛋白決定了面團(tuán)的彈性,彈性好的小麥粉,即強(qiáng)筋小麥粉適合制作面包,而彈性小,延展性好的面粉,即弱筋小麥粉,適合制作餅干[15-18]。因此,谷蛋白與小麥的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)及加工品質(zhì)密切相關(guān)；麥谷蛋白為復(fù)合體蛋白,各個(gè)亞基之間通過(guò)分子內(nèi)及分子間二硫鍵、氫鍵連接聚合,通過(guò)巰基乙醇及二硫蘇糖醇等還原劑可形成單體蛋白,這些單體蛋白按照其在SDS-PAGE電泳中的遷移速率可分為高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亞基(LMW-GS)[19-21]。醇溶蛋白(Gliadin)作為面筋的主要成分之一,決定了面筋的黏性和延展性[22],不同于麥谷蛋白,Gliadin為單體蛋白,分子量介于20～100 ku,分子間沒(méi)有二硫鍵,依托分子內(nèi)二硫鍵、氫鍵及疏水作用力形成球狀結(jié)構(gòu)[22]。根據(jù)醇溶蛋白在A-PAGE電泳圖譜上的相對(duì)遷移速率可以將醇溶蛋白分為α、β、γ、ω4類,其中α型醇溶蛋白占Gliadin總量的25%,β型醇溶蛋白占Gliadin總量的30%,γ型醇溶蛋白占Gliadin總量的30%,ω型醇溶蛋白占Gliadin總量的15%[23-25]。然而,目前,對(duì)于谷子籽粒蛋白的研究相對(duì)較少,也缺乏研究的深度和廣度。

關(guān)于小麥淀粉成分及其構(gòu)成比例也有一些研究。小麥籽粒中80%以上為淀粉,淀粉質(zhì)體為其合成的場(chǎng)所,在高等植物中存在的原質(zhì)體、葉綠體、淀粉質(zhì)體相互轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象,同時(shí)也伴隨著淀粉的合成與降解[26]。有研究認(rèn)為,淀粉質(zhì)體是由原質(zhì)體和葉綠體發(fā)育而來(lái),原質(zhì)體和葉綠體中的淀粉積累充分后,二者便轉(zhuǎn)化為淀粉質(zhì)體；淀粉質(zhì)體合成的淀粉粒為A型淀粉粒,A型淀粉粒通過(guò)自身生長(zhǎng)的小淀粉粒發(fā)育成B型淀粉粒,對(duì)于C型淀粉粒的來(lái)源目前尚無(wú)研究證實(shí)[8, 11]。A型淀粉粒占籽粒淀粉數(shù)量的5%左右,質(zhì)量為籽?？偟矸哿康?0%,B型淀粉粒占籽粒淀粉?？偭康?5%,但是質(zhì)量?jī)H占籽粒淀粉總量的25%～30%[8, 11]。同時(shí)表達(dá)譜分析表明,A型淀粉粒出現(xiàn)在開(kāi)花后的4～14 d,B型淀粉粒則出現(xiàn)在開(kāi)花后14 d到籽粒成熟,說(shuō)明B型淀粉?？赡軄?lái)源于已經(jīng)發(fā)育成熟的A型淀粉粒。同時(shí)A型淀粉粒和B型淀粉粒對(duì)于品質(zhì)的貢獻(xiàn)也不相同,A型淀粉粒含量高的小麥制作的面包體積較大,質(zhì)量較好。然而,目前,對(duì)于谷子籽粒淀粉的研究相對(duì)較少,對(duì)于品質(zhì)貢獻(xiàn)方面的研究也鮮有報(bào)道。

谷子和小麥的淀粉、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、形狀以及成分均存在較大差別,這也是造成它們營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、加工品質(zhì)以及適口性等差別的主要原因,也是造成谷子逐步退出主糧地位以及制約其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵所在。本研究利用掃描電鏡對(duì)小麥、谷子籽粒結(jié)構(gòu)的進(jìn)行觀察,探明小麥和谷子中淀粉、蛋白質(zhì)的形態(tài)差異及排布特征,并通過(guò)對(duì)谷蛋白和醇溶蛋白的提取,研究谷蛋白和醇溶蛋白在分子量及組成上的差異,為探明谷子和小麥品質(zhì)間差異形成的原因提供理論依據(jù),為進(jìn)一步通過(guò)分子手段改良小米品質(zhì)提供技術(shù)支撐,為拓寬谷子品質(zhì)改良的途徑提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試谷子材料由唐山師范學(xué)院生命科學(xué)系提供,供試小麥材料由天津市農(nóng)作物研究所小麥中心提供(表1)。

表1 材料Tab.1 Materials

1.2 谷蛋白提取

試驗(yàn)在唐山師范學(xué)院進(jìn)行,采用同時(shí)提取高分子量谷蛋白和低分子量谷蛋白的方法對(duì)小麥的谷蛋白進(jìn)行提取,取1粒小麥種子磨碎,將粉末置于2.0 mL離心管中,加入800 μL Buffer A (7.5%異丙醇； 0.3 mol/L NaI),于65 ℃提取1 h,其間10 min用振蕩儀振蕩1次后10 000 r/min,離心3 min,棄上清,并重復(fù)1次；在沉淀中加入200 μL Buffer B(25% 異丙醇,0.04 mol/L Tris-HCl(pH=8.0),10%SDS,2%DTT),渦旋充分后,于65 ℃提取1 h,其間不斷搖動(dòng)(10 min渦旋1次)；再加入200 μL Buffer C (25%異丙醇,0.04 mol/L Tris-HCl(pH=8.0),10%SDS,1.4%乙烯基吡啶),渦旋混勻,于65 ℃提取30 min,10 000 r/min,離心5 min；將上述400 μL的上清吸取出來(lái),轉(zhuǎn)移到另一干凈離心管中,加入200 μL Buffer D(0.625 mol/L Tris-HCl(pH=6.8),5%硫基乙醇,20%甘油,2%SDS,0.2%溴酚藍(lán)),渦旋混勻,靜置30 min后,放入沸水中100 ℃,變性5 min,自然冷卻,該溶液即為含有HMW-GS和LMW-GS的提取液,可做電泳分析用。通過(guò)SDS-PAGE,濃縮膠濃度為10%,分離膠濃度為5%,穩(wěn)流15 mA/板,電泳16 h,對(duì)小麥谷蛋白進(jìn)行鑒定。

通過(guò)植物總提蛋白方法,對(duì)谷子冀谷32進(jìn)行籽粒蛋白總提(提取Buffer:0.625 mol/L Tris-HCl,5%硫基乙醇，20%甘油，2% SDS，0.2%溴酚藍(lán)；渦旋混勻，靜置30 min),通過(guò)60%異丙醇去除醇溶蛋白的方法對(duì)谷蛋白進(jìn)行提取,并通過(guò)SDS-PAGE對(duì)谷子總蛋白、谷蛋白進(jìn)行鑒定。

1.3 醇溶蛋白提取

采用70%乙醇對(duì)春小麥、冬小麥醇溶蛋白進(jìn)行提取,采用ISTA 1986年頒布的A-PAGE電泳流程對(duì)小麥醇溶蛋白進(jìn)行鑒定[27]；采用65%異丙醇對(duì)谷子籽粒進(jìn)行醇溶蛋白提取,并通過(guò)A-PAGE對(duì)谷子醇溶蛋白進(jìn)行鑒定。

1.4 籽粒電鏡觀察

選擇外形完整、顆粒飽滿的谷子、小麥籽粒,各種籽粒隨機(jī)選取3粒。將干燥好的籽粒,用徒手切片法切下斷裂面,厚度約為1～2 mm,即為樣品。將樣品自然斷裂面朝上,切割面朝下,用導(dǎo)電膠粘著于樣品臺(tái)上,然后將樣品臺(tái)置于樣品室放在場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(ZEISS Sigma 300)下,依次觀察各個(gè)籽粒蛋白斷裂面的腹部、中部、背部,并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子與小麥谷蛋白的對(duì)比分析

2.1.1 小麥谷蛋白SDS-PAGE分析 SDS-PAGE電泳分析結(jié)果表明：小麥品種中國(guó)春、津強(qiáng)8號(hào)、津強(qiáng)9號(hào)、津強(qiáng)11號(hào)、津強(qiáng)12號(hào)、106、CB037、輪選987、津硬8號(hào)中均存在高分子量谷蛋白亞基和低分子量谷蛋白亞基,但高分子量谷蛋白亞基條帶較少,一般表達(dá)4～5種高分子量谷蛋白亞基,而低分子量谷蛋白亞基組成較為復(fù)雜,品種間變異較為豐富(圖1)。前人研究表明,中國(guó)春的高分子量組蛋白為Dx2+Dy12和Bx7+By8,A基因組上的高分子量谷蛋白呈沉默狀態(tài),不表達(dá)[28]。津強(qiáng)8號(hào)高分子量谷蛋白表達(dá)模式與中國(guó)春類似,僅4種高分子量谷蛋白表達(dá),而津強(qiáng)9號(hào)、津強(qiáng)11號(hào)、津強(qiáng)12號(hào)、106與中國(guó)春相比,除了B基因組和D基因組的高分子量谷蛋白表達(dá),A基因組上也有一個(gè)位點(diǎn)表達(dá)產(chǎn)生了高分子量谷蛋白,因此這些品種具有5條高分子量谷蛋白條帶(圖1)。CB037和輪選987B組染色體上谷蛋白與中國(guó)春存在明顯差異,Bx和By的分子量接近。津硬8號(hào)為四倍體小麥,僅含有A基因組和B基因組,但其高分子量谷蛋白也有4個(gè)位點(diǎn)表達(dá)(圖1),說(shuō)明在進(jìn)化過(guò)程中,四倍體小麥的A基因組上的高分子量谷蛋白編碼基因并未沉默。低分子量谷蛋白編碼位點(diǎn)較多,且表達(dá)具有品種間特異性,但目前對(duì)于低分子量谷蛋白分布及功能的研究較少。

圖1 小麥谷蛋白亞基Fig.1 Wheat gluten subunit

2.1.2 谷子谷蛋白SDS-PAGE分析 對(duì)谷子總蛋白和谷蛋白的分析結(jié)果(圖2)表明：谷子新品種—冀谷320.12,0.15,0.18,0.21,0.24 g籽粒提取的蛋白濃度逐漸上升,0.12 g谷子籽粒所提取的蛋白與0.015 g小麥籽粒提取的總蛋白亮度接近,說(shuō)明谷子籽粒蛋白質(zhì)含量不如小麥含量豐富,同時(shí)對(duì)谷子谷蛋白提取發(fā)現(xiàn),谷子谷蛋白含量很低,僅有1條明顯的谷蛋白條帶和2條較弱的谷蛋白條帶。

對(duì)比小麥總蛋白帶譜發(fā)現(xiàn),谷子總蛋白的遷移速率顯著低于小麥總蛋白遷移速率,說(shuō)明谷子蛋白的分子量顯著低于小麥蛋白分子量。

1.小麥(中國(guó)春),0.015 g籽粒總蛋白；2-6. 0.12,0.15,0.18,0.21,0.24 g谷子籽?？偟鞍祝?-11. 0.12,0.15,0.18,0.21,0.24 g谷子籽粒谷蛋白。

1.Wheat(Chinese spring), 0.015 g grain for total protein extraction; 2-6. 0.12, 0.15, 0.18, 0.21, 0.24 g grain for total protein extraction of foxtail millet; 7-11. 0.12, 0.15, 0.18, 0.21, 0.24 g grain for glutenin extraction of foxtail millet.

圖2 谷子總蛋白及谷蛋白
Fig.2 Protein of foxtail millet

2.2 谷子與小麥醇溶蛋白的對(duì)比分析

2.2.1 小麥醇溶蛋白分析 通過(guò)單粒小麥種子(約0.06 g),進(jìn)行醇溶蛋白提取,并利用酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(A-PAGE)對(duì)醇溶蛋白進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在小麥的醇溶蛋白在ω、γ、β、α區(qū)均有分布,且醇溶蛋白含量豐富,組成復(fù)雜,每個(gè)品種均具有自身的條帶構(gòu)成特征,且變異豐富(圖3)。中國(guó)春與Fielder在ω區(qū)存在差異,Fielder ω區(qū)有4個(gè)位點(diǎn)表達(dá),中國(guó)春有5個(gè)位點(diǎn)表達(dá)；γ區(qū)Fielder表達(dá)的位點(diǎn)多于中國(guó)春；α/β區(qū),2個(gè)品種的表達(dá)相似。濟(jì)南17與Fielder在ω區(qū)醇溶蛋白組成相似,但是在α/β區(qū)存在顯著差異；濟(jì)南44與中國(guó)春在ω區(qū)醇溶蛋白組成相似?？傮w說(shuō)明,醇溶蛋白的組成具有品種間特異性(圖3-A)。對(duì)于天津市農(nóng)作物研究所的冬麥資源分析發(fā)現(xiàn),冬麥材料的醇溶蛋白在ω、γ、β、α區(qū)均存在明顯差異,品種特異性差異顯著(圖3-B)。說(shuō)明,小麥中醇溶蛋白具有明顯的品種間特異性。

圖3 小麥醇溶蛋白Fig.3 Gliadin of wheat varieties

2.2.2 谷子醇溶蛋白分析 通過(guò)提取谷子醇溶蛋白(約0.06 g),進(jìn)行A-PAGE電泳分析(圖4)表明,鐵谷8(V1)、興谷88(V2)、壩谷214(V3)、朝谷13(V4)、延谷12(V5)、公谷70(V6)、赤谷4(V7)、大同29(V8)、鄭9188(V9)品種中,均含一定量的醇溶蛋白,谷子醇溶蛋白約10～20條條帶,在不同品種間存在多態(tài)性,條帶種類和組成具有品種特征。V1中含有12個(gè)醇溶蛋白條帶,其中有2個(gè)條帶表達(dá)量較高,其余條帶表達(dá)較弱；V2有9條醇溶蛋白條帶,表達(dá)量較高的條帶與V1品種的條帶位置不同；V3、V4、V9的醇溶蛋白帶譜相似；V5、V7醇溶蛋白帶譜相似,醇溶蛋白條帶亮度低,說(shuō)明表達(dá)豐度較低；V8有3條高亮度條帶。說(shuō)明谷子不同品種醇溶蛋白含量可能存在一定差異,并且醇溶蛋白存在品種間特異性。

圖4 谷子醇溶蛋白Fig.4 Alcohol-soluble protein of foxtail millet

2.3 籽粒電鏡觀察

通過(guò)掃描電鏡觀察表明,谷子和小麥籽粒中均含有淀粉粒和蛋白體。在常規(guī)谷子品種冀谷32、恢復(fù)系JK4-227、不育系51A中,均含有兩類淀粉粒,一類體積較大,成多邊形,直徑5～10 μm,屬于B型淀粉粒,含量豐富；另一類體積較小,為球形,直徑約2 μm,屬于C型淀粉粒,含量少于B型淀粉粒；在淀粉粒間隙填充著較少的蛋白體。在春小麥津強(qiáng)1號(hào)、冬小麥津農(nóng)10號(hào)、輪選987中存在三類淀粉粒,大小不同,其中,一類淀粉粒體積較大,直徑10～30 μm,呈盤(pán)子狀,為A型淀粉粒,含量豐富；第二類淀粉粒體積比A型淀粉粒小,直徑5～10 μm,成球形或者多邊形,為B型淀粉粒；第三類淀粉粒體積最小,直徑小于2 μm,為C型淀粉粒,B型、C型淀粉粒顯著少于A型淀粉粒；同時(shí)淀粉粒間隙中填充著較為豐富的蛋白體,不同品種淀粉體覆蓋的蛋白含量不同,津農(nóng)10號(hào)淀粉體表面較為平滑,而津強(qiáng)1號(hào)淀粉粒表面被蛋白體緊密包裹(圖5)。

谷子冀谷32為常規(guī)品種、JK4-227為恢復(fù)系、51A為不育系；小麥津強(qiáng)1號(hào)(春小麥,強(qiáng)筋)、 津農(nóng)10號(hào)(冬小麥,中筋)、輪選987(冬小麥,中筋)。 Jigu 32 was a conventional variety of foxtail millet, JK4-227 was a restorer line, and 51A was a sterile line； Jinqiang 1 (spring wheat, strong-gluten), Jinnong 10 (winter wheat, middle-gluten), Lunxuan 987 (winter wheat, middle-gluten).

3 討論

小麥面筋含量高,因此可用于制作面包、面條、蛋糕等食品；而谷子幾乎不含有面筋,但營(yíng)養(yǎng)豐富。因此,可以以小米面主要作為配粉,按照一定比例,添加到小麥粉中,制作面包、面條、蛋糕,既可增加這些產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,又可提高小米的適口性和商業(yè)價(jià)值,從而擴(kuò)大小米的用量,解決制約谷子產(chǎn)業(yè)發(fā)展的小米用途窄的難題。

據(jù)報(bào)道,小麥籽粒蛋白含量約13%[29],而谷子的蛋白含量為10%[30]。本研究發(fā)現(xiàn),谷子不僅總蛋白含量低于小麥,在SDS-PAGE上,谷子總蛋白遷移速率顯著快于小麥蛋白遷移速度,說(shuō)明谷子籽粒蛋白的分子量顯著低于小麥總蛋白。小麥與谷子的蛋白質(zhì)含量差異不大,不同品種的小麥籽粒中均含有谷蛋白和醇溶蛋白,二者共同形成面筋。本研究也證實(shí),小麥品種都含有高分子量谷蛋白亞基和低分子量谷蛋白亞基,而谷子的籽粒中谷蛋白很少,且與小麥相比,谷蛋白的分子量很低,說(shuō)明谷子含有谷蛋白的水平很低,并且都是一些分子較小的谷蛋白,與小麥谷蛋白存在明顯差異。醇溶蛋白研究發(fā)現(xiàn),谷子的醇溶蛋白條帶較少,多態(tài)性不如小麥籽粒醇溶蛋白豐富,說(shuō)明谷子中編碼醇溶蛋白的基因少于小麥,在改良谷子品質(zhì)時(shí),可以適當(dāng)引入分子量大的谷蛋白、醇溶蛋白亞基,增加谷子蛋白的分子量。

谷子中的谷蛋白和醇溶蛋白含量與小麥存在較大差異,說(shuō)明二者蛋白質(zhì)性質(zhì)和構(gòu)成差異均較大,谷子的蛋白質(zhì)含量雖然接近小麥,但是由于其谷蛋白和醇溶蛋白含量少,且分子量與小麥存在較大差異,所以不能形成面團(tuán),制作面包等商品。

研究發(fā)現(xiàn),小麥籽粒蛋白中20%為清蛋白和球蛋白,其余80%為谷蛋白和醇溶蛋白,谷蛋白和醇溶蛋白的比例接近1∶1[10, 31]。本研究發(fā)現(xiàn),從帶譜圖上看,谷子含有一定的醇溶蛋白,也具有一定的多態(tài)性,但是谷子谷蛋白含量極低,分子量也較小,這說(shuō)明谷子醇溶蛋白的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于谷蛋白含量,與小麥谷蛋白和醇溶蛋白的比例差異較大,也暗示由于谷子谷蛋白和醇溶蛋白含量差異懸殊,因此不能形成面筋。

谷子、小麥除了蛋白質(zhì)存在差異外,在淀粉粒上也存在較大差異。小麥主要存在A、B、C三類淀粉體,其中A型淀粉粒體積較大,直徑10～30 μm,呈盤(pán)子狀；B型淀粉粒體積比A型淀粉粒小,直徑5～10 μm,呈球形或者多邊形；C型淀粉粒體積最小,直徑小于10 μm,與蛋白體鑲嵌在一起[32]。谷子的淀粉體大部分呈多邊形,直徑約10 μm,屬于B型淀粉粒；也發(fā)現(xiàn)大量C型淀粉粒,但未發(fā)現(xiàn)A型淀粉粒。說(shuō)明在淀粉體排布上,谷子與小麥也存在一定差異,這也是造成小米適口性較差的原因之一。在谷子品質(zhì)改良實(shí)踐中,可改造淀粉合成基因、調(diào)控基因,增加谷子淀粉體體積、改變不同類型淀粉體的比例從而提升谷子品質(zhì)。

目前,對(duì)于谷子品質(zhì)形成的研究進(jìn)展緩慢,而品質(zhì)的成因主要由蛋白和淀粉決定,因此通過(guò)開(kāi)展蛋白體結(jié)構(gòu)和淀粉特征等表型研究,從而為從分子水平解析谷子品質(zhì)的形成及影響因素奠定基礎(chǔ),也為從轉(zhuǎn)基因及基因組編輯等方面改良谷子品質(zhì)提供理論依據(jù)。