黃帥, 邵園, 明帥, 楊巍, 葉琴, 崔思嘉, 龔向陽

中樞神經(jīng)系統(tǒng)表面鐵質沉積癥(superficial side-rosis of the central nervous system,SS-CNS)是由軟腦(脊)膜、軟腦(脊)膜下和室管膜下含鐵血黃素沉積所導致的一組臨床綜合征。病程通常是不可逆的，典型臨床表現(xiàn)為小腦性共濟失調、神經(jīng)性耳聾和錐體束征[1]。SS-CNS在MRI上表現(xiàn)為特征性的、沿腦表面分布的低信號帶，以T2WI和磁敏感加權成像(susceptibility weighted imaging，SWI)等序列較為敏感[2-3]。解剖大體標本可在腦表面觀察到焦黃色物質沉積[4]。大量的臨床病例報告提示65%的SS-CNS患者存在引起少量、持續(xù)性蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)的基礎疾病，如中樞神經(jīng)腫瘤、頭頸部外傷、動靜脈血管畸形和動脈瘤、手術、臂叢損傷及腦淀粉樣血管病等[5-6]。

近期有文獻報道，在腦外傷伴有SAH患者、或者動脈瘤破裂引發(fā)SAH患者的MRI隨訪中，發(fā)現(xiàn)部分患者存在SS-CNS現(xiàn)象，說明單次SAH也可能引起腦表面鐵質沉積[7-8]。但是臨床上此類患者的病史較為復雜，既往可能存在腦表面微出血病史，并不能證實SS-CNS是由單次SAH所導致。本研究擬通過應用顱骨直接穿刺單次注血建立家兔SAH模型，研究單次SAH導致SS-CNS的可能性及發(fā)生率。

材料與方法

1.實驗動物

普通級新西蘭兔38只，體重2.2～3.1 kg，平均2.5 kg，雌雄不限，月齡6～9個月。由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，購買于浙江省新昌縣大市聚鎮(zhèn)欣健兔場。實驗動物在標準環(huán)境下飼養(yǎng)(室溫22℃～27℃，濕度40%～60%，12 h晝夜循環(huán)光照)。實驗過程對動物各項處置符合動物倫理學標準。

2.實驗材料

主要用藥：鹽酸賽拉嗪注射液(xylazine hydrochloride)，生產廠家為吉林省華牧動物保健品有限公司，規(guī)格為2 mL；3%戊巴比妥溶液(pentobarbital)；碘克沙醇(iodixanol)，生產廠家為江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格為100 mL；10%福爾馬林溶液(formalin)。

實驗器械：顱骨鉆孔器(生產廠家為捷力特，中國浙江)；自制骨穿針由醫(yī)用16G穿刺活檢針剪短、打磨而成，保留活檢針尾部3 cm，帶定位夾(圖1a)；咬骨鉗。

影像設備：Toshiba Aquilion ONE 640層螺旋CT掃描儀；GE Discovery MR 750 3.0T磁共振掃描儀和Magtron WK200-D 8通道相控陣兔實驗專用線圈。Nikon eclipse 80i顯微鏡。

病理染色液：普魯士藍染色試劑盒(Perls stain，伊紅法)， 生產廠家為北京市索萊寶(Solar bio)科技有限公司。

3.造模方法

實驗前準備：新西蘭兔術前禁食、禁水8 h，肌注速眠新0.15 mL/kg，經(jīng)兔耳緣靜脈注射戊巴比妥溶液(劑量為0.5 mL/kg)。待麻醉成功后，經(jīng)一側耳緣動脈取動脈血1.5～2.0 mL注入肝素化容器，并緩慢加入CT對比劑碘克沙醇(320 mg I/mL)0.5 mL備用。

CT引導下穿刺及注血：穿刺點為顱骨中線額部與枕部連線中點偏左側約1 cm位置處，穿刺目標為左側幕上大腦半球表面的蛛網(wǎng)膜下腔間隙。常規(guī)剪毛、消毒、鋪巾，使用顱骨鉆孔器鉆孔，插入自制的骨穿刺針。在CT引導下調節(jié)穿刺位置和方向，穿刺深度約2 mm，掃描確認穿刺針尖位于蛛網(wǎng)膜下腔后，使用針筒緩慢推注混合有CT對比劑的兔自體動脈血，總量1.0～1.5 mL。推注完畢后，再次行CT掃描確認兔腦表面有稍高密度影(混合對比劑的自體動脈血)分布、且無明確腦內血腫即表明SAH引發(fā)成功(圖1)。拔除穿刺針、壓迫止血、封閉創(chuàng)口，確定無腦脊液和血液從穿刺口溢出后，轉移至CT機房外頭低足高位放置30min。

注血后處置：將完成SAH造模的新西蘭兔分為兩組，送回浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心常規(guī)方法飼養(yǎng)，A組20只飼養(yǎng)105天，B組11只飼養(yǎng)154天。飼養(yǎng)過程中觀察新西蘭兔進食、活動情況，無特殊抗感染、營養(yǎng)輸液等處理。

4.影像及病理檢查

MRI檢查：采用上述方法將兔常規(guī)麻醉。檢查時兔俯臥位于檢查臺上，頭部正中矢狀線與與掃描矢狀線重合，兔雙側外耳道連線為平面為冠狀位基本平面，掃描序列及掃描參數(shù)見表1。

大體標本獲?。?MR檢查后3天內處死實驗兔。開胸經(jīng)左心室主動脈插管，福爾馬林灌注固定后，用咬骨鉗除去顱蓋取完整腦組織，放入福爾馬林容器中固定保存。固定一周后，攝兔腦組織大體表面照片。

病理檢查：由同一位放射科醫(yī)師對照分析CT穿刺圖像、MR圖像及腦組織大體表面照片，確定病理檢查的靶層面，切取靶層面冠狀位腦組織，常規(guī)組織脫水、透明、浸臘。然后沿冠狀位以4μm厚度對腦組織進行連續(xù)切片并進行普魯士藍染色。

圖1 顱骨穿刺注血。a)顱骨鉆孔自制鉆孔器，頭部帶有深度固定裝置，防止穿刺過深；b)穿刺注血；c)注血后入CT機定位掃描，驗證是否存在蛛網(wǎng)膜下腔出血；d)CT掃描驗證軟組織窗，腦表面可見線樣的高密度(箭)，代表注射的混合有對比劑的動脈血； e)帶針掃描驗證骨窗，進針深度合適；f)不帶針掃描，無金屬放射偽影，蛛網(wǎng)膜下腔出血顯示更清晰(箭)。

5.資料獲取和診斷標準

資料獲取：由2位放射科醫(yī)師共同觀察所有實驗兔的顱腦CT和MR圖像；由1位病理科醫(yī)師在放射科醫(yī)師的提示下，觀察所有實驗標本的普魯士藍染色。本研究以大體肉眼觀、MR影像和普魯士藍鐵染色三者同時觀察到含鐵血黃素沉著作為最終陽性病例。

診斷標準：對于大體標本，在腦表面鄰近穿刺部位可肉眼觀察到焦黃色物質為陽性，無則為陰性。在SWI序列MRI 上在腦表面觀察到線性低信號(含鐵血黃素)則為陽性，無則為陰性。顯微鏡下觀察：無論部位，在腦表面有藍色顆粒物沉積則為陽性，無顆粒樣物質沉積為陰性。

6.統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析。以病理結果為金標準，采用Fisher精確概率檢驗對飼養(yǎng)105天(A組)與154天(B組)的兔標本中的陽性率進行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

本組38只實驗兔，麻醉過程中死亡3只，注血后未蘇醒4只，剩余31只實驗兔完成了顱骨直接穿刺注射自體動脈血，通過CT掃描均可在實驗兔腦表面觀察到高密度影(圖1)。實驗兔在蘇醒后即送回動物房飼養(yǎng)。顱骨直接穿刺注血法制成SAH模型的成功率為81.6%(31/38)。

注射自體動脈血后，飼養(yǎng)過程中死亡6只，分別為術后第2天(2只)、3天(1只)、6天(2只)和8天(1只)，余下25只實驗兔完成了全部實驗過程，從注血到動物處死的時間間隔分別為105(A組，n=16)和154天(B組，n=9)。25只實驗兔，有10只SS-CNS病理檢查結果為陽性，由SAH發(fā)展為SS-CNS的發(fā)生率為40%(10/25)；其中A組有6只(6/16)，B組有4只(4/9)，兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.53)。

SS-CNS造模后進行病理檢查，肉眼觀察大體標本呈陽性表現(xiàn)者11只，可觀察到局部有3～5 mm大小的焦黃色區(qū)域，中心區(qū)域焦黃色較深，周圍顏色較淡(圖2)。病理檢查有陽性表現(xiàn)者10只，普魯士藍染色可見藍色顆粒樣物質沉積于腦表面(圖3)，其中有4只實驗兔可以在顱腦的不同部位觀察到藍色顆粒樣物質沉積。MRI顯示腦表面有異常表現(xiàn)者11只，SWI序列上沿腦表面均可見低信號，在T2WI上有7只可以觀察到腦表面的低信號(圖4)。

討 論

穿刺注血引發(fā)SAH的目的是為了制成SS-CNS模型，因此實驗的關鍵步驟為成功建立SAH模型。在1969年，Offerhaus等[9]最先采用自體血注入蛛網(wǎng)膜下腔的方法來制備SAH模型，1988年，Endo等[10]采用結扎雙側頸總動脈后枕大池二次注血的方法制備兔癥狀性SAH模型，1995年，bederson等[11]和Veelken等[12]采用血管內絲線穿刺頸內動脈分叉處的方法成功建立了SAH模型，并能模擬SAH急性期的病理生理變化過程。但目前主流SAH造模方法均是為了研究SAH后的早期腦損傷(early brain injury，EBI)[13]，并不適用于對SAH遠期并發(fā)癥(如SS-CNS)的研究。且以上方法操作復雜，實驗動物遠期死亡率高。本文報道了針對SS-CNS的顱骨穿刺注血引發(fā)SAH的方法，操作簡便并具有較高的成功率。傳統(tǒng)SAH模型的出血量不易控制，極容易因顱內高壓導致實驗動物死亡。而本實驗方法可以精準控制注血量，從而減少因顱內壓過高所導致的實驗兔死亡和實驗失敗。為了盡量避免穿刺中損傷腦組織，我們采取了以下措施：注血針的傾斜部分長度約1 mm，并且在針上設有一個卡位裝置，防止穿刺過深，損傷腦表面。在穿刺過程中由CT引導穿刺，可以大致判斷進針深度及針尖位置，同時可驗證注入的血液是否位于蛛網(wǎng)膜下腔。最終病理和影像學觀察也可以觀察腦表面是否存在顱腦損傷。穿刺損傷腦組織后的病理改變其實與腦外傷后的病理改變有很多相似之處，臨床上腦外傷繼發(fā)SAH的患者也常伴隨有顱骨骨折和腦組織的損傷，因此即使輕微的腦損傷也不會對實驗最終結論造成很大影響。

圖2 大體解剖標本，可見腦表面的褐色物質(箭)。 圖3 普魯士藍染色病理片。a)鏡下示藍色線樣及顆粒狀物質(含鐵血黃素，箭)沉積于腦表面(×40倍)； b) 鏡下可見藍色物質(箭)顯示更清楚(×400倍)； c) 同一切片在另一處也可見藍色物質(箭)沉積(×40倍)。

圖4 MRI檢查。a)MR T1WI上無明顯病灶顯示； b)T2WI上左側頂葉可見少許低信號帶(箭)；c) SWI序列上低信號帶顯示更清楚(箭)。

1960年有學者通過重復向實驗犬的蛛網(wǎng)膜下腔注射右旋糖酐鐵的方法復制出SS-CNS模型[14]。1991年Koeppen等[15-16]通過連續(xù)6個月向成年新西蘭兔反復注射自體洗刷紅細胞成功制出新西蘭兔SS-CNS模型，Koeppen認為SS-CNS是腦組織反復接觸紅細胞崩解產物，并經(jīng)過一個相當長的過程才得以形成SS-CNS，而單次SAH后的紅細胞可被腦脊液清除，不會造成SS-CNS。因此，目前絕大多數(shù)的學者認為SS-CNS是由于慢性、長期、少量、重復的SAH引起[17]。但是目前為止尚沒有學者采用單次的自體血蛛網(wǎng)膜下腔注射來制作SS-CNS模型。本研究首個采用單次的自體動脈血蛛網(wǎng)膜下腔注射來制作SS-CNS病理模型，并且通過病理檢查及影像學檢查驗證該模型。顱骨穿刺單次注血法模擬SAH的血液主要集中于大腦皮層表面，出血范圍比傳統(tǒng)SAH造模方法例如顱內動脈穿刺等出血范圍更為集中，從而更易引起含鐵血黃素腦表面沉積，是一種比較適合SS-CNS的造模方法。

本實驗以MR SWI序列為標準統(tǒng)計SS-CNS的陽性率為44%(11/25)，低于文獻報道的SWI顯示外傷患者96.9%的SS-CNS陽性率和動脈瘤破裂患者的54.2%的SS-CNS陽性率[7-8]。本次實驗中注血量僅為1.0～1.5 mL(平均1.16 mL)，低于臨床上患者的出血量，但加大注血量會增加實驗兔的死亡率，降低實驗的效率。因此，選擇合適的注血量是實驗中的一個關鍵因素，如何在保證實驗的陽性率的情況下盡量降低兔的死亡率，尚需進一步研究。本研究中大體標本肉眼觀察下SS-CNS的陽性率為44%(11/25)，略高于病理標本的陽性率40%(10/25)，在病理切片染色時，由于只能選擇部分切片進行染色，可能存在部分病灶的遺漏，因此必須對照大體標本圖像選取合適的取材層面，以免漏掉病灶；另一方面，僅憑肉眼觀察存在假陽性的可能。本研究中飼養(yǎng)105天與飼養(yǎng)154天的新西蘭兔，SS-CNS造模陽性率的差異無統(tǒng)計學意義，說明飼養(yǎng)時間對SS-CNS造模成功率的影響不大。

本次研究也存在一些局限性：CT及MRI機房由于設備需要所以溫度較低，實驗過程對兔保溫不夠，新西蘭兔在麻醉過程中有部分死亡從而導致實驗失敗。由于穿刺后需要飼養(yǎng)時間較長，在飼養(yǎng)過程中也有新西蘭兔死亡發(fā)生，可能與穿刺注血后僅僅單純飼養(yǎng)觀察，沒有對精神狀態(tài)差、食欲不佳的樣本進行及時補充營養(yǎng)有關。因此，后續(xù)實驗可以通過以下方式改善：麻醉穿刺時注意對新西蘭兔保溫，盡量保證室內溫度適宜；穿刺后飼養(yǎng)時定期觀察，及時對癥處理等；對實驗動物補充必要的營養(yǎng)成分。

綜上所述，本研究通過顱骨直接鉆孔單次注血法成功制作SS-CNS模型，并首次發(fā)現(xiàn)單次SAH動物模型會部分進展為SS-CNS。本實驗不僅為SS-CNS提供了新的病因假說，而且為SS-CNS研究提供了一種合理的SAH建模方法，此方法較傳統(tǒng)方法建立模型相比，具有操作相對簡單、可重復性較高的優(yōu)點，而且此實驗模型可用于研究SS-CNS的發(fā)病機制及藥物治療效果的評價。