張滿　胡旭東　黃愷　陶艷艷　彭淵　劉成海

摘要：目的??觀察扶正化瘀方對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的M1型RAW264.7巨噬細(xì)胞一氧化氮合酶（iNOS）基因和一氧化氮（NO）分子過表達(dá)的影響，探討其可能的抗炎機(jī)制。方法??采用LPS刺激小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞，建立M1型巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞模型，分別給予扶正化瘀方50、100、200?μg/mL和10?nmol/L?JNK蛋白抑制劑SP600125進(jìn)行孵育。Griess法檢測(cè)炎癥介質(zhì)NO含量，RT-PCR檢測(cè)炎癥因子白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和iNOS基因表達(dá)，Western?blot檢測(cè)iNOS蛋白表達(dá)和MAPK信號(hào)通路中JNK、p38、ERK蛋白的磷酸化水平。結(jié)果??與LPS比較，扶正化瘀方和SP600125均顯著降低巨噬細(xì)胞中NO分泌（P<0.01）和iNOS蛋白表達(dá)（P<0.01），降低MAPK信號(hào)通路JNK蛋白的磷酸化水平（P<0.05，P<0.01）;扶正化瘀方對(duì)炎癥因子IL-6、TNF-α的基因表達(dá)及MAPK信號(hào)通路ERK、p38蛋白的磷酸化水平無明顯影響。結(jié)論??扶正化瘀方可能通過抑制JNK蛋白的磷酸化而抑制iNOS基因過表達(dá)，最終減少NO的生成，從而抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞M1型極化，發(fā)揮抗炎作用。

關(guān)鍵詞：扶正化瘀方;巨噬細(xì)胞;一氧化氮;一氧化氮合酶;MAPK信號(hào)通路;JNK信號(hào)通路

中圖分類號(hào)：R285.5????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A????文章編號(hào)：1005-5304（2020）03-0043-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201909314

Effects?of?Fuzheng?Huayu?Prescription?on?LPS-induced?Inflammatory?M1?Polarization?of?RAW264.7?Macrophages?Through?JNK?Pathway

ZHANG?Man1，?HU?Xudong2，?HUANG?Kai1，?TAO?Yanyan1，?PENG?Yuan1，?LIU?Chenghai1，3，4

1.?Institute?of?Liver?Diseases，?Shuguang?Hospital?Affiliated?to?Shanghai?University?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Shanghai?201203，?China;?2.?School?of?Basic?Medical?Sciences，?Shanghai?University?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Shanghai?201203，?China;?3.?Key?Laboratory?of?Liver?and?Kidney?Diseases?of?Shanghai?University?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Ministry?of?Education，?Shanghai?201203，?China;?4.?Shanghai?Key?Laboratory?of?Clinical?Chinese?Medicine，?Shanghai?201203，?China

Abstract：?Objective?To?explore?the?effects?of?Fuzheng?Huayu?Prescription?on?iNOS?gene?overexpression?and?NO?overproduction?in?M1?polarized?RAW264.7?macrophages?induced?by?lipopolysaccharide?（LPS）;?To?discuss?its?possible?anti-inflammatory?mechanism.?Methods?LPS?was?used?to?stimulate?mouse?RAW264.7?macrophages?to?establish?an?inflammatory?M1?macrophage?model，?and?Fuzheng?Huayu?Prescription?（50，?100，?200?μg/mL）?and?10?nmol/L?JNK?inhibitor?SP600125?were?incubated?respectively.?Inflammatory?mediator?NO?production?was?measured?by?Griess?method.?The?mRNA?expressions?of?inflammatory?cytokines?IL-6，?TNF-α?and?iNOS?were?detected?by?Real-time?RT-PCR.?iNOS?protein?expression?and?the?phosphorylation?levels?of?key?proteins?in?MAPK?signaling?pathway，?namely?p-JNK，?p-p38?and?p-ERK?were?detected?by?Western?blot.?Results?Compared?with?LPS，?Fuzheng?Huayu?Prescription?and?SP600125?could?significantly?reduce?the?overproduction?of?NO?（P<0.01），?the?overexpression?of

iNOS?protein?（P<0.01）?and?the?phosphorylation?levels?of?JNK?protein?（P<0.05，?P<0.01）?in?MAPK?signaling?pathway?in?macrophages.?Fuzheng?Huayu?Prescription?had?no?significant?effect?on?the?mRNA?expressions?of?inflammatory?cytokines?IL-6?and?TNF-α?in?LPS-induced?macrophages，?and?the?phosphorylation?levels?of?ERK?and?p38?proteins?in?MAPK?signaling?pathway.?Conclusion?Fuzheng?Huayu?Prescription?exerts?its?anti-inflammatory-M1?-?polarization?effect?on?RAW264.7?macrophages?through?inhibiting?iNOS?gene?overexpression?and?NO?overproduction?by?repressing?JNK?phosphorylation.

Keywords：?Fuzheng?Huayu?Prescription;?macrophage;?NO;?iNOS;?MAPK?signaling?pathway;?JNK?signaling?pathway

慢性肝病進(jìn)展中，肝臟炎癥（inflammation）→纖維化（fibrosis）→癌癥（cancer）所構(gòu)成的IFC軸線越來越被人們重視[1]，肝內(nèi)M1型巨噬細(xì)胞炎性極化是肝纖維化發(fā)生的始動(dòng)因素和肝纖維化進(jìn)展的促進(jìn)要素。因此，抑制肝臟中肝內(nèi)M1型巨噬細(xì)胞炎性極化，從而減輕肝臟炎癥損傷，是肝纖維化乃至肝癌防治中的重要目標(biāo)。扶正化瘀方由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病研究所研制，臨床廣泛用于抗肝纖維化。研究表明，扶正化瘀方治療慢性乙型肝炎肝纖維化6個(gè)月后，在逆轉(zhuǎn)肝纖維化的同時(shí)明顯改善肝組織炎癥[2]，但其抗炎分子機(jī)制尚未闡明。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，扶正化瘀方能顯著抑制M1型巨噬細(xì)胞中炎癥介質(zhì)一氧化氮（NO）生成。在M1型巨噬細(xì)胞中，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）催化L-精氨酸分解產(chǎn)生NO[3]，而MAPK信號(hào)通路則是調(diào)控iNOS基因表達(dá)的重要信號(hào)通路[4]。本研究擬探討扶正化瘀方通過調(diào)控MAPK信號(hào)通路減少NO生成從而抑制M1型巨噬細(xì)胞炎性極化的可能抗炎機(jī)制。

1??實(shí)驗(yàn)材料

1.1??藥物

扶正化瘀方浸膏粉，上海黃海制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)180206。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：褐色粉末，味苦、澀;每克含發(fā)酵草菌粉以腺苷不少于1000?g/批，丹參以丹參素鈉不少于3000?g/批，丹酚酸B不少于5000?g/批，水分少于8.0%，需氧菌總數(shù)不超過1000?cfu/g，霉菌、酵母菌總數(shù)不超過100?cfu，大腸埃希菌不得檢出。

1.2??細(xì)胞株及主要試劑

RAW264.7巨噬細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)（編號(hào)SCSP-5036）。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），鏈霉素、青霉素均（ScienCell公司），CCK8細(xì)胞試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司），二甲基亞砜（DMSO，Corning公司），脂多糖（LPS，美國(guó)Sigma公司），JNK抑制劑SP600125，（MCE公司），總RNA提取試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)RR047A，TaKaRa公司），擴(kuò)增試劑盒（貨號(hào)RR420A，TaKaRa公司），BCA蛋白定量試劑盒（貨號(hào)23227，Pierce化學(xué)公司），iNOS抗體（Abcam公司），p-JNK、p-ERK和p-p38抗體（美國(guó)CST公司），山羊抗鼠和山羊抗兔的熒光二抗（LI-COR公司），GAPDH抗體（Proteintech公司）。

1.3??儀器

Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)，美國(guó)LI-COR公司;垂直板電泳槽、半干電轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司;ABIViiA7型熒光定量PCR儀，美國(guó)ABI公司;多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Tek公司。

2??實(shí)驗(yàn)方法

2.1??細(xì)胞培養(yǎng)

將RAW264.7細(xì)胞以合適的濃度接種于10?cm培養(yǎng)皿中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要接種不同數(shù)量細(xì)胞于6、96孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于含10%FBS?DMEM培養(yǎng)基，37?℃、5%O2、95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代時(shí)吸走部分培養(yǎng)液，留下3～4?mL培養(yǎng)液，用無菌細(xì)胞刮板刮拭培養(yǎng)皿表面，將細(xì)胞刮落，吹打后接種到新的裝有新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中進(jìn)行傳代。

2.2??CCK8法檢測(cè)扶正化瘀方細(xì)胞毒性

RAW264.7細(xì)胞接種至96孔板，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為5×104個(gè)/孔，細(xì)胞種板后，分別加入2、5、50、100、200、400、1000?μg/mL不同濃度扶正化瘀方，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，將接種好的細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中孵育24?h后棄去上清液，每孔加100?μL?10%?CCK8繼續(xù)培養(yǎng)2?h，在波長(zhǎng)450?nm/630?nm處測(cè)吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率，評(píng)價(jià)扶正化瘀方的細(xì)胞毒性。

2.3??細(xì)胞分組

體外培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要設(shè)計(jì)正常組、正常+扶正化瘀方組、LPS組、LPS+扶正化瘀方（50、100、200?μg/mL）組和JNK抑制劑組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞種板后，LPS組和LPS+扶正化瘀方組給予1?μg/mL?LPS刺激，JNK抑制劑組給予10?nmol/L?SP600125刺激，隨后LPS+扶正化瘀方組給予不同濃度扶正化瘀方（50、100、200?μg/mL）孵育24?h。收集培養(yǎng)上清液和細(xì)胞備用。

2.4??Griess法檢測(cè)一氧化氮生成

0.1%N-（1-萘基）乙二胺鹽酸鹽（以ddH2O溶解）和1%磺胺（以5%H3PO4溶解）按1∶1混合即為Griess試劑，并以NaNO2制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。100?μL?Griess試劑與100?μL細(xì)胞上清混合，10?min后檢測(cè)OD540?nm吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合公式計(jì)算樣本中NO濃度。

2.5??RT-PCR實(shí)驗(yàn)

收集細(xì)胞，加入Trizol裂解細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增試劑盒合成cDNA和cDNA擴(kuò)增。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析定量。以β-actin為內(nèi)參，檢測(cè)巨噬細(xì)胞中白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和iNOS基因的表達(dá)。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

2.6??Western?blot實(shí)驗(yàn)

收集細(xì)胞后，加入含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑RIPA裂解液冰上裂解30?min，4?℃、12?000×g離心15?min，收取上清液。BCA法蛋白定量后進(jìn)行蛋白變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。分別加入1∶250稀釋的iNOS抗體，1∶1000稀釋的p-JNK、p-ERK和p-p38抗體，4?℃孵育一抗過夜。熒光標(biāo)記的二抗室溫避光孵育60?min，Odyssey紅外成像系統(tǒng)掃描讀取目的條帶。以GAPDH為內(nèi)參，檢測(cè)樣本中iNOS、p-JNK、p-ERK、p-p38的蛋白含量。

3??統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x（—）±s表示，多樣本均數(shù)間比較采用ANOVA檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4??結(jié)果

4.1??扶正化瘀方對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞抑制率的影響

與正常組比較，扶正化瘀方在1000??g/mL濃度時(shí)對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞有顯著抑制作用，而在25～400??g/mL濃度范圍對(duì)RAW264.7細(xì)胞無明顯毒性。結(jié)果見圖1。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用扶正化瘀方50、100、200?μg/mL作為工作濃度。

4.2??扶正化瘀方對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞一氧化氮合酶、白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α基因表達(dá)的影響

與正常組比較，LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞中炎癥相關(guān)因子iNOS、IL-6和TNF-α基因表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與LPS組比較，扶正化瘀方各濃度組IL-6、TNF-α基因表達(dá)無明顯變化，但能明顯下調(diào)iNOS基因的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），尤以扶正化瘀方200?μg/mL濃度時(shí)最為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見圖2。

4.3??扶正化瘀方對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞一氧化氮合酶蛋白表達(dá)和一氧化氮生成的影響

與LPS組比較，扶正化瘀方在200?μg/mL濃度時(shí)能顯著抑制iNOS蛋白表達(dá)（P<0.01）;同時(shí)呈劑量依賴性減少細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的NO生成（P<0.01）。結(jié)果見圖3。

4.4??扶正化瘀方對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞MAPK信號(hào)通路活化的影響

與正常組比較，LPS刺激RAW264.7細(xì)胞可促進(jìn)MAPK信號(hào)通路中p38、JNK、ERK蛋白的磷酸化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與LPS組比較，扶正化瘀方能顯著抑制JNK蛋白磷酸化（P<0.05），對(duì)p38、ERK蛋白磷酸化僅有抑制趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見圖4。

4.5??JNK蛋白抑制劑SP600125對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞一氧化氮合酶蛋白表達(dá)和一氧化氮生成的影響

與LPS組比較，JNK蛋白抑制劑SP600125顯著下調(diào)巨噬細(xì)胞JNK蛋白的磷酸化（P<0.05，P<0.01），同時(shí)降低巨噬細(xì)胞iNOS蛋白的表達(dá)（P<0.05）和NO的生成（P<0.01）。結(jié)果見圖5。

5??討論

扶正化瘀方由丹參、桃仁、絞股藍(lán)、松花粉、冬蟲夏草菌絲和五味子組成，廣泛應(yīng)用于治療肝纖維化和肝硬化[5]。在肝纖維化和肝硬化進(jìn)程中，慢性肝臟炎癥是激發(fā)肝纖維化的關(guān)鍵先決條件[6]。肝臟發(fā)生炎癥時(shí)，肝內(nèi)巨噬細(xì)胞被各種體內(nèi)外刺激因素激活，主要以M1型功能狀態(tài)存在，通過促炎介質(zhì)進(jìn)一步加重肝細(xì)胞的損傷和炎癥，同時(shí)通過分泌各種纖維生成介質(zhì)激活肝星狀細(xì)胞（HSCs），從而促進(jìn)肝纖維進(jìn)展[7-8]。因此，通過抑制肝內(nèi)巨噬細(xì)胞M1型極化從而減輕肝臟炎癥損傷、減少HSCs細(xì)胞活化，從源頭阻斷IFC軸線病理進(jìn)程。本課題既往研究表明，扶正化瘀方能抑制從CCl4損傷大鼠分離培養(yǎng)的肝Kupffer巨噬細(xì)胞中促纖維化因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β和血小板衍生因子的表達(dá)[9]，還可通過調(diào)節(jié)Kupffer巨噬細(xì)胞旁分泌從而抑制HSCs的活化[10]。

巨噬細(xì)胞是一種機(jī)體內(nèi)廣泛分布的固有免疫細(xì)胞，在炎癥和免疫過程中發(fā)揮十分重要的作用[11]。巨噬細(xì)胞可根據(jù)表型及功能變化分為促炎的M1型和抑炎的M2型[12-13]。巨噬細(xì)胞受LPS刺激后向促炎的M1型極化，細(xì)胞內(nèi)iNOS基因表達(dá)增強(qiáng)，iNOS大量增加，從而催化精氨酸分解生成過量NO。過量NO與O2-生成的過氧化亞硝酸鹽通過強(qiáng)烈過氧化作用導(dǎo)致細(xì)胞死亡、廣泛的組織損傷和病理變化。因此治療NO參與的炎癥性疾病，iNOS基因表達(dá)和活性調(diào)控是最直接和關(guān)鍵的靶點(diǎn)。本研究表明，與LPS誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞比較，扶正化瘀方能顯著抑制M1型巨噬細(xì)胞中NO的生成，且呈明顯劑量依賴性;同時(shí)，扶正化瘀方在濃度為200?μg/mL時(shí)顯著抑制NO關(guān)鍵合成酶iNOS的基因表達(dá)，而對(duì)IL-6、TNF-α基因表達(dá)無影響。

Toll樣受體（TLR）參與機(jī)體防御入侵病原體的第一線，在炎癥、免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)生存和增殖中具有重要作用。TLR4受LPS刺激活化后觸發(fā)下游的MAPK信號(hào)通路，對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)iNOS基因的過表達(dá)具有關(guān)鍵調(diào)控作用[14]。MAPK由一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶組成，在被細(xì)胞外各種刺激活化后介導(dǎo)從細(xì)胞表面到核內(nèi)的信號(hào)傳遞。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)有3條已被明確定義的MAPK信號(hào)通路：JNK、ERK、p38。LPS和其他促炎因子能誘導(dǎo)MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白磷酸化并進(jìn)入核內(nèi)，觸發(fā)核內(nèi)iNOS基因表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，LPS能顯著促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞中JNK、ERK、p38蛋白的磷酸化，促進(jìn)iNOS基因和蛋白表達(dá)以及NO產(chǎn)生;而扶正化瘀方對(duì)ERK、p38蛋白的磷酸化調(diào)節(jié)與LPS組比較無明顯差異，但其能顯著抑制JNK蛋白的磷酸化。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，JNK蛋白表達(dá)被抑制后，細(xì)胞中iNOS蛋白表達(dá)及NO產(chǎn)生均被顯著抑制。上述結(jié)果表明，MAPK信號(hào)通路中的JNK蛋白可能是扶正化瘀方抑制巨噬細(xì)胞M1型炎性極化的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

綜上所述，扶正化瘀方可通過抑制MAPK信號(hào)通路中JNK蛋白磷酸化減少巨噬細(xì)胞iNOS基因及蛋白過表達(dá)及NO過量生成，從而抑制巨噬細(xì)胞M1型炎性極化發(fā)揮其抗炎作用，這可能是扶正化瘀方抗炎、抗肝纖維化的分子機(jī)制之一。

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（收稿日期：2019-09-23）

（修回日期：2019-10-11;編輯：華強(qiáng)）