孫波 王興輝 吳勇 劉中陽 羅琳 曾健強(qiáng) 劉澤發(fā) 孫小武

摘 要： 為實(shí)現(xiàn)西瓜品種純度的室內(nèi)快速檢測(cè)，筆者對(duì)西瓜的真葉、子葉、種芽和種子進(jìn)行了DNA提取，比較了不同類型樣品提取DNA的質(zhì)量與濃度差異，并研究了從不同類型樣品中提取的DNA對(duì)于SSR-PCR的影響。結(jié)果表明，不同類型樣品中提取的DNA濃度與質(zhì)量的大小排序均為：真葉>子葉>種芽>種仁，其DNA濃度之間具有顯著性差異。將上述材料中提取的DNA作為模板進(jìn)行了SSR-PCR擴(kuò)增分析，發(fā)現(xiàn)以上4組DNA模板均能擴(kuò)增出清晰可見的目標(biāo)條帶，表明從種仁中可直接提取DNA進(jìn)行SSR分子標(biāo)記純度檢測(cè)。因此在室內(nèi)用SSR分子標(biāo)記檢測(cè)品種純度時(shí)可省略催芽育苗階段，從而提升檢測(cè)效率，節(jié)省時(shí)間。

關(guān)鍵詞： 西瓜; SSR標(biāo)記; 種子; DNA提取

Abstract： In order to achieve rapid indoor identification of variety purity， in this study， the DNAs from true leaf， cotyledon， seedlings and seed of watermelon were extracted respectively， and the quality and concentration of them were compared， their influence for SSR-PCR were researched. The results showed that the concentration and quality of the extracted DNA were ranked as follows： true leaf > cotyledon > seedlings > seed， and the DNA concentration was significantly different. The DNAs extracted from the above materials was used as templates for SSR-PCR analysis respectively. They can all achieved the target band， indicating that the DNA extracted from the seed can be also used for SSR markers. Therefore， in the purity identification of watermelon cultivar by using SSR method， the germination and seedling stage can be omited， and the efficiency can be improved greatly and much time will be saved.

SSR標(biāo)記技術(shù)在真核生物中具有普遍性[1]，且被廣泛應(yīng)用于作物DNA指紋圖譜的構(gòu)建、遺傳連鎖圖譜的繪制和基因定位等方面。該技術(shù)對(duì)品種的DNA質(zhì)量濃度要求較低，種屬特異性強(qiáng)，多態(tài)性豐富，而且可以鑒別純合子和雜合子，結(jié)果相對(duì)可靠，省時(shí)省力，應(yīng)用價(jià)值非常大。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在品種鑒定中被應(yīng)用次數(shù)最多的便是SSR標(biāo)記技術(shù)[2]。在西瓜品種純度檢測(cè)方面，SSR標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用也較為廣泛。張佩倫等[3]篩選出7對(duì)SSR引物對(duì)4份優(yōu)質(zhì)西瓜雜交種進(jìn)行了純度鑒定，劉子記等[4]則利用分布于西瓜不同染色體的SSR標(biāo)記鑒定了小果型西瓜‘美月的純度。上述研究者均是通過育苗提取西瓜葉片DNA來進(jìn)行純度鑒定。這也是目前大部分學(xué)者的普遍做法，即以西瓜真葉為材料提取DNA以滿足分子標(biāo)記的要求[5-7]，但西瓜從浸種催芽到第1片真葉展開需10 d左右，因此通過真葉提取DNA對(duì)于材料為西瓜種子的樣品來說程序比較繁瑣。所以，有必要對(duì)西瓜DNA的提取部位進(jìn)行探索，從而提高室內(nèi)品種純度檢測(cè)的效率。劉澤發(fā)等[8]認(rèn)為，西瓜的發(fā)芽根尖細(xì)胞內(nèi)脂肪和葉綠素等含量非常少，適合作為快速提取DNA的材料，從中提取的DNA適用于SRAP標(biāo)記，因此在進(jìn)行純度檢測(cè)時(shí)只需要將種子催芽即可，無需育苗，縮短了室內(nèi)檢測(cè)純度的時(shí)間。王吉明等[9]對(duì)不同類型的西瓜樣品材料提取的DNA進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)從西瓜種仁中提取的DNA可以順利進(jìn)行dCAPS擴(kuò)增和酶切，這為西瓜品種純度的室內(nèi)快速檢測(cè)提供了參考。在西瓜品種室內(nèi)的純度檢測(cè)中，西瓜種子是最直接也最容易獲得的材料，因此對(duì)種仁中提取的DNA是否適用于SSR標(biāo)記進(jìn)行探究具有重要意義。

筆者對(duì)西瓜的真葉、子葉、種芽、種仁進(jìn)行了DNA提取，研究了各樣品提取DNA的質(zhì)量濃度差異，并探究了各DNA對(duì)于SSR-PCR的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

‘雪峰黑媚娘有籽西瓜品種，由邵陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。試驗(yàn)于2018年1—3月在邵陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院生物中心實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 方法

1.2.1 材料收集 取3?！┓搴诿哪锓N子直接去殼后用滅菌鑷子將種仁取出分別放入離心管內(nèi)。另取9?！┓搴诿哪锓N子在50 ℃溫水中浸種3 h，置于30 ℃條件下催芽。出芽后將其中6粒進(jìn)行播種育苗，另外3粒繼續(xù)催芽，芽長(zhǎng)3 cm左右時(shí)[8]，用滅菌剪刀將種芽剪下放入離心管內(nèi)。播種的種子成苗后分別用滅菌剪刀剪下真葉和子葉放入離心管內(nèi)。種仁、種芽、子葉和真葉每種類型的材料各取3份。

1.2.2 DNA提取方法 DNA的提取采用天根生物公司的植物DNA提取試劑盒（貨號(hào)DP320）結(jié)合高通量組織研磨器進(jìn)行。

1.2.3 DNA質(zhì)量濃度測(cè)定 DNA的濃度及質(zhì)量通過微量核酸蛋白分析儀和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行測(cè)定，并利用DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

1.2.4 SSR-PCR擴(kuò)增 以不同類型材料的DNA為模板進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增，以比較各DNA對(duì)于SSR分子標(biāo)記擴(kuò)增的影響。引物選用國(guó)家蔬菜工程中心[10]發(fā)表的SSR核心引物BVWS02048，上游引物序列為5-TCTGTGTGGATGCAAATGGT-3，下游引物序列為5-GCTAATCGAGCCCAGTTACG-3，目標(biāo)片段長(zhǎng)度為249 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后置于凝膠成像儀內(nèi)觀察結(jié)果，比較各樣品提取的DNA擴(kuò)增效果。反應(yīng)體系：總體系[11]為20 μL，其中10×Taq Buffer 2 μL（Mg2+含量為15 mmol·L-1），2.5 mmol·L-1的dNTPS加1.6 μL，Taq酶含量為1 U，10 μmol·L-1的上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，加超純水補(bǔ)足至20 μL。擴(kuò)增程序：設(shè)置PCR儀的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸90 s，35次循環(huán)，72 ℃延伸5 min。10 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物利用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型西瓜樣品所提取DNA的濃度比較

由表1可知，以真葉為材料提取的DNA濃度最高，平均濃度為814.561 ng·μL-1，可能是由于真葉的細(xì)胞分裂最旺盛，因此DNA含量最高。其次為子葉和種芽，子葉的平均質(zhì)量濃度為526.493 ng·μL-1，種芽的平均質(zhì)量濃度為238.487 ng·μL-1。子葉的細(xì)胞分裂頻率小于真葉，DNA含量次之;種芽?jī)?nèi)可能含有較多的液泡和木質(zhì)化的導(dǎo)管，所以DNA含量相對(duì)較少。質(zhì)量濃度最低的是種仁，僅為118.177 ng·μL-1，其富含氨基酸和脂肪酸，所以DNA的提取濃度最低。西瓜真葉、子葉、種芽、種仁提取的DNA濃度差異顯著，種芽與種仁的DNA濃度之間差異未達(dá)到極顯著水平。

2.2 不同類型西瓜樣品所提DNA質(zhì)量的比較

由表2可知，從真葉、子葉、種芽提取DNA的OD260/280均在1.8～2.0之間，說明提取的DNA質(zhì)量較好，從種仁提取DNA的OD260/280均低于1.8，說明有蛋白質(zhì)等其他雜質(zhì)殘留。所有DNA樣品的OD260/230均大于2.0，說明從各材料中提取的DNA均沒有碳水化合物、多肽和苯酚等污染物。

由如圖1可以看出，從真葉、子葉、種芽所提取的DNA條帶清晰明亮，從種仁提取的DNA有拖尾現(xiàn)象，說明含有蛋白質(zhì)、酚類等雜質(zhì)，這可能是由于種仁中含有較多的脂肪酸和氨基酸等物質(zhì)影響了DNA的提取質(zhì)量[12]。條帶的亮度與DNA濃度呈正相關(guān)，亮度排序?yàn)檎嫒~>子葉>種芽>種仁，這與微量核酸蛋白分析儀的濃度測(cè)量結(jié)果一致。

2.3 不同西瓜樣品所提DNA對(duì)SSR-PCR擴(kuò)增效果的影響

由圖2可知，所有DNA模板經(jīng)擴(kuò)增后均在249 bp處出現(xiàn)了目標(biāo)條帶，以真葉、子葉的DNA為模板的PCR擴(kuò)增條帶較亮，讀取條帶非常直觀。以種芽DNA為模板的擴(kuò)增條帶清晰，效果較好。以種仁DNA為模板的擴(kuò)增條帶較暗，但并不影響條帶的讀取，且DNA中殘留的雜質(zhì)對(duì)SSR-PCR擴(kuò)增沒有明顯影響。說明從西瓜真葉、子葉、種芽、種仁提取的DNA均可用于SSR-PCR的擴(kuò)增。

3 討論與結(jié)論

目前利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)西瓜品種進(jìn)行純度檢測(cè)的方法已較為成熟[13-15]，這與傳統(tǒng)的田間純度檢測(cè)相比進(jìn)步巨大，而SSR分子標(biāo)記技術(shù)在品種鑒定中應(yīng)用廣泛[2]，因此很有必要對(duì)室內(nèi)SSR分子標(biāo)記純度的檢測(cè)效率進(jìn)行研究。DNA的質(zhì)量與濃度會(huì)影響后續(xù)分子生物學(xué)等研究的操作效果[16]。而SSR技術(shù)對(duì)樣品DNA質(zhì)量和濃度要求并不高，因此在對(duì)西瓜品種進(jìn)行室內(nèi)純度檢測(cè)時(shí)，如何提升DNA的提取效率從而縮短檢測(cè)時(shí)間對(duì)于種企按時(shí)銷售種子較為關(guān)鍵。國(guó)內(nèi)許多生物技術(shù)公司開發(fā)了直擴(kuò)試劑盒，將樣品置于裂解液中加熱幾分鐘，即可以裂解液為模板進(jìn)行擴(kuò)增，省去了DNA提取時(shí)磨樣等繁瑣步驟，但此試劑盒價(jià)格較貴，將其直接應(yīng)用至種企的純度鑒定中并不現(xiàn)實(shí)。北京市農(nóng)林科學(xué)院及一些生物檢測(cè)公司在種子純度鑒定方面取得了較大進(jìn)展，其通過第一代測(cè)序儀、KASP技術(shù)可對(duì)品種純度進(jìn)行快速準(zhǔn)確、高通量的檢測(cè)，但目前在國(guó)內(nèi)尚未推廣開來。

筆者對(duì)西瓜品種真葉、子葉、種芽及種仁做了DNA提取質(zhì)量的比較，探究了各類型樣品所提取的DNA的濃度和質(zhì)量差異。研究發(fā)現(xiàn)，在相同的提取方法下，從真葉中提取的DNA濃度最高，種仁中提取的DNA濃度最低且含有雜質(zhì)，這和王吉明等[9]研究結(jié)果一致。通過和以往的液氮研磨提取DNA相比較后發(fā)現(xiàn)，高通量組織研磨器提取的DNA濃度普遍偏低，可能是由于研磨儀內(nèi)小鋼珠通過擊打來破碎組織的效果沒有加液氮研磨破碎的效果好。對(duì)各DNA模板SSR-PCR擴(kuò)增后的效果進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)以西瓜真葉、子葉和種芽的DNA為模板時(shí)擴(kuò)出的條帶明亮清晰，無明顯差異，以種仁DNA為模板擴(kuò)出的條帶較暗，但是并不影響條帶的讀取。王吉明等[9]還對(duì)干燥真葉、新鮮真葉、種芽、下胚軸、子葉和種子所提取的的DNA進(jìn)行了dCAPS擴(kuò)增及酶切，發(fā)現(xiàn)所有樣品DNA的擴(kuò)增效果無明顯差異，可以滿足dCAPS酶切要求，說明從種仁中提取DNA基本可以滿足一般的分子生物學(xué)試驗(yàn)。因此，在利用SSR技術(shù)構(gòu)建DNA指紋圖譜或進(jìn)行純度鑒定時(shí)，如若樣品材料不多且時(shí)間充分，可以育苗通過真葉或者子葉提取的DNA為模板，時(shí)間緊張時(shí)也可催芽以提取種芽的DNA為模板，以便更好地觀察擴(kuò)增后條帶之間的差異。但是純度鑒定在種企或者檢測(cè)中心等單位的實(shí)際應(yīng)用中需要快速大批量提取樣品DNA，如采用SSR分子標(biāo)記來進(jìn)行檢測(cè)，則可以利用高通量自動(dòng)研磨儀直接對(duì)種子進(jìn)行研磨，研磨充分后利用排槍加提取液提取種仁DNA，這樣可大大減少工作量，提高工作效率，并且單人可完成所有過程。

參考文獻(xiàn)

[1] TAUTZ D，RENZ M.1984，Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes[J].Nucleic Acids Res，1984，12（10）：4127-4138.

[2] 王立新，常利芳，李宏博，等.小麥區(qū)試品系DUS測(cè)試的分子標(biāo)記[J].作物學(xué)報(bào)，2010，36（7）：1114-1125.

[3] 張佩倫，郭祿芹，胡倩梅，等.利用SSR標(biāo)記快速鑒定西瓜雜交種純度[J].中國(guó)瓜菜，2018，31（5）：16-19.

[4] 劉子記，詹園鳳，朱婕，等.利用SSR標(biāo)記鑒定西瓜雜交種純度的研究[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2016，37（9）：1714-1718.

[5] 周賢達(dá)，王鳳辰，周桂林，等.西瓜雜交種純度SSR分子鑒定技術(shù)研究[J].中國(guó)瓜菜，2012，25（5）：13-16.

[6] 高磊，趙勝杰，路緒強(qiáng)，等.利用SSR標(biāo)記對(duì)西瓜果肉硬度性狀的連鎖分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2016，17（5）：866-870.

[7] 羊杏平，劉廣，侯喜林，等. 西瓜核心種質(zhì)枯萎病抗性與SRAP分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2013，40（7）：1298-1308.

[8] 劉澤發(fā)，孫小武，董亞靜.SRAP標(biāo)記鑒定西瓜種子純度方法研究[J].中國(guó)瓜菜，2009，22（1）：5-8.

[9] 王吉明，尚建立，李娜，等.西瓜不同類型樣品的DNA提取研究[J].中國(guó)瓜菜，2016，29（11）：11-13.

[10] ZHANG H Y，WANG H，GUO S G，et al.Identification and validation of a core set of microsatellite markers for genetic diversity analysis in watermelon，Citrullus lanatus Thunb.Matsum.& Nakai[J].Euphytuca，2012，186（2）：329-342.

[11] 張海英，許勇.十大技術(shù)之一（一）西瓜資源與品種核酸指紋鑒定關(guān)鍵技術(shù)[J]. 中國(guó)瓜菜，2013，26（5）：63-65.

[12] 張玉秀，趙文明. 籽瓜種子營(yíng)養(yǎng)成分研究：Ⅱ籽瓜種子脂肪酸成分分析[J]. 中國(guó)西瓜甜瓜，1992，5（2）：18-19.

[13] 張佩倫. 西瓜雜交種純度快速鑒定及雜交制種技術(shù)的研究[D]. 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018.

[14] 孫波，鄒甜，王志偉，等. 利用SSR技術(shù)鑒定西瓜品種純度[J]. 中國(guó)瓜菜，2018，31（6）：16-19.

[15] 李超漢，劉莉，劉翔，等. 基于SSR標(biāo)記的5個(gè)西瓜新品種純度鑒定及特異性分析的研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2015，31（33）：177-185.

[16] 吳艷艷，代德艷，蔡春梅. 一種改良的大豆DNA提取方法[J]. 大豆科學(xué)，2015，34（1）：112-115.