郝云濤,珠 娜,劉欣然,毛瑞雪,劉 睿,康家偉,烏 蘭,胡佳妮,李 勇

(北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系,北京 100191)

人體免疫系統(tǒng)可識別和清除外來病原微生物及體內(nèi)的突變細胞、衰老死亡細胞或其它有害成分,以保持機體健康、避免各種疾病的發(fā)生[1]。但隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏加快,許多外界因素如工作壓力和心理壓力加大、空氣污染及重金屬暴露、肥胖等使人類免疫系統(tǒng)功能降低,各種疾病的發(fā)病率呈增長趨勢[2-6]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)及細胞分子生物學(xué)的發(fā)展,人們意識到機體免疫系統(tǒng)缺陷及功能失調(diào)與很多疾病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。因此,從調(diào)節(jié)免疫功能入手,防治機體疾病已得到廣泛重視。

免疫調(diào)節(jié)劑可調(diào)節(jié)機體免疫功能,對免疫功能低下、繼發(fā)性免疫功能缺陷和某些腫瘤等疾病具有防治作用;目前國內(nèi)外關(guān)于免疫調(diào)節(jié)劑的研究主要集中在中藥、化學(xué)性藥物及生物制劑,近年來從食物中提取的生物活性肽對免疫功能的調(diào)節(jié)作用成為研究熱點[7-8]。據(jù)文獻報道,人參低聚肽、海參寡肽、烏雞肽等均具有免疫調(diào)節(jié)的作用[9-11]。菠蘿蜜引進我國已有上千年歷史,營養(yǎng)成分豐富,具有多種保健功效[12-14]。有研究指出,菠蘿蜜果肉及種子蛋白含量豐富,遠高于其他常見水果[15-16]。菠蘿蜜低聚肽(jackfruit oligopeptides,JOPs)是利用生物酶解技術(shù)從菠蘿蜜果肉及種子中制取得到的小分子生物活性肽,主要成分是活性小分子寡肽,具有高于蛋白質(zhì)和多肽的生物活性[17]。但目前未見有關(guān)JOPs功能的研究報道,JOPs在免疫調(diào)節(jié)功能領(lǐng)域的研究更是處于空白。本研究通過JOPs長期干預(yù)BALB/c小鼠,系統(tǒng)探究了JOPs的免疫調(diào)節(jié)作用,為其作為增強機體免疫功能的新型保健食品的開發(fā)及應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

160只SPF級BALB/c雌性健康小鼠 6～8周,體重18～22 g,由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供,許可證號:SYXK(京)2016-0041;JOPs 淡黃色固體粉末,主要成分為分子量<1000 Da的寡肽,具體分子量分布為71～110 Da(7.4%)、150～379 Da(80%)、515～1 113 Da(12.6%),海南盛美諾生物技術(shù)有限公司;刀豆蛋白A(ConA) 西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;胎牛血清 索萊寶公司;RPMI1640培養(yǎng)基 Hyclone公司;小鼠淋巴瘤細胞(YAC-1細胞) 北京愛特蒙科技有限公司;噻唑藍(MTT) 西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;姬姆薩染液 北京寶瑞杰科技有限公司;印度墨水 北京寶瑞杰科技有限公司;雞紅細胞、綿羊紅細胞(SRBC) 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心。

Eppendorf高速冷凍離心機(Eppendorf AG)、Bio-Rad550型酶標儀 美國伯樂公司;Sanyo二氧化碳培養(yǎng)箱 日本三洋公司;CK40-SL倒置顯微鏡 OCI公司;FACSCalibur流式細胞儀 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部中心實驗樓提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物 160只SPF級BALB/c雌性健康小鼠分籠飼養(yǎng),4只/籠,自由飲水、飲食,飼喂普通飼料。小鼠飼養(yǎng)于動物房屏障環(huán)境,溫度24～26 ℃,相對濕度50%～60%,保持12 h/12 h光暗周期節(jié)律室內(nèi)照明,照明時間7:00～19:00。

1.2.2 實驗動物分組與用藥 160只BALB/c小鼠,適應(yīng)1周后依據(jù)體重隨機分成5組:空白對照組、乳清蛋白組(0.40 g/kg·bw),及低、中、高3個JOPs干預(yù)組(0.20、0.40、0.80 g/kg·bw),各組再依據(jù)體重隨機分成4個亞組(8只/組)。灌胃干預(yù),空白對照組灌蒸餾水,其余各組灌規(guī)定濃度的乳清蛋白、JOPs水溶液。灌胃1次/d,連續(xù)30 d,干預(yù)結(jié)束行小鼠碳廓清實驗、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實驗、血清溶血素水平測定、抗體生成細胞檢測、腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗、小鼠體重及免疫器官相對重量檢測、ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗、NK細胞活性檢測及流式細胞術(shù)檢測脾臟T淋巴細胞亞群比例。

1.2.3 小鼠體重及免疫器官相對重量檢測 取同一亞組小鼠共40只,稱重后頸椎脫臼處死小鼠,分離胸腺及肝臟并稱重,計算臟器指數(shù)[9]。

1.2.4 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實驗、血清溶血素水平測定、抗體生成細胞檢測 取同一亞組小鼠共40只,實驗第26 d腹腔注射2%(v/v)SRBC 0.2 mL免疫小鼠,4 d后相同時間測量小鼠左后足跖部厚度,然后同一部位皮下注射20%(v/v)SRBC 20 μL,24 h后測量同一部位足跖部厚度,均測量3次,取平均值,觀察足跖增厚度[18]。摘眼球法采血,放置1 h后離心收集血清,進行血清溶血素水平測定[9]。頸椎脫臼處死小鼠,剖取脾臟,進行抗體生成細胞檢測(Jerne改良玻片法)[19]。

1.2.6 腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗 取同一亞組小鼠共40只,均腹腔注射20%(v/v)雞紅細胞1 mL。30 min后,頸椎脫臼處死小鼠,腹腔注射2 mL生理鹽水,輕揉腹部20次后剪開腹壁,移液槍吸取1 mL腹腔洗液,平均滴加至載玻片上2個瓊脂圈內(nèi),放于內(nèi)墊溫濕紗布的搪瓷盤內(nèi),移至37 ℃ CO2培養(yǎng)箱溫育30 min。之后用生理鹽水漂洗,洗去未貼片的細胞。晾干后,以丙酮甲醇(1∶1)溶液進行固定,然后4%(v/v)Giemsa-PBS染色30 min,再用雙蒸水進行漂洗晾干。油鏡下觀察雞紅細胞被巨噬細胞吞噬情況,每張片均計數(shù)100個巨噬細胞,計算吞噬率及吞噬指數(shù)[9]。

1.2.7 小鼠ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗與NK細胞活性檢測 取同一亞組小鼠共40只,稱重后頸椎脫臼處死小鼠,分離胸腺及肝臟并稱重,計算臟器指數(shù);無菌條件下取脾,于400目篩網(wǎng)上輕輕研磨,適量Hank’s液過濾,用Hank’s液洗2次(每次1000 r/min離心10 min)。再用RPMI 1640完全培養(yǎng)液1 mL懸浮細胞,1%冰醋酸稀釋并計數(shù)。RPMI1640完全培養(yǎng)液將細胞濃度調(diào)至2×107個/mL,采用LDH法進行NK細胞活性測定;細胞濃度調(diào)至3×106個/mL,采用MTT法檢測脾淋巴細胞增殖能力[20]。

1.2.8 流式細胞術(shù)檢測脾臟T淋巴細胞亞群比例 取同一亞組共40只小鼠脾臟,制備1×106個/mL的脾細胞懸液(方法同1.2.6)。各小鼠編2支對應(yīng)試管,加細胞懸液100 μL/管,然后分別加入不同熒光素標記的CD3ε、CD4、CD25、CD8a抗小鼠單克隆抗體,并以各單克隆抗體的同型對照作陰性對照,消除因抗體非特異性結(jié)合至細胞表面所產(chǎn)生的背景。室溫避光孵育15～20 min。每管加800 μL Cell staining buffer細胞染色緩沖液(cell staining buffer)洗滌2次,加入250 μL cell staining buffer重懸細胞,用BD FACSCalibur流式細胞儀檢測CD3+T細胞及CD4+、CD8+、CD4+CD25+T細胞亞群百分比,以未加抗體的對照管進行空白定標,各管收集1×105個細胞,使用BD CellQuest軟件包收集并分析數(shù)據(jù)[10]。

1.3 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果與分析

2.1 JOPs對小鼠體重及免疫器官相對重量的影響

各組間初始體重、終末體重均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);JOPs中、高劑量組小鼠脾臟指數(shù)顯著大于空白對照組(P<0.05),并且中劑量組小鼠脾臟指數(shù)顯著大于乳清蛋白組(P<0.05);各組小鼠胸腺指數(shù)無顯著差異(P>0.05),見表1。

表1 JOPs對小鼠體重和免疫器官相對重量的影響Table 1 Effect of JOPs on body weight and relative weight of immune organs in mice

2.2 JOPs對小鼠細胞免疫功能的影響

與空白對照組及乳清蛋白組比較,JOPs中、高劑量組小鼠反映脾淋巴細胞增殖能力的血清光密度差值,及足跖增厚度均顯著提高(P<0.05);而JOPs低劑量組與空白對照組及乳清蛋白組相比,小鼠血清光密度差值及足跖增厚度無顯著差異(P>0.05),見表2。

表2 JOPs對小鼠細胞免疫功能的影響Table 2 Effect of JOPs on cellular immune function in mice

2.3 JOPs對小鼠體液免疫功能的影響

JOPs中、高劑量組小鼠溶血空斑數(shù)顯著高于空白對照組及乳清蛋白組(P<0.05)。JOPs高劑量組小鼠血清溶血素水平顯著高于空白對照組(P<0.05),且JOPs低、高劑量組小鼠血清溶血素水平顯著高于乳清蛋白組(P<0.05),見表3。

表3 JOPs對小鼠體液免疫功能的影響Table 3 Effect of JOPs on humoral immune function in mice

2.4 JOPs對小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能的影響

相對于空白對照組,JOPs各劑量組小鼠碳廓清吞噬指數(shù)a、巨噬細胞吞噬指數(shù)和吞噬率(P<0.05)均顯著提高;相對于乳清蛋白組,JOPs中、高劑量組小鼠碳廓清吞噬指數(shù)a、巨噬細胞吞噬率及吞噬指數(shù)顯著提高(P<0.05),見表4。

表4 JOPs對小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能的影響Table 4 Effect of JOPs on phagocytosis of monocyte-macrophages in mice

2.5 JOPs對小鼠NK細胞活性的影響

相比空白對照組與乳清蛋白組,JOPs 中、高劑量組小鼠NK細胞活性均顯著升高(P<0.05);而JOPs低劑量組與空白對照組及乳清蛋白組相比,小鼠NK細胞活性差異不顯著(P>0.05),見表5。

表5 JOPs對小鼠NK細胞活性的影響Table 5 Effect of JOPs on the activity of NK cells in mice

2.6 JOPs對小鼠脾臟T淋巴細胞亞群的影響

JOPs高劑量組小鼠脾臟CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞亞群比例與CD4+CD25+/CD4+T細胞比值顯著高于空白對照組及乳清蛋白組(P<0.05);此外,JOPs低、高劑量組小鼠脾臟CD4+/CD8+比值顯著高于乳清蛋白組(P<0.05);相比空白對照組,JOPs低劑量組小鼠脾臟CD4+/CD8+比值顯著增高(P<0.05),JOPs高劑量組小鼠脾臟CD4+/CD8+比值有增高的趨勢(P=0.062),見表6。

表6 JOPs對小鼠脾臟T淋巴細胞亞群的影響Table 6 Effect of JOPs on T lymphocyte subsets of spleen in mice

3 討論

機體免疫系統(tǒng)的功能分為適應(yīng)性免疫與固有免疫,其中適應(yīng)性免疫包括細胞免疫及體液免疫,固有免疫包括單核-巨噬細胞、NK細胞的作用。T淋巴細胞在機體免疫系統(tǒng)中起著極為重要的作用,它與某些特異性抗原或細胞相互接觸時,發(fā)揮免疫功能,在機體的固有免疫及適應(yīng)性免疫中均具有重要作用[21]。ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗采用ConA誘導(dǎo)T淋巴細胞,使其發(fā)生母細胞增殖反應(yīng),增殖細胞中線粒體水解酶將MTT分解成藍紫色結(jié)晶,通過檢測OD值變化,間接反映T淋巴細胞增殖能力;DTH實驗通過二次綿羊紅細胞干預(yù)24 h后小鼠足跖部增厚程度反映T淋巴細胞反應(yīng)程度。實驗結(jié)果顯示JOPs干預(yù)對小鼠體重變化及胸腺指數(shù)無顯著性影響(P>0.05);JOPs中、高劑量組小鼠脾臟指數(shù)顯著高于空白對照組,且中劑量組脾臟指數(shù)顯著高于乳清蛋白組(P<0.05),提示JOPs對增加小鼠脾臟指數(shù)具有一定作用。相比空白對照組及乳清蛋白組,JOPs中、高劑量干預(yù)組小鼠ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細胞增殖能力與遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)能力顯著增高(P<0.05),表明JOPs可以促進小鼠細胞免疫功能,與Yang等[22]的研究結(jié)果相似。

抗體是B淋巴細胞經(jīng)抗原刺激增殖分化成漿細胞后,合成的能夠與對應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白,主要分布于血清或體內(nèi)外分泌物中,在體液免疫中發(fā)揮重要作用,是衡量機體體液免疫功能的重要指標[23-24]?？贵w生成細胞檢測采用SRBC免疫小鼠,在補體參與下,分泌抗體的脾細胞將周圍SRBC溶解,出現(xiàn)肉眼可見空斑,空斑數(shù)即等同抗體生成細胞數(shù);血清溶血素檢測利用SRBC免疫后小鼠血清中出現(xiàn)的溶血素(SRBC抗體),在補體參與下使SRBC發(fā)生溶血反應(yīng)釋放血紅蛋白,通過檢測血紅蛋白含量間接反映溶血素水平。與HE等[10]的研究結(jié)果類似,本實驗中JOPs 中、高劑量組小鼠的抗體生成細胞數(shù)顯著高于空白對照與乳清蛋白組;JOPs高劑量組小鼠血清溶血素水平顯著高于空白對照組,且JOPs低、高劑量組血清溶血素水平明顯高于乳清蛋白組(P<0.05)。由此可推斷,JOPs能夠明顯增強小鼠體液免疫功能。

單核-巨噬細胞是固有免疫的重要組成部分,是炎性反應(yīng)中主要的調(diào)節(jié)細胞,還對適應(yīng)性免疫反應(yīng)起關(guān)鍵性作用[25]。小鼠碳廓清實驗利用體內(nèi)碳顆粒清除速率和血碳濃度,在一定范圍內(nèi)呈指函數(shù)關(guān)系,校正肝脾重量的影響,通過吞噬指數(shù)a反映機體單核-巨噬細胞吞噬能力;腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗利用機體內(nèi)腹腔巨噬細胞能直接吞噬雞紅細胞的特性,根據(jù)顯微鏡下觀察到的雞紅細胞吞噬情況計算吞噬率及吞噬指數(shù),推斷單核-巨噬細胞的吞噬功能。本研究發(fā)現(xiàn),相對于空白對照組,JOPs各劑量干預(yù)組小鼠碳廓清能力、腹腔巨噬細胞吞噬率及吞噬指數(shù)顯著增高,且JOPs中、高劑量組小鼠碳廓清吞噬指數(shù)a、巨噬細胞吞噬率與吞噬指數(shù)顯著高于乳清蛋白組(P<0.05),表明JOPs可明顯提高小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能,與朱振平等[26]的研究結(jié)果類似。NK細胞是有別于T細胞與B細胞的一類淋巴細胞,它可直接殺傷靶細胞,在免疫監(jiān)視、抗腫瘤和抗感染的早期過程中起著重要作用[27]。NK細胞活性檢測利用YAC-1細胞被NK細胞殺傷后釋放的LDH使乳酸鋰脫氫,進而使NAD還原為NADH,后者經(jīng)遞氫體使碘硝基氯化四氮唑(INT)被還原為紫紅色甲臜類化合物,通過比色測定OD值間接反映NK細胞活性。本研究表明,對比空白對照組及乳清蛋白組,JOPs 中、高劑量組均具有較高的NK細胞活性,說明JOPs可以增強小鼠NK細胞活性。

細胞免疫中最為重要的T淋巴細胞包含多種功能各異的T淋巴細胞亞群,共同發(fā)揮免疫調(diào)控作用,其中CD3+細胞代表成熟T淋巴細胞,是細胞免疫中主要的活性細胞,它按CD表型又分Th細胞(CD4+輔助/誘導(dǎo)性T細胞)與Tc細胞(CD8+抑制性/細胞毒T細胞)。CD4+T細胞能夠協(xié)助B細胞分泌抗體及調(diào)節(jié)其它T細胞的免疫應(yīng)答,CD8+T細胞常表現(xiàn)為細胞毒活性及免疫抑制性,是主要的細胞毒效應(yīng)細胞;CD4+T細胞與CD8+T細胞數(shù)量和比值變化能夠反映機體免疫功能狀態(tài),CD4+T細胞數(shù)量降低、CD8+T細胞數(shù)量增加、CD4+/CD8+比值降低表明機體處于免疫抑制狀態(tài),臨床上預(yù)示著疾病惡化[28]。CD4+CD25+T細胞可高表達IL-2受體的α鏈(CD25分子)和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3,抑制自身反應(yīng)性T細胞所介導(dǎo)的病理性免疫應(yīng)答[1]。本研究JOPs高劑量干預(yù)組小鼠脾臟CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞亞群比例,及CD4+CD25+/CD4+T細胞比值均高于空白對照組及乳清蛋白組,JOPs低、高劑量干預(yù)組小鼠脾臟CD4+/CD8+比值顯著高于空白對照組及乳清蛋白組或有高于的趨勢(P<0.05)。CD4+T細胞可活化為Th細胞,其中Th1細胞可分泌IFN-γ、TNF、IL-2、GM-CSF等,發(fā)揮細胞免疫效應(yīng),并激活巨噬細胞、NK細胞;Th2細胞分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等,介導(dǎo)體液免疫。因此,可推斷JOPs增強小鼠細胞與體液免疫功能的可能機制,即JOPs提高CD3+T細胞、CD4+T細胞百分比及CD4+/CD8+比值,Th1、Th2細胞增加,進而增大相應(yīng)細胞因子的釋放量,增強細胞及體液免疫功能、單核-巨噬細胞吞噬功能與NK細胞活性。此外JOPs增強小鼠免疫功能的作用優(yōu)于乳清蛋白,表明其功效并非單純由小鼠蛋白質(zhì)攝入增加所引起。本研究為JOPs作為一種有效增強機體免疫功能的新型功能性保健食品及藥品的開發(fā)與應(yīng)用提供了實驗依據(jù),但其具體作用機制仍需進一步的實驗探究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明長期服用JOPs可顯著增強機體細胞免疫、體液免疫、單核-巨噬細胞吞噬功能及NK細胞活性(P<0.05),機制可能與其提高CD3+T細胞、CD4+T細胞百分比及CD4+/CD8+比值有關(guān)。本研究為JOPs在增強機體免疫功能方面的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù),但其具體作用機制仍需進一步的實驗去探究和驗證。