劉青 李悅欣 趙德剛 趙懿琛

摘? ? 要： 為了解貴州省折溪‘小黃姜中內(nèi)生菌資源，采用涂布法從折溪‘小黃姜中分離、純化出內(nèi)生細(xì)菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)特征結(jié)合分子生物學(xué)手段確定其分類地位。結(jié)果表明，從折溪‘小黃姜中共分離出5株不同的內(nèi)生菌，命名為GrsB1、GrsB2、GrsB3、GrsB4、GrsB5，其中GrsB1屬于芽孢桿菌科、微小桿菌屬（Exiguobacterium），其他4株菌屬于腸桿菌科，分別屬于拉烏爾菌屬（Raoultella）、腸桿菌屬（Enterobacter）、埃希氏菌屬（Escherichia）、沙雷氏菌屬（Serratia），腸桿菌科數(shù)量最多。雖然分離出的內(nèi)生菌數(shù)量較少，但菌株種屬分布范圍較大，可以為小黃姜內(nèi)生菌資源的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 小黃姜; 內(nèi)生細(xì)菌; 分離; 鑒定

Abstract： In this study， In order to understand the endophyte resources of ‘Small yellow ginger （Zingiber officinale Roscoe） in Zhexi， Guizhou province， a coating method was used to isolate and purify endogenous bacteria from ‘Small yellow ginger ， and its classification status was determined by morphological characteristics combined with molecular biological methods. The results showed that five endophytes were isolated from ‘Small yellow ginger， named Grsb1， Grsb2， Grsb3， Grsb4 and Grsb5， Grsb1 belongs to Bacillus ， Exiguobacterium. The other four strains belong to raoultella， enterobacter， Escherichia and Serratia in Enterobacteriaceae respectively， the largest number of Enterobacteriaceae. The number of endophytes isolated in this study is small， but the distribution of strains is large， which can provide theoretical basis for further research on the endophyte resources of ‘Small yellow ginger.

植物內(nèi)生菌是指其生活史的一定階段或全部階段生活在健康植物各種組織器官內(nèi)部或組織間隙中的微生物[1]。Bacon等[2]研究發(fā)現(xiàn)，食用有內(nèi)生菌的高羊茅會(huì)使牛、羊中毒，此后，對(duì)植物內(nèi)生菌的研究才引起人們的高度重視。目前在已報(bào)道的各種農(nóng)作物以及經(jīng)濟(jì)作物中發(fā)現(xiàn)的植物內(nèi)生細(xì)菌已經(jīng)超過(guò)129種，分別屬于54個(gè)屬，主要為假單胞菌屬 （Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、土壤桿菌屬 （Agrobacterium）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、泛菌屬（Pantoea）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）等[3]。用于內(nèi)生菌研究的植物主要是藥用植物[4]、經(jīng)濟(jì)作物[5-6]、瓜果[7-8]等，研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生細(xì)菌不僅能促進(jìn)宿主植物的生長(zhǎng)，增強(qiáng)宿主植物對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)性[9-11]，還對(duì)植物病原菌有較好的抑制作用[12-13]。

《中藥大辭典》記載，姜是重要的藥食同源植物，具有消炎、散熱、解毒等功效，研究發(fā)現(xiàn)姜中含有的姜精油、姜辣素及黃酮類化合物等化學(xué)成分具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖等作用[14]，還由于其獨(dú)特的辛辣氣味而作為調(diào)料品廣泛應(yīng)用于食物調(diào)味，具有重要的醫(yī)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。折溪‘小黃姜（Zingiber officinale Roscoe）是六盤水折溪鄉(xiāng)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期栽培選育出的優(yōu)良栽培種，屬于姜科姜屬姜種。2000年經(jīng)中科院地理科學(xué)與資源研究所鑒定，折溪‘小黃姜為高品質(zhì)生姜，其姜油含量為0.72%，姜辣素含量為2.85%，有機(jī)硒為1.20 mg·kg-1，其中姜油和姜辣素含量分別是國(guó)內(nèi)其他品種姜的2～3倍[15]。目前對(duì)小黃姜的研究主要是栽培技術(shù)[16-17]和有效成分提取[18]，對(duì)內(nèi)生菌的研究比較少。楚敏等[19]從生姜中分離得到23株內(nèi)生細(xì)菌，分為5個(gè)屬，周寧[20]從新鮮姜塊中分離得到47株內(nèi)生菌，并且發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌對(duì)姜瘟病具有一定的抑制作用，但是關(guān)于折溪‘小黃姜內(nèi)生菌資源的研究未見(jiàn)報(bào)道。筆者以貴州省六盤水市六枝特區(qū)折溪鄉(xiāng)‘小黃姜為材料，對(duì)其內(nèi)生菌進(jìn)行分離、鑒定，為折溪鄉(xiāng)‘小黃姜內(nèi)生菌資源的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為取自貴州省六盤水市六枝特區(qū)折溪鄉(xiāng)的折溪‘小黃姜，折溪鄉(xiāng)地處東經(jīng)105°10'～105°15'，北緯26°05'～26°11'，海拔581～2 900 m，年平均氣溫和年平均降雨量適合小黃姜生長(zhǎng)。試驗(yàn)于2018年10月在貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離 用水將材料表面的泥沙沖洗干凈，置于陰涼處自然晾干。把姜組織塊切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，用0.1%多菌靈溶液浸泡5 min，流水沖洗2 h，分別對(duì)其進(jìn)行編號(hào)。在超凈臺(tái)進(jìn)行表面消毒，先用75%的酒精震蕩消毒5～7 min，無(wú)菌水沖洗3次，再用0.1%升汞消毒5 min，無(wú)菌水沖洗3次，用無(wú)菌吸水紙吸干水分，放在超凈臺(tái)自然晾干。取100 μL最后一次沖洗的無(wú)菌水涂布在LB培養(yǎng)基上，設(shè)置3次重復(fù)，37 ℃倒置培養(yǎng)3 d，觀察平板上是否有菌落出現(xiàn)，若沒(méi)有則說(shuō)明組織塊表面消毒徹底，后續(xù)試驗(yàn)中分離得到的細(xì)菌均為內(nèi)生細(xì)菌。

將表面消毒的組織塊用無(wú)菌刀片去皮后切成碎塊，放在無(wú)菌研缽中，用無(wú)菌的石英砂和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%的氯化鈉溶液充分研磨，用移液槍吸取1 mL上清液進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋后的溶液各取100 μL涂布于LB平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d。待其長(zhǎng)出菌落后，挑取不同形態(tài)的菌落分別涂布在新的LB平板上，反復(fù)純化，直到整個(gè)平板上菌落的形態(tài)完全一致并出現(xiàn)單菌落。挑取單菌落，37 ℃，180 r·min-1過(guò)夜搖菌，25%甘油保存。

1.2.2 內(nèi)生細(xì)菌的形態(tài)特征與革蘭氏染色 將純化得到的菌株在LB培養(yǎng)基上劃板，37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察并登記單菌落的形態(tài)、質(zhì)地、邊緣、顏色、透明度。挑取單菌落革蘭氏染色后，在100倍油鏡下觀察染色情況。

1.2.3 掃描電鏡（SEM）觀察 參照胡春輝等[21]的方法，將冷凍干燥后的樣品進(jìn)行離子濺射噴金處理后，用掃描電子顯微鏡拍照。

1.2.4 小黃姜內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA擴(kuò)增及分子鑒定 挑取單菌落在LB液體培養(yǎng)基中37 ℃、180 r·min-1搖床過(guò)夜培養(yǎng)，離心收集菌體，用細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒進(jìn)行DNA提取。以細(xì)菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行16S rRNA序列擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系（10 μL）：Premix Taq（Takara Taq）5 μL;引物27F（10 μmol·L-1）和1492R （10 μmol·L-1）各0.3 μL;基因組DNA 1 μL ;無(wú)菌ddH2O 3.4 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s;55 ℃退火30 s;72 ℃延伸2 min;共30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min;4 ℃保存，擴(kuò)增結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。將擴(kuò)出目的條帶的對(duì)應(yīng)模板用高保真酶（Invitrogen）進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系（20 μL）：包括10× High Fidelity PCR Buffer 2 μL;50 mmol·L-1 MgSO4 0.8 μL;10 mmol·L-1 dNTP 0.4 μL;引物27F（10 μmol·L-1）和1492R （10 μmol·L-1）各0.4 μL;Hatinum Taq 0.08 μL;基因組DNA 1 μL;無(wú)菌ddH2O 14.92 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s;68 ℃延伸2 min;共30個(gè)循環(huán)，68 ℃延伸5 min;4 ℃保存。PCR產(chǎn)物采用Cycle-Pure Kit（D6492-01）（omega）試劑盒進(jìn)行純化，步驟參照說(shuō)明書。

純化后的產(chǎn)物送至華大科技（廣州）測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用Seqman軟件進(jìn)行序列拼接，在NCBI中進(jìn)行同源序列比對(duì)，用軟件MEGA 7.0采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，初步對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分子鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離與初步鑒定

通過(guò)革蘭氏染色結(jié)果可以看出，染色后GrsB1菌體呈紫色，GrsB2、GrsB3、GrsB4、GrsB5菌體均呈紅色，因此可以判定GrsB1為陽(yáng)性菌，其他4株菌均為陰性菌。將分離的菌株在LB固體培養(yǎng)基上劃板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后觀察其形態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)5株菌菌落均為圓形，邊緣規(guī)則，菌落表面濕潤(rùn)，有光澤，GrsB2和GrsB3無(wú)色素產(chǎn)生，其他3種有色素，其中GrsB1初培養(yǎng)時(shí)菌落表面為淡黃色，隨著培養(yǎng)時(shí)間的加長(zhǎng)，慢慢變?yōu)榻瘘S色;GrsB4為淡黃色;GrsB5開(kāi)始為乳白色，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)菌落中間變?yōu)榧t色。形態(tài)特征見(jiàn)表1。

2.2 小黃姜內(nèi)生細(xì)菌基因組DNA提取與16S rRNA序列擴(kuò)增

5株菌株均提取出高質(zhì)量的DNA（圖1），以該DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，均擴(kuò)增出1 500 bp左右的條帶（圖2），擴(kuò)增效果較好。

2.3 小黃姜內(nèi)生細(xì)菌16s rRNA序列分析

將測(cè)序結(jié)果用Blast軟件進(jìn)行比對(duì)分析，找出相似度最高的序列作為同源序列（表2），并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3）。小黃姜內(nèi)生菌16S rRNA序列測(cè)序比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5株菌的16S rRNA與GENEBACK中已知16S rRNA序列最高相似性均在99%以上，其中3株菌的相似度為100%，說(shuō)明這5株內(nèi)生菌均為已知菌（表2）。分析發(fā)現(xiàn)，5株菌屬于2個(gè)科5個(gè)屬，GrsB1屬于芽孢桿菌科，GrsB2、GrsB3、GrsB4、GrsB5屬于腸桿菌科，數(shù)量最多是優(yōu)勢(shì)菌株，5株菌分別屬于微小桿菌屬（Exiguobacterium）、拉烏爾菌屬（Raoultella）、腸桿菌屬（Enterobacter）、埃希氏菌屬（Escherichia）、沙雷氏菌屬（Serratia）。從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以看出5株菌聚為兩個(gè)大類，GrsB1屬于陽(yáng)性菌，單獨(dú)聚為一支，其余4株菌屬于陰性菌聚為一支。5株菌都單獨(dú)聚為一支，說(shuō)明其遺傳關(guān)系較近。

3 討 論

筆者選取貴州省六盤水六枝特區(qū)折溪鄉(xiāng)‘小黃姜為試驗(yàn)材料，通過(guò)嚴(yán)格的消毒過(guò)程，從材料組織塊中分離得到5株內(nèi)生細(xì)菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定與16s rRNA序列分析，初步鑒定5株內(nèi)生菌屬于2個(gè)科5個(gè)屬，1個(gè)屬于芽孢桿菌科，微小桿菌屬（Exiguobacterium），4個(gè)屬于腸桿菌科，分別屬于拉烏爾菌屬（Raoultella）、腸桿菌屬（Enterobacter）、埃希氏菌屬（Escherichia）、沙雷氏菌屬（Serratia），筆者分離得到的5株內(nèi)生菌中腸桿菌科的最多，這與Rohini S[9]的研究結(jié)果一致。筆者在分離內(nèi)生菌過(guò)程中以最后沖洗姜塊的無(wú)菌水為陰性對(duì)照，并未培養(yǎng)出任何細(xì)菌，說(shuō)明操作過(guò)程嚴(yán)謹(jǐn)，消毒徹底，分離出的細(xì)菌均為內(nèi)生細(xì)菌。本試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基為培養(yǎng)細(xì)菌的LB培養(yǎng)基，因此只分離出‘小黃姜中的內(nèi)生細(xì)菌，周寧[20]從大姜中分離出的內(nèi)生菌，除了大量的內(nèi)生細(xì)菌外還包括少量的放線菌和內(nèi)生真菌，因此后續(xù)研究會(huì)使用多種培養(yǎng)基，以期將放線菌和內(nèi)生真菌分離出來(lái)，豐富該材料內(nèi)生菌資源。楚敏[19]從生姜中分離的內(nèi)生細(xì)菌包括了5個(gè)屬8個(gè)種，與本研究的結(jié)果有差異，差異的原因可能是本試驗(yàn)與后者使用材料的品種、產(chǎn)地、培養(yǎng)基均不同所導(dǎo)致的，另外，折溪鄉(xiāng)‘小黃姜所含的姜精油、姜辣素均高于普通生姜，姜辣素與姜精油都有一定的抑菌效果，對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等有不同程度的抑制作用[22]，這可能也是本次試驗(yàn)中分離得到的內(nèi)生細(xì)菌較少的原因。

貴州省六枝特區(qū)種植大量‘小黃姜，但是由于連作和無(wú)性繁殖等原因，‘小黃姜體內(nèi)積累大量的病毒病菌，影響其品質(zhì)和口感[23]。廖震[24]利用sRNA 高通量序技術(shù)對(duì)貴州省六盤水市折溪鄉(xiāng)的小黃姜進(jìn)行了病毒預(yù)測(cè)，首次在小黃姜中發(fā)現(xiàn)一個(gè)桿狀DNA病毒屬的新病毒，命名為小黃姜桿狀病毒（Zingiber bacilliform virus，ZBV） 。因此，內(nèi)生菌對(duì)‘小黃姜病原菌的抑制作用也是接下來(lái)重要的研究方向。芽孢桿菌屬在生防菌中有非常大的應(yīng)用前景[25-26]，傅俊范等[27]從土壤中分離出一株枯草芽孢桿菌，對(duì)人參銹腐病有較好的抑制作用，未見(jiàn)微小桿菌對(duì)植物病原菌抑菌作用的報(bào)道，但其對(duì)藍(lán)藻具有促生作用[28]，還能夠降解農(nóng)藥殘留，修復(fù)環(huán)境污染[29]。陳政[30]的研究表明，腸桿菌屬能夠抑制姜瘟病病原菌的生長(zhǎng)，陳濤[31]發(fā)現(xiàn)腸桿菌屬是生姜內(nèi)生菌的優(yōu)勢(shì)菌株。粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)生的次生代謝物靈菌紅素對(duì)煙草花葉病毒具有抑制作用，還能誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性（ISR）[32]。因此，筆者后續(xù)將針對(duì)分離的內(nèi)生菌對(duì)‘小黃姜的致病菌的抑制作用展開(kāi)研究，以期找到‘小黃姜的優(yōu)良生防菌株。

另一方面，‘小黃姜是典型的藥食同源植物，內(nèi)生菌與宿主植物共生，能夠產(chǎn)生與宿主植物相同的藥效[33-35]，有文獻(xiàn)報(bào)道粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)生的靈菌紅素對(duì)癌細(xì)胞有抑制作用[36]。因此后續(xù)試驗(yàn)可對(duì)內(nèi)生菌的活性成分進(jìn)行研究，以期找到對(duì)人類健康有益的內(nèi)生菌。

綜上所述，筆者從折溪鄉(xiāng)‘小黃姜中分離得到5種內(nèi)生細(xì)菌，屬于2個(gè)科5個(gè)屬，數(shù)量不多，但其所分離菌株的種屬分布范圍較大，為后期拮抗菌株的篩選和活性成分研究奠定了良好的理論基礎(chǔ)。

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