鄭賀云 李超 姚軍 廖新福 耿新麗

摘 要： 為了探討MAPK基因在甜瓜中的表達(dá)調(diào)控模式，以感病甜瓜品種‘哈密加格達(dá)和抗病甜瓜品種‘Edisto47為試驗(yàn)材料，采用實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）方法，研究了外源信號(hào)分子茉莉酸甲酯（MeJA）、脫落酸（ABA）和褪黑素（MT）誘導(dǎo)處理甜瓜葉片中MAPK基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，甜瓜品種中3個(gè)MAPK相關(guān)基因MAPK21、MAPK20、MAPK9在接種白粉病菌后均出現(xiàn)了上調(diào)表達(dá)，MeJA處理抗病甜瓜品種后，3個(gè)基因在36 h的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高，分別為130.74、107.74和99.71，處理感病甜瓜品種后，各基因在60 h的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高，分別為29.32、18.35和17.34;ABA和MT處理也是同樣的變化趨勢(shì)，但表達(dá)量低于MeJA處理，由此說明3個(gè)MAPK基因在抗病甜瓜品種中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于感病品種，MAPK21基因相對(duì)表達(dá)量高于MAPK20和MAPK9，且MeJA處理的甜瓜有助于MAPK21基因表達(dá)調(diào)控，提高其抗白粉病的能力。

關(guān)鍵詞： 甜瓜; 外源信號(hào)分子; MAPK基因; 表達(dá)分析

Abstract： In order to investigate the gene expression involved in MAPK signal transduction pathway in melon， the susceptible melon cultivar ‘Hamijiageda and disease-resistant melon cultivar ‘Edisto47 melon were used as test materials， the expression of the MAPK genes were studied by quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction（qRT -PCR）， the external signal molecules were methyl jasmonate （MeJA）， abscisic acid （ABA） and melatonin （MT）. The results showed that the expressions of MAPK21， MAPK20 and MAPK9 in melon varieties were up-regulated after being inoculated with powdery mildew. The disease-resistant melon cultivar 's expression of three MAPK genes was the largest after MeJA treatment for 36 hours， and the expression respectively were 130.74、107.74 and 99.71. The susceptible melon cultivars expression of three MAPK genes was the largest after MeJA treatment for 60 hours， and the expression respectively were 29.32、18.35 and 17.34; ABA and MT change trend was same variation tread with MeJA， but the expression leave lower than MeJA processing， It was concluded that the relative expression of MAPK genes in disease-resistant melon cultivar significantly higher than that of cultivars. Compared with the MAPK20 and MAPK9， the relative expression MAPK21 gene was higher， the MeJA treatment will help MAPK21 gene expression regulation， improve the resistance to powdery mildew.

甜瓜是葫蘆科（Cucurbitaceae）香瓜屬（Cucumis）一年蔓生草本植物，在我國具有悠久的栽培歷史，且栽培面積居世界前列[1]。其中，新疆栽培面積更大，是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民創(chuàng)收的主要經(jīng)濟(jì)作物之一。然而，甜瓜白粉病是當(dāng)?shù)厣a(chǎn)中廣泛發(fā)生的重要病害之一，在很大程度上制約了當(dāng)?shù)靥鸸袭a(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，如果預(yù)防不到位將造成甜瓜植株葉片變黃萎蔫以致大面積枯死，對(duì)甜瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)帶來很大危害[2]。挖掘甜瓜優(yōu)異抗病基因資源用于抗病新品種的培育，是從根本上解決甜瓜白粉病病害的有效途徑[3]。

促分裂原活化蛋白激酶級(jí)聯(lián)途徑（Mitogen-activated protein kinases， MAPKs）是在真核生物中廣泛存在的一種十分重要的保守信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，在調(diào)節(jié)生物體對(duì)環(huán)境的主動(dòng)適應(yīng)過程中占非常重要的作用，通常包括3個(gè)級(jí)別的功能蛋白激酶，分別是促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAPKKK）、促分裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKK）和促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）[4-5]。隨著各園藝作物基因組測(cè)序的完成，大量的MAPK級(jí)聯(lián)途徑基因家族成員先后從擬南芥、煙草、番茄、草莓、黃瓜、西瓜等[6-11]園藝作物中鑒定出來。其中MAPK受信號(hào)分子或細(xì)胞外刺激，經(jīng)過MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)（MAPKKK—MAPKK—MAPK）而激活的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過蛋白質(zhì)磷酸化作用響應(yīng)外界信號(hào)并通過上游信號(hào)級(jí)聯(lián)放大并傳遞至細(xì)胞內(nèi)的蛋白激酶，在調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育、脅迫響應(yīng)及抗病反應(yīng)等許多生理生化過程中起重要作用[12]。筆者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，甜瓜MAPK 3個(gè)基因參與了由水楊酸（SA）、乙烯利（ETH）和南瓜白粉病病原菌介導(dǎo)的植物抗病防衛(wèi)反應(yīng)的基本信號(hào)通路，初步判斷了MAPK 3個(gè)基因在甜瓜中的表達(dá)功能[13]。該試驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，以甜瓜感白粉病品種‘哈密加格達(dá)、抗白粉病品種‘Edisto47為試驗(yàn)材料，采用MeJA、ABA和MT作為外源信號(hào)分子進(jìn)行處理，無菌水處理作為對(duì)照。調(diào)查感病率并采用熒光定量PCR技術(shù)分析甜瓜抗白粉病相關(guān)基因MAPK21、MAPK20和MAPK9的差異表達(dá)，通過外源誘導(dǎo)提高甜瓜抗病基因MAPK的表達(dá)水平來防御甜瓜白粉病菌的侵染，以期找到防治甜瓜白粉病的高效新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料分別為感病品種‘哈密加格達(dá)和抗病品種‘Edisto47，2份種子購自國家西瓜甜瓜中期庫。其中‘哈密加格達(dá)為地方品種，原產(chǎn)于新疆吐魯番市鄯善縣，為厚皮甜瓜類型，果皮灰綠色，果面有粗網(wǎng)紋，果肉淺綠色，肉質(zhì)脆，不抗白粉病;‘Edisto47是由南卡羅納州布萊克維爾大學(xué)選育的厚皮甜瓜品種，果皮深綠色，成熟后變成黃綠色，果實(shí)高圓，果面有粗網(wǎng)紋，肉質(zhì)軟，高抗白粉病。

甜瓜白粉病菌生理小種Race 1由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)西甜瓜分子育種實(shí)驗(yàn)室提供。熒光定量PCR引物、反轉(zhuǎn)錄試劑盒等試材由奧科鼎盛生物有限公司提供、合成。

1.2 方法

2019年8—12月在河南科技學(xué)院園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)室完成。選取飽滿無傷的甜瓜種子，消毒處理后經(jīng)過28 ℃恒溫處理催芽，播種到50穴育苗盤中，置于人工氣候培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，溫度25 ℃、相對(duì)濕度60%，16 h光照/8 h黑暗。

將白粉病病原菌接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上震蕩培養(yǎng)，黑光燈誘導(dǎo)病原菌孢子的產(chǎn)生。制成濃度為1×106個(gè)·mL-1 的白粉病病原菌分生孢子懸浮液。

植株長(zhǎng)出3～4片真葉后分別利用0.05 mmol·L-1 MeJA、0.03 mmol·L-1 ABA和 0.01 mmol·L-1 MT噴灑于甜瓜葉片表面，每個(gè)處理10株苗，3次重復(fù)，無菌水作為對(duì)照。在噴施2 d后接種甜瓜白粉病菌，扣小棚保持溫度在25～28 ℃、相對(duì)濕度大于90%、16 h光照/8 h黑暗。分別于接種后0、6、12、36、60、84、108、132 h進(jìn)行感病率調(diào)查，并取其葉片迅速置于液氮中冷凍后放置-80 ℃冰箱中保存，為測(cè)定MAPK基因相對(duì)表達(dá)量做準(zhǔn)備。感病率/%=感病株數(shù)/總株數(shù)×100。

MAPK引物由奧科鼎盛生物有限公司合成（表1）。采用CTAB法提取甜瓜總RNA，cDNA第一條鏈用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser合成試劑盒合成。以經(jīng)過MeJA、ABA和MT不同時(shí)間處理的抗病和感病甜瓜葉片的cDNA為模板，PCR反應(yīng)體系：模板1.0 μL，上、下游引物各0.8 μL（10 μmol·L-1，表1），dNTP Mix 10 μL（10 mmol·L-1），加 ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，33個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃保持。PCR產(chǎn)物利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

甜瓜MAPK基因片段的熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：SYBR 10.0 μL，上、下游引物各0.8 μL，加入7.4 μL ddH2O補(bǔ)至19.0 μL，計(jì)算做出熒光定量試劑混合樣品，之后將混合樣分裝到96孔板中，每孔19.0 μL，每孔加入1.0 μL cDNA模板，每個(gè)處理的cDNA模板2次重復(fù)，覆膜離心混勻，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 min，95 ℃變性10 min，59 ℃退火 30 min，95 ℃延伸10 min，65 ℃ 5 min，95 ℃ 5 min。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用DPS 19.0數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并利用Excel 2003對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源信號(hào)分子誘導(dǎo)處理后對(duì)2個(gè)甜瓜品種白粉病感病率的影響

由圖1可知，首先是抗病甜瓜品種感病率遠(yuǎn)低于感病甜瓜品種，隨著白粉病菌接種時(shí)間的延長(zhǎng)，感病品種感病率一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在132 h時(shí)，感病率達(dá)到96.67%，而抗病品種感病率為43.33%。在3個(gè)不同外源信號(hào)分子處理后，2個(gè)甜瓜品種的感病率與對(duì)照相比均有不同程度降低，不同外源信號(hào)分子處理對(duì)甜瓜白粉病的抗病效果不同，總體表現(xiàn)出一定的時(shí)間效應(yīng)，表明MeJA、ABA、MT具有提高甜瓜白粉病抗性的作用。其中，MeJA處理下的抗病甜瓜品種感病率明顯低于對(duì)照，且隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，感病率變化不大，趨勢(shì)平穩(wěn)，MeJA處理下的感病甜瓜品種感病率明顯低于對(duì)照，且隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，感病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，MeJA處理后，對(duì)甜瓜白粉病的抗病效果誘導(dǎo)較佳，強(qiáng)于ABA、MT誘導(dǎo)效果，說明MeJA處理有助于提高甜瓜白粉病的抗性。

2.2 抗病和感病甜瓜葉片在不同外源信號(hào)分子誘導(dǎo)下MAPK基因表達(dá)量分析

經(jīng)外源誘導(dǎo)處理后，抗病甜瓜品種‘Edisto47中MAPK21基因表達(dá)出現(xiàn)差異。對(duì)于每一個(gè)基因，相同時(shí)間點(diǎn)的處理組的表達(dá)量是對(duì)照組的3倍以上則差異顯著，如果它們之間的表達(dá)量差異為5倍及以上時(shí)，則差異極顯著[12]。由圖2可知，接種后立即測(cè)定MAPK21基因的表達(dá)量，CK表達(dá)量為2.30，隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，CK的MAPK21基因表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，在接種36 h后表達(dá)量達(dá)到最高，其表達(dá)量為33.74，接種60、84、108和132 h變化趨勢(shì)比較平穩(wěn)，說明MAPK21基因響應(yīng)甜瓜白粉病菌脅迫處理。

用MeJA、ABA和MT處理接種白粉病菌的材料后立即測(cè)定MAPK21基因的表達(dá)量，其表達(dá)量分別為對(duì)照組的9.52倍、5.28倍和5.37倍，差異極顯著;隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，3個(gè)處理的MAPK21基因的表達(dá)量均出現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，均在36 h后達(dá)到最高，MeJA處理為CK的3.87倍差異顯著，但ABA和MT處理分別為對(duì)照組的2.36倍和1.77倍，差異不顯著，說明MeJA處理誘導(dǎo)MAPK21基因上調(diào)表達(dá)效果顯著。

經(jīng)外源誘導(dǎo)處理后，感病甜瓜品種‘哈密加格達(dá)中MAPK21基因表達(dá)出現(xiàn)差異。由圖3可知，接種后立即測(cè)定MAPK21基因的表達(dá)量，CK表達(dá)量為0.27，隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，CK的MAPK21基因表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，在接種60 h后達(dá)到最高，其表達(dá)量為1.13，接種84、108、132 h出現(xiàn)下降趨勢(shì)，趨勢(shì)變化比較大，說明感病品種中MAPK21基因也響應(yīng)甜瓜白粉病菌脅迫處理，但是表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于抗病品種。

用MeJA、ABA和MT處理接種白粉病菌的材料后立即測(cè)定處理表達(dá)量，其中MeJA處理MAPK21基因表達(dá)量為CK的15.96倍，差異極顯著;而ABA處理和MT處理表達(dá)量為CK表達(dá)量的4.85倍，差異顯著。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，3個(gè)處理的MAPK21基因的表達(dá)量均在處理60 h后達(dá)到最高，各處理的MAPK21基因的表達(dá)量分別為對(duì)照組的25.95倍、8.78倍和5.26倍，都超過對(duì)照組的5倍以上，差異極顯著，但是MeJA處理表達(dá)量最高，說明MeJA處理誘導(dǎo)感病甜瓜品種后MAPK21基因上調(diào)表達(dá)效果最顯著，結(jié)合圖2結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MeJA處理甜瓜品種，有助于MAPK21基因表達(dá)調(diào)控，提高其抗白粉病的能力。

對(duì)比圖2和圖3可以看出，3個(gè)處理誘導(dǎo)2個(gè)不同甜瓜品種的MAPK21基因相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值的時(shí)間不同，抗病甜瓜品種均在36 h出現(xiàn)最高相對(duì)表達(dá)量，而感病甜瓜品種均在60 h才出現(xiàn);MeJA處理的抗病甜瓜品種在36 h出現(xiàn)最高相對(duì)表達(dá)量為130.74，感病甜瓜品種在60 h出現(xiàn)最高相對(duì)表達(dá)量為29.32，抗病甜瓜品種MAPK21基因相對(duì)表達(dá)量是感病甜瓜品種的4.46倍，說明抗病甜瓜品種基因調(diào)控表達(dá)能力強(qiáng)。

由圖2和圖3還可以看出，MeJA、ABA和MT處理抗病甜瓜品種60、84、108、132 h后，抗病甜瓜品種MAPK21基因相對(duì)表達(dá)量變化趨勢(shì)比較平穩(wěn)，說明抗病品種有助于防御白粉病菌，而處理的感病甜瓜品種84、108、132 h后，MAPK21基因相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)下降趨勢(shì)，說明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，感病品種基因調(diào)節(jié)抵御白粉病菌的能力下降。

經(jīng)外源信號(hào)分子誘導(dǎo)處理后，抗病甜瓜品種‘Edisto47和感病甜瓜品種‘哈密加格達(dá)中MAPK20基因和MAPK9基因表達(dá)變化趨勢(shì)同MAPK21基因，也出現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)（見圖4～7），說明這2個(gè)基因?qū)τ谔鸸习追鄄】剐苑矫嬉簿哂幸欢ǖ捻憫?yīng)性，但MeJA處理后的2個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量高于ABA處理和MT處理。另外由圖2～7對(duì)比可知，MeJA處理的抗病甜瓜品種MAPK21、MAPK20和MAPK9的相對(duì)表達(dá)量較高量分別為130.74、107.74和99.71，而用MeJA處理感病甜瓜品種MAPK21、MAPK20和MAPK9的相對(duì)表達(dá)量較高量分別為29.32、18.35和17.34;ABA和MT 2個(gè)處理也是同樣的變化趨勢(shì)，因此2個(gè)試驗(yàn)材料經(jīng)過接種白粉病菌對(duì)比發(fā)現(xiàn)，抗病甜瓜品種MAPK21基因、MAPK20基因和MAPK9基因相對(duì)表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于感病品種;3個(gè)處理后同一品種中MAPK21基因相對(duì)表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于MAPK20基因和MAPK9基因。

3 討論與結(jié)論

植物激素是植物在特定環(huán)境下細(xì)胞在代謝過程中產(chǎn)生的一類小分子物質(zhì)，主要有SA、MeJA、ACC和ABA等。近年來，大量研究表明植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中受到病原菌的侵害時(shí)植株會(huì)產(chǎn)生激素調(diào)控與生物脅迫信號(hào)傳導(dǎo)途徑互作，調(diào)控植物應(yīng)答生物脅迫的抗性，如：MeJA對(duì)甜瓜枯萎病[14]、人參銹病[15]、辣椒青枯病[16]等的抗性效果顯著;ABA提高植物對(duì)病原菌敏感性的主要原因尚不清楚，但是研究表明，增加ABA含量能夠提高植物對(duì)病菌的抗性，經(jīng)ABA處理的煙草能夠在一定程度上提高對(duì)病毒的抵抗能力[17];MT能夠降低由盤二孢屬引起的蘋果斑點(diǎn)病[18]。該試驗(yàn)利用MeJA、ABA和MT處理感病甜瓜‘哈密加格達(dá)和抗病甜瓜‘Edisto47并統(tǒng)計(jì)發(fā)病率，結(jié)果表明，不同外源信號(hào)分子處理對(duì)甜瓜白粉病的抗病效果不同，總體表現(xiàn)出一定的時(shí)間效應(yīng)，MeJA、ABA、MT具有提高甜瓜白粉病抗性的作用，都具有調(diào)控植物應(yīng)答生物脅迫抗性的潛能。

抗逆性和抗病性是植物與環(huán)境脅迫及病原菌相互適應(yīng)、相互選擇的結(jié)果。基因的表達(dá)除了受組織特異性影響外，還會(huì)隨著環(huán)境的生物或非生物脅迫而改變。MAPK是通過將胞外信號(hào)逐級(jí)放大并傳遞至細(xì)胞內(nèi)并且得到響應(yīng)的重要蛋白激酶，其在植物的生物和非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著極為重要的作用，不僅可以通過磷酸化修飾被激活，而且在mRNA水平上也可以被激活。研究發(fā)現(xiàn)，ClMPK7很有可能同時(shí)參與了西瓜組織受干旱、高溫及枯萎病原菌誘導(dǎo)的多條不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并在其中扮演關(guān)鍵角色[11];當(dāng)葡萄受到脅迫誘導(dǎo)后，VvMKK2，VvMKK3和VvMKK4表現(xiàn)出差異性上調(diào)，可能實(shí)現(xiàn)不同的功能并參與不同信號(hào)通路，VvMKK2，VvMKK4和VvMKK6這3 種基因在擬南芥中的過量表達(dá)提高了植株的抗鹽和干旱脅迫能力[19];AhMAPK13基因可能參與花生受干旱、低溫、NaCl等非生物脅迫及JA、GA、ET、SA等激素介導(dǎo)的抗逆信號(hào)轉(zhuǎn)到途徑[20]。為了更進(jìn)一步了解MeJA、ABA、MT調(diào)控甜瓜MAPK基因應(yīng)答白粉病菌抗性作用，該試驗(yàn)采用實(shí)時(shí)定量PCR方法，對(duì)甜瓜MAPK基因家族成員在激素脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明，甜瓜品種中MAPK 3個(gè)相關(guān)基因MAPK21、MAPK20、MAPK9在接種白粉病菌后基因都呈上調(diào)表達(dá)，但表達(dá)量出現(xiàn)差異，抗病甜瓜品種3個(gè)MAPK基因相對(duì)表達(dá)量高于感病甜瓜品種，MAPK21基因相對(duì)表達(dá)量高于MAPK20和MAPK9。3個(gè)MAPK基因?qū)eJA、ABA、MT 3個(gè)脅迫因子的重疊表達(dá)特性，說明這3個(gè)基因有可能不同程度的參與了多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)到途徑，在這些信號(hào)途徑中扮演著重要的角色，其調(diào)控作用機(jī)制還有待深入研究。

甜瓜白粉病是瓜類作物上廣泛發(fā)生的重要病害，抗白粉病基因的挖掘是目前研究的熱點(diǎn)，篩選甜瓜優(yōu)異抗病基因資源用于抗病新品種的培育，這樣有利于從根本上解決甜瓜白粉病病害的有效途徑。筆者主要分析了MeJA、ABA、MT 3個(gè)脅迫因子誘導(dǎo)抗病和感病甜瓜葉片中MAPK基因的表達(dá)模式，初步判斷其在甜瓜葉片中的表達(dá)模式，MAPK級(jí)聯(lián)途徑在植物的生物和非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著極為重要的作用，今后可以進(jìn)一步深入明確抗白粉病相關(guān)基因是如何通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控對(duì)白粉病的抗性及家族基因扮演的角色和它們之間蛋白互作的分子機(jī)制。

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